Circ_EPHB4通过miR-424-5p/Wnt3信号轴调控胶质瘤细胞对替莫唑胺的化疗敏感性

Circ_EPHB4 regulates temozolomide sensitivity in glioma cells through the miR-424-5p/Wnt3 axis

摘要

目的 探讨Circ_EPHB4通过miR-424-5p/Wnt3信号轴调控胶质瘤细胞替莫唑胺敏感性的机制。 方法 收集我院2019年1月~2021年12月25例原发性胶质瘤患者和25例经替莫唑胺（TMZ）基化疗治愈后的复发性胶质瘤患者组织标本。qRT-PCR检测Circ_EPHB4表达敲低及敲低对照组细胞中circ_EPHB4、miR-424-5p及Wnt3 mRNA的表达水平。Western blotting检测Wnt3蛋白表达水平。细胞活力、克隆形成和细胞凋亡分别通过CCK-8、克隆形成和流式细胞仪检测评估。采用双荧光素酶报告和RNA免疫沉淀（RIP）试验验证circ_EPHB4、miR-424-5p和Wnt3间的靶向调控关系。皮下成瘤实验评估circ_EPHB4对胶质瘤肿瘤形成能力的影响。 结果 胶质瘤组织和细胞中circ EPHB4的表达明显高于正常神经组织和星形胶质细胞（P=0.014）。与si-NC对照组相比，si-Circ_EPHB4降低了TMZ耐药胶质瘤细胞中circ_EPHB4表达水平（A172：P=0.008；SHG44：P=0.009）。circ_EPHB4表达敲低降低了TMZ耐药胶质瘤细胞对TMZ的IC₅₀值（A172：P=0.012；SHG44：P=0.022），抑制了胶质瘤细胞克隆形成（A172：P=0.004；SHG44：P=0.006），并促进胶质瘤细胞凋亡（A172：P=0.002；SHG44：P=0.00）。胶质瘤组织中miR-424-5p和circ_EPHB4表达呈负相关（r=-0.556，P=0.011）。miR-424-5p表达敲低，逆转了circ_EPHB4表达敲低引起的IC₅₀值下降（P=0.001）、克隆形成抑制（P=0.016）和细胞凋亡促进作用（P=0.001）。此外，miR-424-5p表达敲低，还削弱了circ_EPHB4表达敲低对PCNA、P-gp、MRP1和bax表达的影响（P=0.004）。 结论 circ_EPHB4通过“海绵吸附”miR-424-5p调控Wnt3表达，由此调节TMZ耐药胶质瘤细胞克隆形成、细胞凋亡和TMZ敏感性，circ_EPHB4是逆转胶质瘤耐药的潜在靶点。

Abstract

Objective To investigate the mechanism by which circ_EPHB4 regulates temozolomide (TMZ) sensitivity of glioma cells through the miR-424-5p/Wnt3 signal axis. Methods We detected the expression levels of circ_EPHB4, miR-424-5p and Wnt3 mRNA in glioma specimens from 25 patients with primary glioma and 25 patients experiencing relapse following temozolomide-based chemotherapy and in TMZ-sensitive and -resistant glioma A172 and SHG44 cells with circ_EPHB4 knockdown using qRT-PCR, and Wnt3 protein expression level was detected with Western blotting. Cell viability, colony-forming ability, and apoptosis of the cells with circ_EPHB4 knockdown were assessed, and the targeted regulation relationship between circ_EPHB4, miR-424-5p, and Wnt3 was verified by dual luciferase reporter assay and RNA immunoprecipitation (RIP) experiments. The effect of circ_EPHB4 knockdown on tumorigenesis of glioma cells was evaluated in subcutaneous tumor-bearing nude mouse models. Results The expression of circ_EPHB4 was significantly increased in glioma tissues and cells as compared with normal neural tissues and astrocytes (P=0.014). In TMZ-resistant glioma cells, circ_EPHB4 knockdown resulted in an obvious reduction of IC50 value of TMZ, inhibited cell colony formation, and promoted cell apoptosis, and these effects were reversed by miR-424-5p knockdown. The expressions of miR-424-5p and circ_EPHB4 were negatively correlated in glioma tissues (P=0.011). MiR-424-5p knockdown also attenuated the effect of circ_EPHB4 knockdown on expressions of PCNA, P-gp, MRP1 and bax. Conclusion Circ_EPHB4 regulates Wnt3 expression through "sponge adsorption" of miR-424-5p, thereby modulating TMZ-resistant glioblastoma cell clonogenesis, apoptosis, and TMZ sensitivity, suggesting the potential of circ_EPHB4 as a therapeutic target for reversing drug resistance of gliomas.

Graphical abstract

关键词

胶质瘤 / 化疗抵抗 / circ_EPHB4 / miR-424-5p / Wnt3

Key words

glioma / chemoresistance / circ_EPHB4 / miR-424-5p / Wnt3

胶质瘤是全世界癌症发病和死亡的重要原因，包括替莫唑胺（TMZ）在内的化疗药物已广泛用于胶质瘤治疗^{［1， 2］}。^{但耐药严重影响TMZ的疗效［3， 4］，因此，了解胶质瘤化疗耐药的分子机制具有重要的意义。}

CircRNA是一类具有共价闭环结构的非编码RNA，在哺乳动物中广泛存在^{［5， 6］}。Deng等^［7］研究表明，circ_0005189通过调控miR-198/Trim14增强胶质瘤细胞对TMZ的耐药性。课题组前期研究发现circ EPHB4能够通过“吸附”miR-637，上调SOX10表达，增强胶质瘤细胞的肿瘤干性，而细胞干性和肿瘤耐药性密切相关^［8］。因此，circ EPHB4是胶质瘤细胞耐药的潜在影响因素。微小核糖核酸（miRNAs）在胶质瘤发生发展过程中发挥重要作用^{［9， 10］}。Yan等^［11］研究发现LncRNA PVT1通过抑制miR-424-5p表达促进胶质瘤进展，提示miR-424在胶质瘤中发挥抑癌作用。但是miR-424-5p在胶质瘤化疗抗性中的作用机制尚不清楚。此外，miR-424-5p是否能作为circ_EPHB4功能的下游效应器在胶质瘤化疗抗性发展中起作用仍不清楚。本研究主要探讨circ_EPHB4通过miR-424-5p对胶质瘤替莫唑胺抗性的影响，以期为明确胶质瘤耐药机制提供新参考。

1 资料和方法

1.1 实验材料

SHG44、A172、HEB、293 T细胞（中南大学湘雅细胞生物中心）；胎牛血清、RPMI 1640培养基培养、聚乙二醇、嘌呤霉素（生工生物）；Trizol试剂、cDNA合成试剂盒、miScript SYBRGreen PCR Kit 试剂盒（Takara）；结晶紫、CCK-8试剂盒、Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit（索莱宝）。 BCA 蛋白检测试剂、SDS-PAGE胶、PVDF 膜、TBST 缓冲液（碧云天）；BALB/c裸鼠（湖南斯莱克景达实验动物有限责任公司）；PCNA、MRP1、Bax、P-gp、Wnt3、GAPDH、anti-Ago2、IgG抗体（Abcam）；携带circ_EPHB4特异性shRNA、shRNA对照的慢病毒、Wnt3过表达质粒及对照质粒、circ_EPHB4-siRNA及对照siRNA、miR-424-5p抑制剂或阴性对照抑制剂、miR-424-5p模拟物及模拟物对照、双荧光素酶报告载体（吉玛生物）；GeneArtTM 定点诱变系统及Lipofectamine 3000（Invitrogen）。

1.2 实验方法

1.2.1 研究对象

纳入2019年1月~2021年12月我院25例原发性胶质瘤患者和25例经TMZ基化疗治愈后的复发性胶质瘤患者。在以TMZ为基础的化疗过程中，每2周进行1次疗效评估。治疗后按照每3个月记录1次随访信息。根据实体瘤反应评价标准（RECIST 1.1），当病灶直径之和比初始基线增加20%或病灶直径之和增加5 mm以上时，确定为复发性胶质瘤。研究样本由80例组织样本组成，包括25例原发性胶质瘤组织（敏感）、25例复发性胶质瘤组织（耐药）和30例健康脑组织（正常，来自同期我院收治的脑外伤患者）。术中收集标本后，浸泡在RNA提取缓冲液溶液中，随后在-80 ℃下保存。所有受试者均签署书面知情同意书，本研究经中南大学湘雅医院伦理委员会批准（伦理批号：2019020048）。

1.2.2 细胞培养

SHG44和A172 胶质瘤细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养。人脑星形胶质细胞 HEB作为非肿瘤细胞的对照。293 T细胞用于双荧光素酶报告实验。用TMZ（浓度从20 ng/L开始，逐渐增加到10 μg/L）处理A172和SHG44细胞9个月以上，直到A172和SHG44细胞在TMZ存在下能够以没有药物的亲代细胞的生长速度生长。为保持抗性表型，在细胞培养基中加入10 mg/L的TMZ。

1.2.3 慢病毒转导和细胞瞬时转染

携带circ_EPHB4特异性shRNA的慢病毒颗粒用于敲低circ_EPHB4表达，shRNA慢病毒（sh-NC）作为阴性对照。为了建立稳定的circ_EPHB4敲低细胞系，在8 mg/mL的聚乙二醇溶液中，将A172/TMZ细胞与病毒上清液孵化8 h。用2 μg/mL的嘌呤霉素选择转导阳性的细胞72 h。瞬时转染采用Lipofectamine 3000。分别将Wnt3过表达质粒（OE-Wnt3）、空白载体、circ_EPHB4-siRNA（si-circ）或空白siRNA（si-NC），miR-424-5p抑制剂或阴性对照抑制剂（抑制剂NC），miR-424-5p模拟物（miR-424-5p模拟物）或模拟物对照（模拟物NC）转染至A172/TMZ细胞。

1.2.4 定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）

采用Trizol试剂提取细胞总RNA，并测得含量。为检测circ_EPHB4和Wnt3 mRNA表达，使用cDNA合成试剂盒在25 μL的反应中合成500 ng RNA。miR-424-5p的检测使用miScript SYBRGreen PCR Kit 试剂盒进行cDNA合成。所有qRT-PCR反应都在480 II Cycler（罗氏）中进行，使用SYBR Green Master（Fermentas）和特定的引物。结果与参考基因GAPDH或U6表达进行归一化，并通过2^-△△Ct方法计算。circ_EPHB4上游引物：5'-TGA AGCCTCACCGAATCCGCAT-3'；circ_EPHB4下游引物：5'-TGGTCATCTCCT CAGCATTGGC-3'。Wnt3上游引物：5'-CAGCAATAATGGGAACGGGG-3'；Wnt3下游引物：5'-GGTATCTTGTGGTGTCTGCG-3'。miR-424-5p上游引物：5'-TATTGTGAAGGAGGGTTGG-3'；miR-424-5p下游引物：5'-CAGTCTGGATGGCGGT TGT-3'。GAPDH上游引物：5'-AGCCCAAGATGCCC TTCAGT-3'；GAPDH下游引物：5'-CCGTGTTCCT ACCCCCAATG-3'。引物由上海吉玛生物科技有限公司合成。

1.2.5 CCK-8实验

将细胞按10⁵/孔接种至96孔板培养12 h，然后用50、100、200、400、600和800 μg/L的TMZ继续处理24 h，随后弃去旧培基，加入CCK-8反应液10 μL/孔，37 ℃下孵育3 h，然后用M200 Pro微板阅读器读取吸光度A_450nm。利用测得的存活率曲线，确定胶质瘤细胞对TMZ的IC₅₀值。

1.2.6 克隆形成实验

将处理好的各组细胞以150/孔的密度接种至12孔板，37 ℃培养14 d。用1%结晶紫染色后，镜下计数克隆。

1.2.7 流式细胞仪检测细胞凋亡

采用 Annexin V-FITC 和 PI 双染法检测细胞凋亡，按照试剂盒说明书操作。将转染后的各组细胞用胰蛋白酶消化，收集细胞，接种于6孔板中，调整细胞密度为2×10⁶/孔。继续培养24 h后，弃上清，预冷PBS洗2次后用1×Binding buffer 重悬细胞。细胞悬液中加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，充分混匀后室温孵育15 min，1 h内用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.8 蛋白质免疫印迹检测

RIPA充分裂解细胞蛋白后，通过BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度。取50 μg蛋 白 样品进行SDS-PAGE，电泳结束后将蛋白转移到PVDF 膜上。PVDF膜置于TBST缓冲液配制的5%脱脂奶粉中，封闭3 h，结束后将PVDF膜置于TBST稀释的特异性一抗（PCNA稀释比例1∶500、MRP1稀释比例1∶800、Bax稀释比例1∶1000、P-gp稀释比例1∶500、Wnt3稀释比例1∶1000）中，4 ℃下过夜，TBST缓冲液中清洗5 次，5 min/次，PVDF 膜置于TBST稀释的二抗（稀释比例1∶1000）中，室温下2 h，PVDF 膜滴加ECL反应液进行蛋白曝光。使用ImageJ 软件分析蛋白的灰度值，蛋白相对表达量=所测蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

1.2.9 双荧光素酶报告器测定

circ_EPHB4的靶向miRNA是由靶向预测网circinteractome预测。miR-424-5p的分子靶点是通过starBase v.3在线数据库进行搜索。将含有miR-424-5p野生型靶点序列和Wnt3 3'UTR序列的circ_EPHB4片段分别插入pmirGLO载体中。使用GeneArt^TM 定点诱变系统产生目标位点的突变。用100 ng指定的报告构建体和50 nmol/L的模拟NC或miR-424-5p模拟物共转染至70%汇合的293 T细胞。转染48 h后，用双荧光素酶检测系统测量荧光素酶活性。

1.2.10 RNA免疫沉淀（RIP）实验

使用抗精氨酸2（anti-Ago2， ab252812）和抗IgG（ab109489）抗体进行检测。将细胞裂解液与蛋白-G磁珠耦合的抗Ago2或IgG抗体在4 ℃下孵育6 h。收获磁珠，分离出结合的RNA以测量circ_EPHB4和miR-424-5p的富集水平。

1.2.11 动物实验

动物实验经中南大学湘雅医院动物伦理委员会批准（伦理批号：2019020048）24只7周龄左右的BALB/c裸鼠由湖南斯莱克景达实验动物有限责任公司提供。所有裸鼠饲养于SPF级的动物饲养室，实验期间动物房的环境温度为20.8~24.3 ℃，12 h∶12 h照明黑暗交替，所有动物均自由饮食，2~3 d更换垫料。24只7周龄的雌性BALB/c裸鼠分配至4组（n=6）：sh-NC+PBS（NS）、sh-circ+PBS（NS）、sh-NC+TMZ或sh-circ+TMZ。通过将si-NC转染的或circ_EPHB4感染的A172/TMZ细胞（6×10⁶/只）接种至裸鼠右腹，建立皮下异种移植模型。当异种移植肿瘤体积达到约100 mm³，通过尾静脉注射TMZ（5 mg/kg）或PBS（NS），3 d/次注射。3 d/次测量肿瘤体积（mm³），计算方法如下：长（L）×宽（W）²×0.5。接种22 d后，处死小鼠，并分离异种移植肿瘤，进行质量和表达分析。

1.3 统计学分析

采用SPSS 25.0统计软件分析。所有计量资料均采用均数±标准差表示。多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Circ EPHB4高表达与胶质瘤TMZ耐药相关

qRT-PCR检测结果显示，原发性胶质瘤组织（敏感）和复发性胶质瘤组织（耐药）中circ EPHB4的表达明显高于健康脑组织（P<0.001，图1A）， 而复发性胶质瘤组织（耐药）中circ EPHB4的表达明显又高于原发性胶质瘤组织（敏感）组，差异有统计学意义（P<0.001，图1A）。本研究成功构建了胶质瘤替莫唑胺耐药细胞株A172/TMZ和SHG44/TMZ，耐药细胞株中circ EPHB4表达也高于相应亲本细胞（P<0.001，图1B），此外胶质瘤细胞株A172和SHG44细胞circ EPHB4表达高于正常星形胶质细胞HBE（P<0.01，图1B）。此外，circ_EPHB4的表达与肿瘤直径（P=0.009）和术前KPS评分有关（P=0.008，表1）。

2.2 Circ_EPHB4表达敲低抑制细胞克隆形成，促进A172/TMZ和SHG44/TMZ细胞体外凋亡和TMZ敏感性

qRT-PCR结果显示，与si-NC对照组相比，si-Circ_EPHB4降低了TMZ耐药胶质瘤细胞中circ_EPHB4表达水平（A172：P=0.008；SHG44：P=0.009，图2A）。而circ_EPHB4表达敲低降低了TMZ耐药胶质瘤细胞对TMZ的IC₅₀值（A172：P=0.012；SHG44：P=0.022，图2B）。此外，circ_EPHB4表达敲低抑制了胶质瘤细胞克隆形成（A172：P=0.004；SHG44：P=0.006，图2C），并促进胶质瘤细胞凋亡（A172：P=0.002；SHG44：P=0.005，图2D）。circ_EPHB4表达敲低还使TMZ耐药胶质瘤细胞PCNA（A172：P=0.018；SHG44：P=0.025）、MRP1（A172：P=0.022；SHG44：P=0.021）和P-gp（A172：P=0.021；SHG44：P=0.033）表达下降，而促进促凋亡蛋白Bax（A172：P=0.024；SHG44：P=0.018）表达（图2E）。

2.3 Circ_EPHB4与miR-424-5p的相互作用

qRT-PCR检测结果表明，miR-424-5p在胶质瘤组织和细胞表达明显降低，此外，miR-424-5p在耐药细胞株中的表达明显低于相应亲本细胞（P=0.024，图3A、B）。胶质瘤组织中miR-424-5p和circ_EPHB4表达呈负相关（P=0.011，图3C）。miR-424-5p模拟物转染后，qRT-PCR检测显示，细胞中miR-424-5p表达明显升高（P=0.004，图3D）。Starbase 2.0数据库预测表明，circRNA EPHB4可以靶向结合miR-424-5p（图3E）。RIP实验显示，在RNA诱导沉默复合物（RISC）中，抗Ago2抗体同步提高miR-424-5p和circ_EPHB4的富集水平（P=0.008，图3F、G）。将携带miR-424-5p结合位点的circ_EPHB4片段克隆至荧光素酶载体，然后将报告构建体（circ_EPHB4 wt）和miR-424-5p mimic共转染到293 T细胞中，293 T细胞产生的荧光素酶活性低于共转染mimic NC对照细胞，但种子区定点突变（circ_EPHB4 mut）抵消了miR-424-5p过表达的抑制作用（P<0.01，图3H）。

2.4 MiR-424-5p是Circ_EPHB4体外调控细胞克隆形成、细胞凋亡和TMZ敏感性的介导分子

转染miR-424-5p inhibitors后，si-Circ_EPHB4细胞中miR-424-5p表达下调（P=0.002，图4A）。miR-424-5p表达敲低，逆转了circ_EPHB4表达敲低引起的IC₅₀值下降（P=0.001，图4B）、克隆形成抑制（P=0.016，图4C）和细胞凋亡促进作用（P=0.001，图4D）。此外，miR-424-5p表达敲低，还削弱了circ_EPHB4表达敲低对PCNA、P-gp、MRP1和bax表达的影响（P=0.004，图4E）。

2.5 MiR-424-5p直接与Wnt3的3'UTR相互作用

qRT-PCR和Western blotting的结果显示，Wnt3在胶质瘤组织和细胞中表达明显增强。敏感胶质瘤细胞相比，TMZ耐药胶质瘤细胞中Wnt3表达上调（P=0.006，图5A~D）。此外，胶质瘤组织中Wnt3 mRNA与miR-424-5p表达呈负相关（P=0.011，图5E）。starBase v.3在线数据库分析显示Wnt3的3'UTR包含miR-424-5p靶点序列（图5F）。荧光素梅报告实验表明，野生型荧光素酶报告（Wnt3 3'UTR wt）在miR-424-5p模拟物存在下导致荧光素酶活性明显下降（P=0.016，图5G）。当目标序列发生突变时（Wnt3 3'UTR mut），在miR-424-5p模拟物存在下，荧光素酶几乎没有变化（P=0.012，图5G）。

2.6 Wnt3是miR-424-5p在体外调控细胞克隆形成、凋亡和TMZ敏感性的功能靶点

与mimics-NC对照组相比，mimics-miR-424-5p抑制了TMZ耐药胶质瘤细胞Wnt3 mRNA及蛋白表达（P=0.004，图6A~D）。功能分析显示，miR-424-5p过表达量降低了A172/TMZ及SHG44/TZM细胞对TMZ的IC₅₀值（P=0.011，图6E），抑制了细胞克隆形成（图6F），并促进细胞凋亡（图6G）。此外，miR-424-5p过表达还引起PCNA、P-gp和MRP1表达下降，以Bax表达增加（P=0.005，图6H）。将mimics-miR-424-5p和Wnt3过表达质粒（oe-Wnt3）共转染A172/TMZ及SHG44/TZM细胞，oe-Wnt3转染逆转了miR-424-5p过表达引起的Wnt3下调（图6A~D）。此外，Wnt3过表达还逆转了miR-424-5p过表达引起的IC₅₀值降低（图6E）、克隆形成抑制（图6F）和凋亡增强（图6G）。此外，Wnt3表达恢复后逆转了miR-424-5p过表达诱导的PCNA、P-gp、MRP1和Bax水平改变（图6H）。

2.7 Circ_EPHB4通过“海绵”吸附miR-424-5p调控Wnt3表达

与si-NC对照组相比，si-circ_EPHB4表达敲低抑制了TMZ耐药胶质瘤细胞系中Wnt3 mRNA和蛋白表达，而转染miR-424-5p抑制剂能够恢复Wnt3 mRNA和蛋白表达（P<0.01，图7）。

2.8 Circ_EPHB4表达敲低能够抑制肿瘤生长，促进体内TMZ的敏感性

TMZ给药并未影响肿瘤生长，而si-circ_EPHB4转染联合TMZ给药则能明显抑制肿瘤生长（P<0.05，图8A、B）。此外，si-circ_EPHB4转染的A172/TMZ肿瘤中circ_EPHB4和Wnt3表达明显下调，而miR-424-5p表达明显上调（P<0.05，图8C、D）。Western blotting结果显示，si-circ_EPHB4转染的肿瘤组织中，PCNA、P-gp和MRP1的水平下降，Bax表达增加（图8E）。

3 讨论

肿瘤多药耐药是癌症治疗面临的一项重大挑战^{［12， 13］}。胶质瘤作为中枢神经系统最具侵袭性的恶性肿瘤，其化疗耐药性严重制约临床治疗效果。近年来，环状RNA（circRNA）因其高稳定性及功能多样性，在肿瘤耐药调控领域备受关注^［14-16］。本研究揭示了circ_EPHB4通过miR-424-5p/Wnt3信号轴调控胶质瘤TMZ耐药的新机制，为克服胶质瘤化疗抵抗提供了新的理论依据和治疗靶点。

PCNA是一种增殖标志物，能够评估癌细胞生长情况^{［17， 18］}。P-gp和MRP1是ATP结合盒式转运蛋白的2个成员，在癌细胞化疗抗性发展中起着关键作用^{［19， 20］}。本研究发现circ_EPHB4在TMZ耐药胶质瘤组织及细胞系中显著高表达，且其表达水平与肿瘤细胞增殖标志物PCNA、耐药相关蛋白P-gp/MRP1呈正相关。通过构建稳定敲低circ_EPHB4的耐药细胞模型，本研究证实干扰circ_EPHB4表达可显著抑制胶质瘤细胞克隆形成能力、促进凋亡并增强TMZ敏感性。值得注意的是，在体实验进一步证明circ_EPHB4敲低可抑制肿瘤生长并提高荷瘤裸鼠对TMZ的治疗应答。课题组前期研究表明，CircRNA EPHB4能够海绵吸附miR-637，上调干细胞因子SOX10表达，从而增强胶质瘤细胞的肿瘤干性和化疗耐药^［8］。而Lu等^［21］研究表明，circ_0001730（circ_EPHB4）通过调控miR-326/Wnt7B信号轴促进胶质瘤细胞增殖和侵袭。这些发现为circRNA介导的化疗增敏作用提供了直接的活体验证，具有一定的转化医学意义。

在机制层面，miR-424-5p是circ_EPHB4的潜在miRNA作用靶点，circ_EPHB4和miR-424-5p在胶质瘤组织中表达呈负相关。本研究表明，circ_EPHB4直接靶向miR-424-5p。MiR-424-5p参与了多种肿瘤发生发展，如肾细胞癌、宫颈癌和胃癌^［22-24］。Chen等^［25］研究表明，环状 RNA RNF13 作为一种癌基因，通过环状 RNA RNF13/miR-424-5p/TGIF2 竞争性内源 RNA 通路调控乙型肝炎病毒相关肝细胞癌细胞的恶性进展以及乙型肝炎病毒的表达和复制。Wnt3是一种F-肌动蛋白结合蛋白，已被证实与肿瘤侵袭和转移的关联^{［26， 27］}。Wnt3也被发现在胶质瘤^{［28， 29］}和肺癌^{［30， 31］}中异常高表达。此外，本研究还表明Wnt3是miR-424-5p在调控胶质瘤TMZ耐药作用中的重要靶点。Lu等^［32］研究发现，miR-497通过靶向Wnt3抑制胶质瘤的恶性进展。本研究发现circ_EPHB4通过"分子海绵"作用吸附miR-424-5p，进而解除miR-424-5p对Wnt3的抑制作用。双荧光素酶报告和RIP实验验证了三者间的靶向调控关系，构建了"circRNA-miRNA-mRNA"调控轴在胶质瘤耐药中的功能框架。这一发现不仅完善了circRNA竞争性内源RNA（ceRNA）网络在肿瘤微环境中的调控图谱，更揭示了Wnt/β-catenin通路在胶质瘤化疗抵抗中的新角色——既往研究多关注Wnt7B、Wnt5a等家族成员在胶质瘤侵袭转移中的作用^{［21，28］}，而本研究发现Wnt3通过调控耐药相关蛋白表达参与TMZ抵抗，为靶向Wnt信号克服化疗耐药提供了新的切入点。

本研究的临床价值主要体现在：发现circ_EPHB4可作为预测TMZ治疗响应的潜在生物标志物，其表达水平与复发胶质瘤组织的耐药表型高度相关；阐明miR-424-5p/Wnt3轴的调控机制，为开发circRNA靶向药物（如circ_EPHB4反义寡核苷酸）或联合治疗方案（如TMZ与Wnt抑制剂联用）提供理论基础。特别值得关注的是，circRNA相较线性RNA具有更强的核酸酶抗性，这使其在开发稳定型核酸药物方面具有独特优势。

当然，circRNA调控网络的复杂性提示需进一步探索： circ_EPHB4是否通过调控其他miRNA（如前期发现的miR-637^［8］）产生协同效应；不同circRNA（如Chen等报道的circRNF13^［25］）对miR-424-5p的竞争性调控可能形成动态平衡网络； Wnt3下游效应分子与现有耐药通路（如PI3K/AKT、EMT）的交互作用。这些科学问题的解决将推动多靶点联合干预策略的发展。

综上所述，本研究表明circ_EPHB4-miR-424-5p-Wnt3轴在胶质瘤TMZ耐药中的发挥重要作用，不仅为circRNA介导的耐药机制研究提供了新思路，更为逆转胶质瘤化疗抵抗提供了新参考。未来通过开发circ_EPHB4特异性抑制剂或纳米递送系统，有望实现从基础研究到临床转化的突破。

参考文献

[1] 张艺馨, 黄海能. 替莫唑胺二联用药方案治疗胶质瘤的研究进展[J]. 癌症进展, 2023, 21(17): 1873-6, 1962.

[2] Śledzińska P, Bebyn M, Furtak J, et al. Current and promising treatment strategies in glioma[J]. Rev Neurosci, 2022, 34(5): 483-516.

[3] 朱 君, 朱正春, 秦学金, 等. LncRNA MEG3对脑胶质瘤细胞替莫唑胺获得性耐药的影响[J]. 安徽医科大学学报, 2022, 57(10): 1621-6, 1632.

[4] Nakagawa-Saito Y, Mitobe Y, Togashi K, et al. Givinostat inhibition of Sp1-dependent MGMT expression sensitizes glioma stem cells to temozolomide[J]. Anticancer Res, 2023, 43(3): 1131-8.

[5] Kristensen LS, Jakobsen T, Hager H, et al. The emerging roles of circRNAs in cancer and oncology[J]. Nat Rev Clin Oncol, 2022, 19(3): 188-206.

[6] Pisignano G, Michael DC, Visal TH, et al. Going circular: history, present, and future of circRNAs in cancer[J]. Oncogene, 2023, 42(38): 2783-800.

[7] Deng YY, Zhu HW, Xiao L, et al. Circ_0005198 enhances temozolomide resistance of glioma cells through miR-198/TRIM14 axis[J]. Aging, 2020, 13(2): 2198-211.

[8] Jin C, Zhao J, Zhang ZP, et al. CircRNA EPHB4 modulates stem properties and proliferation of gliomas via sponging miR-637 and up-regulating SOX10[J]. Mol Oncol, 2021, 15(2): 596-622.

[9] Guo X, Jiao HX, Cao LL, et al. Biological implications and clinical potential of invasion and migration related miRNAs in glioma[J]. Front Integr Neurosci, 2022, 16: 989029.

[10] Aili Y, Maimaitiming N, Mahemuti Y, et al. The role of exosomal miRNAs in glioma: biological function and clinical application[J]. Front Oncol, 2021, 11: 686369.

[11] Han YJ, Li XX, He F, et al. Knockdown of lncRNA PVT1 inhibits glioma progression by regulating miR-424 expression[J]. Oncol Res, 2019, 27(6): 681-90.

[12] 马 瑶, 李春雨. 塞来昔布抗肿瘤效应及其作用机制的研究进展[J]. 现代药物与临床, 2022, 37(5): 1144-9.

[13] Wei J, Liu Z, He J, et al. Traditional Chinese medicine reverses cancer multidrug resistance and its mechanism[J]. Clin Transl Oncol, 2022, 24(3): 471-82.

[14] Zhao CB, Gao YY, Guo RM, et al. Microarray expression profiles and bioinformatics analysis of mRNAs, lncRNAs, and circRNAs in the secondary temozolomide-resistant glioblastoma[J]. Invest New Drugs, 2020, 38(5): 1227-35.

[15] Mafi A, Hedayati N, Kahkesh S, et al. The landscape of circRNAs in gliomas temozolomide resistance: Insights into molecular pathways[J]. Noncoding RNA Res, 2024, 9(4): 1178-89.

[16] Lan P, Li MH, Wang Y, et al. Y-box protein-1 modulates circSPECC1 to promote glioma tumorigenesis via miR-615-5p/HIP1/AKT axis[J]. Acta Biochim Biophys Sin, 2023, 55(12): 1902-12.

[17] Chieffi P, Nasti M, Fulgione D, et al. Expression of PCNA in the testis of the lizard, Podarcis s. Sicula: an endogenous molecular marker of mitotic germinal epithelium proliferation[J]. Zygote, 2001, 9(4): 317-22.

[18] Miura C, Miura T, Yamashita M. PCNA protein expression during spermatogenesis of the Japanese eel (Anguilla japonica)[J]. Zoolog Sci, 2002, 19(1): 87-91.

[19] Wu CJ, Wangpaichitr M, Feun L, et al. Overcoming cisplatin resistance by mTOR inhibitor in lung cancer[J]. Mol Cancer, 2005, 4(1): 25.

[20] Wang Y, Serfass L, Roy MO, et al. Annexin-I expression modulates drug resistance in tumor cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2004, 314(2): 565-70.

[21] Lu YY, Deng XB, Xiao GH, et al. circ_0001730 promotes proliferation and invasion via the miR-326/Wnt7B axis in glioma cells[J]. Epigenomics, 2019, 11(11): 1335-52.

[22] Richardsen E, Andersen S, Al-Saad S, et al. Low expression of miR-424-3p is highly correlated with clinical failure in prostate cancer[J]. Sci Rep, 2019, 9: 10662.

[23] Zhang Y, Li T, Guo PB, et al. miR-424-5p reversed epithelial-mesenchymal transition of anchorage-independent HCC cells by directly targeting ICAT and suppressed HCC progression[J]. Sci Rep, 2014, 4: 6248.

[24] Jiang BH, Wu DH, Huang L, et al. miR-424-5p inhibited malignant behavior of colorectal cancer cells by targeting CCNE1[J]. Panminerva Med, 2019.

[25] Chen Y, Li SH, Wei YB, et al. Circ-RNF13, as an oncogene, regulates malignant progression of HBV-associated hepatocellular carcinoma cells and HBV expression and replication through circ-RNF13/miR-424-5p/TGIF2 CeRNA pathway[J]. Bosn J Basic Med Sci, 2021, 21(5): 555-68.

[26] Ferrer-Mayorga G, Niell N, Cantero R, et al. Vitamin D and Wnt3A have additive and partially overlapping modulatory effects on gene expression and phenotype in human colon fibroblasts[J]. Sci Rep, 2019, 9(1): 8085.

[27] Eterno V, Zambelli A, Villani L, et al. AurkA controls self-renewal of breast cancer-initiating cells promoting wnt3a stabilization through suppression of miR-128[J]. Sci Rep, 2016, 6: 28436.

[28] Nagy Á, Tompa M, Krabóth Z, et al. Wnt pathway markers in low-grade and high-grade gliomas[J]. Ideggyogy Sz, 2021, 74(9/10): 349-55.

[29] Xu AQ, Yang HP, Gao KJ, et al. Expression profiles and prognostic significance of WNT family members in glioma via bioinformatic analysis[J]. Biosci Rep, 2020, 40(3): BSR20194255.

[30] Xue WT, Cai LH, Li S, et al. WNT ligands in non-small cell lung cancer: from pathogenesis to clinical practice[J]. Discov Oncol, 2023, 14(1): 136.

[31] Wang JL, Yang QP, Tang MJ, et al. Validation and analysis of expression, prognosis and immune infiltration of WNT gene family in non-small cell lung cancer[J]. Front Oncol, 2022, 12: 911316.

[32] Lu F, Ye Y, Zhang H, et al. miR-497/Wnt3a/c-Jun feedback loop regulates growth and epithelial-to-mesenchymal transition phenotype in glioma cells[J]. Int J Biol Macromol, 2018, 120(pt a): 985-91.

基金资助

湖南省青年自然科学基金(202140998)

湖南省自然科学基金(2025JJ50742)

RIGHTS & PERMISSIONS

版权所有©《南方医科大学学报》编辑部2021