类风湿性关节炎中氧化应激与免疫浸润的生物信息学分析

Bioinformatics analysis of oxidative stress and immune infiltration in rheumatoid arthritis

摘要

目的 探索类风湿关节炎中氧化应激和免疫浸润的作用。 方法 从GEO数据库中获取类风湿关节炎数据集GSE55235（10例类风湿关节炎样本和10例健康对照样本）和GSE55457（13例类风湿关节炎样本和10例健康对照样本），将两个数据集作为实验数据集进行合并，使用R语言获取类风湿关节炎样本和正常关节样本的差异表达基因，并与氧化应激相关基因取交集得到差异表达氧化应激基因。对差异表达氧化应激基因进行KEGG和GO富集分析，利用GSEA方法评估与类风湿关节炎相关的通路和生物过程。使用STRING在线平台和Cytoscape软件构建蛋白质相互作用网络，使用Cytoscape软件中的Degree算法计算出前10名关键基因。从GEO数据库中获取到数据集GSE1919作为验证数据集，对计算出的前十名关键基因进行验证及ROC曲线分析，得到核心基因。利用CIBERSORT来评估免疫细胞的浸润情况，使用qRT-PCR验证得到的结果的准确性。 结果 得到了89个差异表达氧化应激基因；富集分析结果显示，差异表达氧化应激基因的主要聚焦点包括氧化应激、化学应激的反应、对活性氧的反应和脂多糖反应等生物学过程；得到了5个核心基因（STAT1、MMP9、MYC、CCL5、JUN），5个核心基因的ROC曲线下面积都大于0.7，其对类风湿关节炎的预测具有良好的敏感性和特异性；核心基因与免疫细胞密切相关，且大多与T细胞相关；qRT-PCR结果显示，5个核心基因在类风湿关节炎样本和正常关节样本中的表达存在显著差异（P<0.05）。 结论 类风湿关节炎中存在氧化应激与免疫反应过程，且免疫反应参与激活氧化应激，核心基因及可作为诊断类风湿关节炎的新型标志物。

Abstract

Objective To explore the role of oxidative stress and immune infiltration in rheumatoid arthritis (RA). Methods RA datasets GSE55235 (10 RA vs 10 normal samples) and GSE55457 (13 RA vs 10 normal samples) from the GEO database were merged as the test set to identify the differentially expressed genes (DEGs) in RA using R. The DEGs were intersected with oxidative stress-related genes to obtain oxidative stress-associated DEGs. KEGG and GO enrichment analyses of the DEGs were performed, and the RA-related pathways and biological processes were analyzed using GSEA. A protein-protein interaction (PPI) network was constructed using STRING and Cytoscape, and the top 10 key genes were obtained using the Degree algorithm. The validation dataset GSE1919 from GEO database was used for ROC analysis of the key genes to obtain the core genes, and their correlations with infiltrating immune cells were analyzed using CIBERSORT. The results were verified by RT-qPCR for detecting expression levels of the core genes in RA and normal joint samples. Results We identified 89 oxidative stress-associated DEGs. Enrichment analysis suggested that these DEGs were involved in the biological processes including oxidative stress, chemical stress response, reactive oxygen species response, and lipopolysaccharide response. ROC analysis showed that the 5 core genes (STAT1, MMP9, MYC, CCL5, and JUN) all had AUC values >0.7, indicating their high diagnostic sensitivity and specificity for RA. These genes were closely correlated with immune cells, particularly T cells. RT-qPCR confirmed significant differential expressions of the core genes between RA and normal samples. Conclusion Oxidative stress and diverse immune responses are features of RA, and the immune responses contribute to activation of oxidative stress. The identified core genes can potential serve as new diagnostic markers for RA.

Graphical abstract

关键词

类风湿关节炎 / 氧化应激 / 免疫浸润 / 生物标志物 / 生物信息学

Key words

rheumatoid arthritis / oxidative stress / immune infiltration / biomarkers / bioinformatics

类风湿关节炎（RA）是一种长期慢性炎症性疾病^［1］，其致残率较高，以滑膜炎症，软骨破坏和关节畸形为特征^［2］。类风湿关节炎的疾病机制多与免疫有关^［3］，其发病机制复杂，目前尚不完全清楚。针对类风湿关节炎的主要治疗方法是对症治疗，以控制病情、减少关节损伤和提高生活质量为主^［4］，亦缺乏有效的生物标志物来进行早期诊断和改变疾病临床进展轨迹。

氧化应激（OS）被定义为体内氧化和抗氧化的不平衡状态^［5］，这种状态有利于氧化作用，导致细胞功能障碍和组织损伤。近年来，类风湿关节炎与氧化应激的关联得到越来越多学者的认可^［6-8］，当体内氧化作用较强时，活性氧（ROS）和活性氮（RNS）等具有氧化活性的自由基物质增加。ROS可以直接造成软骨降解，其作用机制包括裂解胶原蛋白、聚集聚糖以及激活基质金属蛋白酶（MMPs）^{［9， 10］}，RNS通过一氧化氮合酶（NOS）产生自由基一氧化氮（NO）^［11］，而NO和免疫、炎症和关节炎有关，炎症组织中涉及到NO的产生^［8］，这两种物质都可以加重类风湿关节炎。同时，类风湿关节炎中的炎症亦可以加重OS状态^［12］，RA患者表现出ROS形成显著增加，导致氧化应激^［13］。因此，类风湿关节炎与氧化应激密切相关。

目前，对于类风湿关节炎的研究多集中于免疫领域^［14］，对氧化应激领域研究较少，遂本研究运用生物信息学和qRT-PCR方法，探究了氧化应激在类风湿关节炎发病机制中的作用，筛选出了与氧化应激相关的基因差异表达情况，进一步验证识别出可作为类风湿关节炎诊断标志的核心基因，并对核心基因与免疫细胞的相关性进行了分析，为类风湿关节炎的防治提供强有力的证据。

1 资料和方法

1.1 GEO数据的提取和处理

使用基因表达综合数据库（GEO，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）进行查询，收集类风湿关节炎表达谱数据集，包括GSE55235、GSE55457和GSE1919。GSE55235包含10例类风湿关节炎样本和10例健康组织样本，GSE55457包含13例类风湿关节炎样本和10例健康组织样本，GSE1919包含5例类风湿关节炎样本和5例健康组织样本，样本均来源于关节滑膜组织。将GSE55235和GSE55457合并作为实验数据集，GSE1919作为验证数据集。使用R软件（版本4.4.0）中“limma”包筛选出实验数据集的差异表达基因，筛选条件为P<0.05和|log2 fold change（log2FC）|>1.0，并绘制热图和火山图以展现基因的差异表达情况。

1.2 差异表达氧化应激基因的获取

在GeneCards数据库中下载氧化应激相关基因，设置Relevance score≥7^［15］，并与差异基因取交集，得到差异表达氧化应激基因（DEOSGs）。

1.3 富集分析

使用R软件“clusterProfiler”和“pathview”包对DEOSGs进行GO、KEGG富集分析。另外，在基因按照logFC从大到小排列的基础上，利用MSigDB数据库（https：//www.gsea-msigdb.org/）获取C2和C5基因集进行基因组富集分析 （GSEA）^［16］。采用R语言中的“clusterProfiler”包进行数据分析，并借助“enrichplot”包对分析结果进行可视化。

1.4 蛋白互作网络的构建及关键基因的筛选

将DEOSGs导入STRING在线数据库（https：//string-db.org/）构建蛋白互作网络，利用Cytoscape软件（版本：3.10.1）进行可视化，使用CytoHubba插件运行Degree算法得到前10名关键基因，并使用MCODE插件计算出最高得分模块。

1.5 核心基因的筛选

使用GSE1919数据集对关键基因进行验证，对关键基因进行差异分析，P<0.05被认为差异有统计学意义，得到核心基因。并使用ROC曲线验证核心基因，其AUC（ROC曲线下面积）越大代表其预测疾病越精准。

1.6 免疫浸润分析

CIBERSORT包含多种生物标志物和22种人类免疫细胞，包括T细胞、B细胞和髓系细胞等^［17］，对实验数据集23例类风湿关节炎样本和20例健康组织样本使用CIBERSORT免疫浸润进行分析。比较两组之间免疫细胞占比的差异情况。

1.7 核心基因与免疫细胞的相关性分析

使用R软件中“dplyr”包对核心基因与具有差异的免疫细胞的相关性进行分析，“ggplot2”包进行可视化，统计学方法采用Spearman法。

1.8 使用qRT-PCR验证核心基因的表达

本研究使用的类风湿关节炎样本和正常关节样本各5例由胡仲翔教授友情提供。骨组织在完全磨碎之前，在液氮中迅速冷冻。然后，加入TRIzol试剂（Life technogies）从组织和细胞中提取总RNA。使用RNA逆转录试剂盒（TakaRa）合成cDNA。引物由上海生工生物工程有限公司合成（表1）。根据制造商的说明，将SYBR Green预混液（novoprotein）与引物、样品和PCR缓冲液混合，然后分配到PCR反应板中，放入荧光定量PCR仪（Thermo Scientific）中，然后设置合适的PCR程序并运行，分析荧光数据，确定PCR结果。本次实验所使用的分析方法为：Relative Quantification Study，计算方法为2^-△△Ct。

1.9 统计学方法

数据采用GraphPad Prism9.5.1进行分析，测量数据以均数±标准差表示。多组间比较采用单因素方差分析和Tukey事后检验。两组间比较采用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 差异表达基因和差异表达氧化应激基因获取

使用R软件“limma”包对GSE55235和GSE55457去除批次效应，共得到668个差异表达基因，其中387个基因上调，281个基因下调，并用火山图及热图对基因的差异情况进行可视化（图1A，B）。此外，将差异表达基因与之前筛选的氧化应激基因取交集，得到89个DEOSGs（图1C），其中37个基因上调，52个基因下调。

2.2 富集分析结果

对DEOSGs进行KEGG和GO富集分析（图2），DEOSGs主要集中在IL-17信号通路、破骨细胞分化、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路和TNF信号通路等通路。为了进一步探究DEOSGs的生物学功能，对其进行了GSEA富集分析（图3），基因大多数富集于免疫相关通路。

2.3 PPI网络的构建与关键基因的筛选

对DEOSGs进行蛋白互作分析，使用Cytoscape软件进行可视化（图4A），该网络由85个点，695条边组成。使用CytoHubba插件对基因Degree值进行计算，选择Degree值前十名的基因（图4B），分别为JUN、MYC、STAT1、LEP、MMP9、CCL5、PTGS2、IL6、FOS和CXCR4，并使用MCODE插件进行分析，选取第一模块（得分：13.778），该模块由28个点和186条边组成（图4C），其中STAT1、LEP、CCL5、PTGS2和CXCR4都位于模块中心。

2.4 核心基因的确定

使用GSE1919验证数据集对十名关键基因进行验证（图5），结果显示，JUN、MYC、STAT1、MMP9和CCL5的表达量差异有统计学意义（P<0.05）。进一步使用实验数据集对其进行ROC曲线分析（图6），结果显示，MYC、STAT1、JUN和CCL5的AUC值都大于0.85，而MMP9的AUC值也大于0.7，其对疾病预测的精准度高，综合确定了这5个基因为核心基因。

2.5 免疫浸润分析

使用CIBERSORT对实验数据集进行免疫浸润分析展示每个样本中22种免疫细胞的比例，采用柱状图形式呈现（图7）。免疫细胞箱线图（图8）显示，类风湿关节炎中初始B细胞、巨噬细胞M1、浆细胞、活化记忆CD4 T细胞、CD8 T细胞和辅助 T细胞的数量相对较高，而对照组中活化肥大细胞、单核细胞、活化NK细胞和静息记忆CD4 T细胞的数量相对较高（P<0.01）。

2.6 核心基因与免疫细胞的相关性

STAT1与巨噬细胞M1、浆细胞、活化记忆CD4 T细胞和CD8 T细胞呈显著的正相关，与活化肥大细胞和静息记忆CD4 T细胞呈负相关；MYC与活化肥大细胞、活化NK细胞、静息记忆CD4 T细胞呈显著的正相关，与浆细胞和CD8 T细胞呈显著的负相关；MMP9与初始B细胞和活化记忆CD4 T细胞呈显著的正相关，与活化NK细胞和静息记忆CD4 T细胞呈负相关；JUN与活化肥大细胞、活化NK细胞和静息记忆CD4 T细胞呈显著正相关，与浆细胞和CD8 T细胞呈负相关；CCL5与初始B细胞、巨噬细胞M1、活化记忆CD4 T细胞、浆细胞和CD8 T细胞呈正相关，与活化肥大细胞、活化NK细胞、单核细胞和静息记忆CD4 T细胞呈负相关（图9，P<0.05）。

2.7 核心基因的qRT-PCR结果

使用qRT-PCR对类风湿关节炎样本和正常关节样检测结果显示（图10），5个核心基因在类风湿关节炎组和正常关节组中具有显著差异，并且JUN和MYC在类风湿关节炎组中的表达量下调，MMP9、STAT1和CCL5在类风湿关节炎组中的表达量上调。

3 讨论

类风湿关节炎是一种自身免疫性疾病，其特点是滑膜炎症和关节破坏^［18］，致残率高^［19］。目前针对类风湿关节炎的治疗主要是非甾体类抗炎药、糖皮质激素和抗风湿药物^［20］，但这些只能缓解疾病症状和进展，因此需要寻找新的作用机制来进行临床治疗。

本研究使用生物信息学对类风湿关节炎样本和对照样本进行分析，得到了89个差异表达氧化应激基因，对其进行KEGG、GO富集分析，发现其主要富集在IL-17信号通路、破骨细胞分化、TNF信号通路、氧化应激反应和活性氧反应等。氧化应激是体内氧化还原失调，造成大量自由基堆积，活性氧和活性氮产生增加，从而破坏生物大分子（如脂质和蛋白质）造成细胞凋亡，进而引起组织损伤。活性氧在细胞信号传导中扮演着重要角色，它调节着软骨细胞的衰老和凋亡、细胞外基质（ECM）的合成和分解、滑膜炎症以及骨组织代谢异常，而过量的活性氧会诱导基质降解，造成骨代谢异常，进一步导致软骨损伤。类风湿关节炎的关节滑膜中含有大量的巨噬细胞和T细胞，巨噬细胞和T细胞会释放肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1，他们可以产生大量的ROS，加重滑膜炎症^{［21， 22］}，诱导组织受损，使机体处于氧化应激状态，而氧化应激产生大量的ROS，ROS可通过激活转录因子来调节促炎因子的生成，如核因子κB，核因子κB的升高会促进肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1的生成，促进类风湿性关节炎的发展。因此，类风湿关节炎中炎症与氧化应激密切相关。

白细胞介素17（IL-17）在调节宿主免疫防御、促进组织修复以及影响免疫疾病的发展过程中扮演着关键的角色，参与多种免疫性疾病和炎性疾病的发病过程^［23］。先前学者的研究表明，RA患者的滑膜液中IL-17的浓度较高^［24］，并且RA滑膜可以自行分泌IL-17^［25］，IL-17引起滑膜炎症，炎症会导致软骨中线粒体的功能异常，而线粒体功能异常会导致活性氧产生增加^［26］，激活氧化应激过程。此外，IL-17还对关节破坏有直接贡献，先前的研究^［27］表明，IL-17使关节滑膜细胞产生的基质金属蛋白酶 -1（MMP-1）增加了五倍，在存在抗IL-17抗体的情况下，使RA滑膜产生的MMP-1和胶原酶活性降低了50%，与上清液中的I型胶原C端肽片段（CTX）减少50%相同。这表明IL-17可以直接破坏关节。因此，IL-17在类风湿性关节炎中起着重要的致病作用。

本研究得到5个核心基因（MMP9、MYC、STAT1、CCL5和JUN），在GSE1919数据集中分析发现JUN和MYC在类风湿关节炎中高表达，MMP9、STAT1和CCL5在类风湿关节炎中低表达，通过qRT-PCR进一步验证了这个结果的准确性。基质金属蛋白酶 -9（MMP9）是一种能降解细胞外基质的蛋白酶，MMP9可以由滑膜、成纤维细胞、中性粒细胞和平滑肌细胞合成并分泌，RA患者血清中的MMP9明显高于对照组^［28］。MMP9与骨破坏成正相关^［29］，可以增强炎症细胞的侵袭力，在RA早期更能反映类风湿关节炎的炎症水平。MYC是一种可以影响破骨细胞形成的转录因子^［30］，Van Raemdonck等^［31］的研究表明，与非关节炎小鼠相比，类风湿关节炎小鼠中IL-34增加了酵解转录因子MYC的表达，随后增加氧化磷酸化，加速骨侵蚀^［32］。抑制MYC基因可以促进细胞增殖，同时还能有效的抑制基质金属蛋白酶、白细胞介素和肿瘤坏死因子的表达^［33］。STAT1是调控巨噬细胞M1极化的重要信号蛋白之一，可以增强巨噬细胞M1的促炎作用并进一步损伤软骨加重类风湿关节炎。CCL5是一种趋化细胞因子，通过与其受体结合，可作为单核细胞系的趋化因子参与免疫反应，而单核巨噬细胞系的持续激活是RA的病理机制之一。先前的研究表明^［34］，在RA滑膜细胞中，在mRNA和蛋白质水平上检测到CCL5的高表达，这与本研究得到CCL5在RA中上调的结果一致。JUN可以通过增加凋亡因子和凋亡蛋白来促使软骨细胞凋亡^{［35， 36］}，促进类风湿关节炎的发生发展。

使用CIBERSORT算法对样本中的免疫细胞进行评估，结果表明，类风湿关节炎滑膜中的免疫细胞主要包括初始B细胞、浆细胞、T细胞和巨噬细胞M1，他们构成了免疫细胞的主要部分。在RA中，首先通过趋化细胞因子将B细胞募集到滑膜，B细胞的活化维持在关节的异位生发中心中^［37］，关节滑膜中的B细胞增加与T细胞的活化有关^［38］，在关节炎早期，B细胞通过激活T细胞来触发或加重疾病，随着疾病的进展，B细胞在T细胞激活中起着越来越重要的作用^［39］，先前的研究表明^［40］，在蛋白多糖诱导的关节炎小鼠实验中，没有特异性B细胞的情况下，小数的T细胞不会被激活，关节炎最终不会发生。表明了B细胞和T细胞在关节炎中的重要作用。其中，B细胞转变为浆细胞和浆母细胞^［39］，产生抗瓜氨酸化蛋白抗体（ACPA）、类风湿因子（RF）和免疫补体，从而促进自身免疫反应。在RA中的炎症细胞因子的刺激下，T细胞分化为Th1和Th17细胞并释放大量炎症因子，Th1和Th17触发巨噬细胞和滑膜成纤维细胞的免疫反应。巨噬细胞会放大炎症反应，分泌炎症因子，T细胞、破骨细胞和软骨细胞对其作出反应，使炎症环境持续存在。

本研究利用生物信息学结合氧化应激和免疫浸润对类风湿关节炎进行了分析，探究了氧化应激和免疫浸润在类风湿关节炎中的作用，并得到了核心基因，对核心基因与免疫细胞的相关性进行分析，为预防和治疗类风湿关节炎提供了新的研究思路。此外，研究中采集的样本数量有限，为了增强研究的准确性，计划在今后的研究中扩大样本规模，以便为治疗类风湿关节炎奠定更牢固的基础。

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