平喘宁方通过调控HMGB1/Beclin-1轴介导的自噬改善患寒哮证大鼠的气道炎症

Pingchuanning Formula suppresses airway inflammation in a rat model of asthmatic cold syndrome by regulating the HMGB1/Beclin-1 axis-mediated autophagy

摘要

目的 基于高迁移率族蛋白 B1（HMGB1）/自噬相关基因Beclin-1（Beclin-1）轴探讨平喘宁方（PCN）调控细胞自噬减轻寒哮证大鼠气道炎症的作用。 方法 105只SPF级SD大鼠，随机分为对照组（CON）、模型组（MOD）、平喘宁高、中、低剂量组（PCN-H、PCN-M、PCN-L）、桂龙咳喘宁组（GLCKN）和地塞米松组（DEX），15只/组。除CON组外，其余大鼠构建寒哮证模型，并从第29天开始灌胃PCN、DEX及GLCKN。观察各组大鼠体质量、摄食量、摄水量，肺功能、肺组织氧化应激水平、肺泡灌洗液（BALF）炎性因子、肺组织病理、肺组织超微结构，细胞因子水平以及HMGB1/Beclin-1信号轴和细胞自噬相关基因和蛋白的表达。 结果 与CON组比较，MOD组大鼠表现出呼吸急促、喘息、流涕、腹部收缩明显、反应迟钝、反应缓慢，进食量减少，明显的皮毛枯槁或脱落等表现；体质量、摄食量、摄水量明显下降（P<0.05）；第0.3秒用力呼气量（FEV_0.3）、用力肺活量（FVC）、FEV_0.3/FVC明显降低（P<0.05）；肺组织表现出明显的炎性浸润，肺泡炎症评分明显上升（P<0.05）；BALF中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、白细胞数量明显上升（P<0.05）；肺组织MDA明显上升，SOD明显下降（P<0.05）；透射电镜（TEM）观察发现MOD组有自噬小泡数量较多，线粒体排列有紊乱及水肿现象，嗜锇性板层小体排空比较明显；肺组织HMGB1、Beclin-1、ATG5蛋白及mRNA表达明显上升，Bcl-2蛋白表达及mRNA明显降低，LC3II/I比值明显上升（P<0.05）；大鼠肺组织细胞因子IFN-γ明显降低，TNF-α、IL-6IL-1β、IL-13明显上升（P<0.05）。与MOD组比较，PCN能明显改善各项指标的病理改变，且作用效果优于GLKCN组，不亚于DEX组（P<0.05）。 结论 PCN能有效改善寒哮证模型大鼠气道炎症，其机制可能与调控HMGB1/Beclin-1信号轴，抑制细胞自噬从而缓解炎症损伤有关。

Abstract

Objective To explore the mechanism of Pingchuanning Formula (PCN) for inhibiting airway inflammation in rats with asthmatic cold syndrome. Methods A total of 105 SD rats were randomized equally into 7 groups, including a control group, an asthmatic cold syndrome model group, 3 PCN treatment groups at high, medium and low doses, a Guilong Kechuanning (GLCKN) treatment group, and a dexamethasone (DEX) treatment group. In all but the control rats, asthma cold syndrome models were established and daily gavage of saline, PCN, GLCKN or DEX was administered 29 days after the start of modeling. The changes in general condition, lung function and lung histopathology of the rats were observed, and inflammatory factors in the alveolar lavage fluid (BALF), oxidative stress, lung tissue ultrastructure, cytokine levels, and expressions of the genes related to the HMGB1/Beclin-1 axis and autophagy were analyzed. Results The rat models had obvious manifestations of asthmatic cold syndrome with significantly decreased body mass, food intake, and water intake, reduced FEV_0.3, FVC, and FEV_0.3/FVC, obvious inflammatory cell infiltration in the lung tissue, and increased alveolar inflammation score and counts of neutrophils, eosinophils, lymphocytes, macrophages, and leukocytes in the BALF. The rat models also had significantly increased MDA level and decreased SOD level and exhibited obvious ultrastructural changes in the lung tissues, where the expressions of HMGB1, Beclin-1, ATG5, TNF-α, IL-6,IL-1β, and IL-13 and the LC3II/I ratio were increased, while the levels of Bcl-2 and IFN-γ were decreased. PCN treatment significantly improved these pathological changes in the rat models, and its therapeutic effect was better than that of GLKCN and similar to that of DEX. Conclusion PCN can effectively alleviate airway inflammation in rat models of asthmatic cold syndrome possibly by modulating the HMGB1/Beclin-1 signaling axis to suppress cell autophagy, thereby attenuating airway inflammatory damages.

Graphical abstract

关键词

支气管哮喘 / 平喘宁方 / 细胞自噬 / 肺功能 / 气道炎症 / 寒哮证

Key words

bronchial asthma / Pingchuanning Formula / cell autophagy / lung function / airway inflammation / asthmatic cold syndrome

支气管哮喘（以下简称“哮喘”）是一种以气道慢性炎症、气道高反应性、可逆性气流受限和气道重塑为主要特征的慢性肺系疾病，其发病机制与环境及遗传因素有关，主要表现为喘息、气促、胸闷和（或）咳嗽等症状^{［1， 2］}。GINA2024指出，哮喘累及成人和儿童，危及全球3亿人的健康，每天导致约1000人死亡，是不容忽视的全球公共卫生问题^［3］。当前哮喘治疗以激素、β受体激动剂为主，但长期激素治疗存在一定的副作用^［4］，导致肺功能低下、嗜酸性粒细胞增多等不良反应^［5］，症状不能得到良好控制^{［6， 7］}。因此，探索新的有效治疗方法迫在眉睫。气道慢性炎症是哮喘的基本特征^［8］，如何有效中断哮喘气道炎症发展仍是医学界待攻克难点^［9］。研究表明，细胞自噬是细胞内的一种自我清除机制^［8］。自噬与哮喘关系密切，具有动态属性，在哮喘中处于失衡状态^［10］。病理条件下，细胞自噬过表达诱导炎症反应触发哮喘气道病理性改变^{［11， 12］}。在氧化应激条件下，HMGB1与Beclin-1蛋白竞争性结合，调控自噬，介导炎症反应^［13-18］。因此，调控HMGB1/Beclin-1轴介导的细胞自噬可能是改善哮喘气道炎症的关键环节。

哮喘归属中医学“哮病”“喘证”范畴，寒哮证是哮喘临床常见证型。中医药治疗哮喘在改善症状、减少不良反应等方面具有一定的优势^［19］。平喘宁方（PCN）由经典名方射干麻黄汤与三子养亲汤化裁，具有宣肺散寒、温肺化饮功效，临床治疗哮喘疗效确切。课题组既往临床观察发现：PCN可以调节哮喘患者血清嗜酸性阳离子蛋白（ECP）、白细胞介素2受体（SIL-2R）水平^［20］，降低CD18+白细胞水平， 从而缓解患者气道炎性反应^［21］。但PCN如何缓解气道炎症的具体机制尚未阐明，本文通过构建寒哮证大鼠模型，以HMGB1/Beclin-1信号轴调控细胞自噬为切入点，探讨PCN改善寒哮证模型大鼠气道炎症的潜在作用机制，为该方防治哮喘提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

健康雄性SPF级SD大鼠105只，体质量190~240 g，鼠龄6~8周，购自安徽医科大学动物实验中心。饲养于安徽中医药大学标准动物房，室温（23±2）℃，相对湿度（55±5） %，自由饮水、进食。本研究由安徽中医药大学伦理审查委员会批准（伦理批号：AHUCM-rats-2019009）。

1.1.2 实验药品

PCN（麻黄9 g、细辛3 g、苏子6 g、杏仁9 g、陈皮6 g、半夏9 g、黄芪9 g、太子参9 g、防风6 g、地龙6 g、浙贝母9 g）草药购自安徽省中医院草药房，经药学专家鉴定为正品（表1）。桂龙咳喘宁胶囊（桂龙医药）；地塞米松片（上药信谊药厂）。

1.1.3 实验试剂

一抗HMGB1、Beclin-1、ATG5（Abcam）、Bcl-2、LC3抗体（CST）；山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG（Zs-BIO）。RIPA裂解液、50×cooktail、PMSF（100 mmol/L）、磷酸化蛋白酶抑制剂、TWEEN 20、ECL、显影定影试剂（Servicebio）；蛋白Marker（Fermentas）；SOD试剂盒、MDA试剂盒（建成生物）。

1.2 研究方法

1.2.1 平喘宁方药液制备

PCN草药在蒸馏水中先浸泡60 min，大火煮沸后慢火煎煮90 min。用四层纱布过滤提取液，然后在蒸馏水中浸泡残渣，大火煮沸后再用慢火煎煮40 min，再次过滤后将两次煎煮液进行合并浓缩^［22］。

1.2.2 模型构建与分组给药

105只SD大鼠先进行适应性喂养1周，而后随机分为对照组（CON）、模型组（MOD）和PCN高剂量组（PCN-H），PCN中剂量组（PCN-M），PCN低剂量组（PCN-L），地塞米松组（DEX）和桂龙咳喘宁（GLCKN），15只/组。除CON组外，根据本课题组前期的造模方案，将其余大鼠在实验第1天及第8天，采用10% 卵清蛋白（OVA）溶液1 mL［含OVA 100 mg，Al₂（OH）₃ 100 mg］分别在腹腔注射0.5 mL及两侧腹股沟皮下各注射0.25 mL致敏造模，正常组用生理盐水替代。实验第15天，将大鼠放入自制的1.5 m×1.5 m×1.5 m不完全封闭的玻璃雾化箱内，各实验组大鼠每日自行雾化吸1% OVA溶液进行哮喘激发并给与寒冷刺激，1次/d，30 min/次，连续14 d，正常组用生理盐水替代。大鼠哮喘模型评估：体征观察：大鼠出现呼吸急促、喘息、腹部收缩明显、情绪低落，反应变慢，喜扎堆，进食量降低，出现皮毛枯槁或脱落现象，耳、唇颜色欠红润甚变为淡白，大鼠四肢末端及口鼻触碰温度降低，精神欠佳。呆板、鼠毛散乱无华等现象时，提示造模成功。HE染色观察大鼠气道病理学改变与炎症改变^［23］。

PCN从第29天开始给药，连续灌胃给药21 d。具体如下：CON组：10 mL/（kg·d）灌胃生理盐水；MOD组：10 mL/（kg·d）灌胃生理盐水；PCN-L组：3.645 g/（kg·d）灌胃给药；PCN-M组：7.289 g/（kg·d）灌胃给药； PCN-H组：14.578 g/（kg·d）灌胃给药； DEX组：0.405 g/（kg·d）； GLKCN组：0.405 g/（kg·d）。按照临床成人体表面积换算日用量的1、2、4倍（图1）。

1.2.3 大鼠体质量、摄食量和摄水量检测

每周称取大鼠体质量，评价各组大鼠体质量的变化程度，并记录摄食量、摄水量。

1.2.4 肺功能检测

SD大鼠予3%戊巴比妥钠（3 mg/100 g）进行腹腔注射麻醉进行肺功能检测，使用AniRes2003分析系统，测定0.3 s用力呼气容积（FEV_0.3）、用力呼气容积占用力呼气肺活量（FVC）、FEV_0.3/FVC，并记录各参数值。

1.2.5 肺泡灌洗液（BALF）中炎性细胞数检测

取大鼠BALF，4 ℃条件下4000 r/min离心10 min（r=16 cm），将BALF上清样品分离，用生理盐水重悬沉淀，吸取少量细胞悬液，利用血细胞计数板计数细胞总数。Diff-Quik染色液染色BALF细胞涂片，进行细胞分类细胞计数。

1.2.6 HE染色法观察各组大鼠肺脏病理形态变化

将固定的肺组织进行石蜡包埋、切片、HE染色。显微镜下观察HE染色情况，并对各组均在高倍光学显微镜下（10×40）观察3张典型的病理图像。其中支气管和血管周围的炎症评分按以下参数进行：大部分血管和支气管周围出现厚层炎性细胞（>5细胞厚度），3分；大部分血管和支气管周围出现薄层炎性细胞（1~5细胞厚度），2分；偶有炎性细胞脱落，1分；无炎症反应，0分^［24］。

1.2.7 肺组织氧化应激指标检测

取适量肺组织制备组织匀浆，然后分别严格按试剂盒要求进行样本检测准备，采用酶标仪分别在530 nm和550 nm处测定各组大鼠肺组织MDA、SOD的水平。

1.2.8 TEM观察观察肺组织自噬水平

取适量肺组织，用2%戊二醛/0.1 mol/L磷酸缓冲液固定，乙醇脱水，环氧树脂固定，超薄切片，醋酸铀酰和柠檬酸铅染色，然后用透射电镜观察各组大鼠肺组织细胞形态、线粒体形态等超微结构，透射电镜观察并采集图像分析。

1.2.9 RT-qPCR检测mRNA水平

用Trizol法提取提取大鼠肺组织总RNA，使用NanodroP 2000检测RNA浓度和纯度；使用RevertAidTM first Strand cDNA Synthesis Kit（K1622）试剂盒反转录。使用Novostart SYBR qPCR SuPerMix Plus（E096-01B试剂盒）进行qPCR，引物见表2。

1.2.10 Western blotting法检测蛋白表达

使用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA提取总蛋白。使用4X上样缓冲液制成蛋白质样品，随后在12.5% SDS-PAGE凝胶中分离蛋白，分离胶电压110 V，90 min；浓缩胶电压55伏，60 min。随后转移至PVDF膜。用5%脱脂奶粉室温封闭3 h。随后用一抗4 ℃孵育过夜（HMGB1∶1/10 000，Beclin-1∶1/2000，Bcl-2∶1/1000， LC3∶1/1000，ATG5∶1/5000）。二抗在室温下孵育1.5~2 h（1/5000），在暗室条件下进行化学发光反应。拍下所需条带，用Image J软件进行半定量分析。

1.2.11 ELISA检测大鼠血清炎症因子

收集各组大鼠血清，采用ELISA 检测各组大鼠血清的IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-13含量。严格按照IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-13试剂盒的说明书进行操作。酶标仪检测浓度：酶标仪检测吸光度A_{450 nm}，根据标准曲线计算样本孔中待检侧样本浓度。

1.2.12 统计学分析

使用SPSS 26.0和GraphPad Prism 9.5.1进行统计学分析和图表制作。数据符合正态分布，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较用ANOVA分析；非正态分布数据运用Kruskal-Wallis分析。以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 平喘宁方对模型大鼠体质量、摄食量和摄水量的影响

造模21、35、49 d，与CON组相比，MOD组体质量明显减轻（P<0.05）；与MOD组相比，各治疗组大鼠的体质量增多（P<0.01）；与GLKCN组和DEX组相比，PCN-H剂量组体质量增加（P<0.05）。造模第35天至实验结束（第49天），与CON组比，MOD组大鼠摄食量和摄水量呈下降趋势（P<0.05）；与MOD组相比，各治疗组大鼠摄食量和摄水量均有所增加（P<0.01）；与GLKCN组和DEX组比，PCN-H组摄食量和摄水量均增加（P<0.01，图2）。

2.2 平喘宁方对模型大鼠肺功能的影响

与CON组比，MOD组FVC、FEV_0.3、FEV_0.3/FVC下调（P<0.05）；与MOD组比较，各治疗组FVC、FEV_0.3、FEV_0.3/FVC明显上升，其中PCN各给药组呈现一定的剂量依赖，且PCN-H组FEV_0.3、FVC作用效果优于DEX组（P<0.05，图3）。

2.3 平喘宁方对模型大鼠肺组织病理的影响

CON组大鼠肺组织HE染色显示肺泡结构基本正常，肺组织结构清晰，未见明显炎性细胞浸润，支气管管壁及肺泡结构完整；MOD组大鼠肺组织肺泡结构不完整，伴有大量炎性细胞浸润，部分肺组织出现实质性改变，即支气管结构有所改变，周围黏膜组织有水肿现象，有炎性渗出物的出现，管腔狭窄，气管粘膜下层黏液险增生及扩张。PCN给药组大鼠肺组织的病理表现较模型组均有明显改善。对肺组织病理表现进行验证评价，与模型组相比，平喘宁低剂量组HE炎症评分差异均无统计学意义（P>0.05），其余PCN给药组大鼠炎症评分明显下降（P<0.05），平喘宁高剂量组HE评分与GLKCN组和地塞米松组相比差异均无统计学意义（P>0.05，图4）。

2.4 平喘宁方对模型大鼠BALF炎症水平和肺组织氧化应激的影响

与CON组比较，MOD组大鼠BALF中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、白细胞、巨噬细胞数量均明显上升（P<0.05）；与MOD相比，PCN各给药组大鼠BALF中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、白细胞、巨噬细胞数量明显下降（P<0.05），呈现剂量依赖性；PCN-H组与GLKCN组相比中性粒细胞数量明显降低（P<0.05）；PCN-H组中性粒细胞、嗜酸性粒细胞与DEX组相比无差异（P>0.05）。与CON组比较，MOD组大鼠肺组织MDA明显上升、SOD明显下降（P<0.05），PCN-H组MDA和SOD、GLKCN组MDA和SOD值与CON组相比差异均无统计学意义（P>0.05）；与MOD组比较，PCN各给药组大鼠肺组织MDA明显下降，SOD明显上升，呈一定的剂量依赖性，且PCN-H组与GLKCN组比MDA及SOD水平无统计学差异（P>0.05，图5）。

2.5 TEM观察肺组织超微结构

TEM观察各组大鼠肺组织超微结构，CON组超微结构完整正常；MOD组大鼠肺组织嗜锇性板层小体排空明显，线粒体排列紊乱及水肿，较多自噬小泡存在，PCN-H组上述特征性改变表现明显改善，且Ⅱ型细胞板层的小体排空情况减轻，线粒体未发生明显变化（图6）。

2.6 平喘宁方对哮喘模型大鼠肺组织的细胞自噬相关mRNA表达量影响

与CON相比，MOD组HMGB1、ATG5、Beclin-1 mRNA上升、Bcl-2mRNA下降（P<0.05）。与MOD组相比，各给药组大鼠肺组织HMGB1、Beclin-1、ATG5 mRNA下降、Bcl-2 mRNA上升（P<0.05）；其中PCN给药组呈现一定的剂量依赖性。PCN-H组与GLKCN组比HMGB1mRNA下降（P<0.05），Beclin-1、ATG5、Bcl-2mRNA无统计学差异（P>0.05）；PCN-H组与DEX组比，HMGB1、ATG5、Bcl-2 mRNA无统计学差异（P>0.05，图7）。

2.7 平喘宁方对模型大鼠肺组织细胞自噬相关蛋白的影响

与CON组比较，MOD组大鼠肺组织HMGB1、Beclin-1、ATG5及LC3II/LC3I比值上升，Bcl-2明显下降（P<0.05）。与MOD组比较，各给药组大鼠肺组织HMGB1、Beclin-1、ATG5蛋白表达及LC3II/LC3I比值下降、Bcl-2蛋白上升（P<0.05）；其中PCN给药组呈现一定的剂量依赖性。PCN-H组与GLKCN组和DEX组比，Beclin-1、LC3II/LC3I比值和Bcl-2无统计学差异（P>0.05），HMGB1、ATG5下调（P<0.05，图8）。

2.8 平喘宁方对模型大鼠肺组织细胞因子水平的影响

与CON组比较，MOD组大鼠肺组织炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-13上升（P<0.05），IFN-γ下降（P<0.05）；与MOD组比较，PCN各给药组大鼠肺组织炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-13下降（P<0.05），IFN-γ上升（P<0.05），呈现剂量依赖性。PCN-H组与GLKCN组比，IL-6、IL-13差异无统计学意义（P>0.05）。与DEX组比，IFN-γ、IL-13差异无统计学意义（P>0.05，图9）。

3 讨论

哮喘发病机制复杂，气道炎症被认为是核心病理特征之一，特点为炎症细胞增多与浸润^［2］。如何抑制气道炎症是哮喘临床治疗需要突破的瓶颈，亦是哮喘防治的重要途径。近年来，细胞自噬在氧化应激和炎症反应中扮演着重要角色，在哮喘的发展过程中，自噬可以通过调节免疫细胞抗原呈递从而影响炎症反应^［11］，其在哮喘气道炎症中的作用越来越受到学者的关注。

哮喘属中医“喘证”“哮病”等范畴，寒哮证为支气管哮喘急性发作常见证型，病因由先天禀赋虚弱、后天劳倦内伤所致脏腑功能失调，寒邪引动伏痰，致气道壅塞，肺失宣降，表现为气息喘促、痰鸣如吼等症。平喘宁由麻黄、防风、浙贝母等11味中药组成，具有温肺化痰，止咳平喘之功。方中麻黄细辛为君药，共奏宣肺散寒、温肺化饮之功^［25］。麻黄含有生物碱类、挥发油、黄酮类等多种化合物，具有止咳平喘，抗炎等功效，细辛止咳平喘。苦杏仁、苏子、半夏、浙贝母、地龙共为臣药，苦杏仁中苦杏仁苷可抑制呼吸中枢，达到止咳平喘的功效^［26］。半夏燥湿化痰，降逆止呕，消痞散结^［27］。半夏含有机酸类、生物碱类等多种化学成分，发挥镇咳祛痰作用^［28］。浙贝母清热润肺，化痰止咳，含西贝母碱，具有良好祛痰作用^［29］。地龙平喘通络，其抗哮喘功用与寡肽相关^［30］，缓解支气管痉挛。佐药陈皮、黄芪、防风、太子参具有补气健脾的功效。陈皮挥发油对豚鼠药物性哮喘起到保护作用^［31］。黄芪益气固表，黄芪甲苷可通过增强自噬减轻细胞的炎症反应和吸烟导致的肺损伤^［32］。本研究以HMGB1/Beclin-1信号轴调控细胞自噬切入，利用寒哮证病证结合模型大鼠探讨PCN改善气道炎症的潜在分子机制，为PCN防治哮喘提供科学依据。

气道慢性炎症是支气管哮喘的重要发病机制，也是评价哮喘动物模型构建成功的重要条件。哮喘发作与寒冷环境有关，在寒冷环境中，面部温度降低，呼吸道受冷空气刺激，炎症反应加重，哮喘加重^［33］。本课题组以10% OVA溶液注射腹腔及两侧腹股沟致敏，并将大鼠放入自制的玻璃雾化箱内雾化吸1% OVA溶液进行哮喘激发及寒冷刺激，构建寒哮证模型，并给于PCN进行干预。结果发现，MOD组大鼠表现出呼吸急促、腹部收缩明显、喘息、反应缓慢现象；体质量、摄食量、摄水量抓力明显下降。且MOD组大鼠肺组织病理切片显示肺组织表现出明显的炎性浸润，肺泡炎症评分明显上升。肺功能是哮喘治疗的重要指标，本研究中MOD组FEV_0.3、FVC、FEV_0.3/FVC明显降低，表明大鼠肺功能下降，有气流受限和气流阻塞。MOD组中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、白细胞数量明显上升，炎症水平较高。细胞因子与哮喘气道炎症关系密切^［34］，MOD组大鼠肺组织IFN-γ水平降低，IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-13细胞因子水平上升。以上表现符合寒哮证病症结合大鼠模型病理表现，而PCN干预后上述病理改变明显改善，说明PCN能有效改善哮喘气道炎症的病理改变，在中药治疗组PCN-L、PCN-M、PCN-H中，PCN-H组效果更佳。

哮喘发病时，氧化应激增加导致细胞损伤，气道炎症细胞和免疫细胞等大量激活，气道炎症加重^［35］。氧化应激与气道慢性炎症互相影响，加速哮喘疾病的发生发展。与正常人相比，哮喘患者的MDA水平增高，SOD水平降低，且急性发作时哮喘患者MDA水平高于稳定期患者^［36］。细胞自噬是一种高度保守的细胞过程，在氧化应激增加的情况下，细胞质成分和细胞器被双层膜结构的自噬体包裹，运送到溶酶体进行降解并回收细胞质成分，从而维持细胞的存活^［37］。氧化应激诱导自噬且在自噬过程中起重要作用。细胞自噬通过炎症反应影响哮喘发生发展，病理条件下，细胞自噬过表达会诱导炎症反应，触发哮喘气道病理性改变^［8］。哮喘患者的自噬水平明显升高^［38］。LC3位于前自噬泡和自噬泡膜表面，是细胞自噬泡膜的通用标志物，氧化应激水平增加时，自噬标志物LC3的累积增加，LC3II/LC3I 是检测细胞自噬的金标准，LC3能够促进自噬体形成，影响炎症水平^［9］。本研究发现MOD组大鼠肺组织MDA升高，SOD水平下降，ATG5蛋白及ATG5mRNA的水平升高，LC3II/I比值升高，肺组织自噬小体及小泡数量增多，而PCN可以有效改善上述指标，且疗效明显。提示PCN可以减少支气管哮喘模型大鼠肺组织的氧化应激水平和抑制肺组织自噬。

HMGB1是自噬的关键调控因子，是一种与染色质相关的核蛋白且和细胞外损伤相关的黏液蛋白，在核、胞质和细胞外水平的自噬调节中起重要作用^{［39， 40］}。在哮喘患者的痰液、血清或血浆中，HMGB1水平显著升高，提示HMGB1可能是哮喘严重程度的潜在生物标志物^［41］。Beclin-1调控自噬体的形成，是调控自噬的关键标志蛋白^［42］。氧化应激增加促进HMGB1胞质转运，使自噬通量增强，并在真核细胞中广泛的释放，胞质HMGB1与Bcl-2竞争，通过HMGB1 A-box中的C23和C45残基与自噬核心驱动因子Beclin-1结合，C106S突变株有更高的HMGB1细胞浆水平，与Beclin-1的结合增强，导致Bcl-2与Beclin-1分离^［43］，促进自噬小体的形成，诱导自噬^［44-46］。也就是说，应激条件下，核内的HMGB1进入细胞质，与自噬相关蛋白Beclin-1竞争性结合，破坏Beclin-1及Bcl- 2结合，使其从Beclin-1/Bc1-2复合物中释放，正性调节自噬^{［17， 18］}。本研究结果表明MOD组HMGB1、Beclin-1蛋白表达上升，Bcl-2蛋白表达下降，与MOD组相比，PCN下调HMGB1、Beclin-1蛋白表达，提高Bcl-2蛋白表达，降低HMGB1、Beclin-1表达，上调Bcl-2mRNA。表明PCN可能是通过缓解氧化应激，降低HMGB1的释放，影响其与Bc1-2竞争性结Beclin-1，下调自噬，缓解哮喘气道炎症。故PCN调控HMGB1/Beclin-1信号轴抑制哮喘模型大鼠肺组织细胞自噬水平改善哮喘气道炎症。

综上所述，PCN可降低氧化应激水平，调控HMGB1/Beclin-1信号轴，抑制细胞自噬，从而改善哮喘大鼠气道炎症，初步揭示了PCN防治哮喘的潜在分子机制。

参考文献

[1] Qin ZW, Chen YJ, Wang Y, et al. Immunometabolism in the pathogenesis of asthma[J]. Immunology, 2024, 171(1): 1-17. doi：10.1111/imm.13688

[2] Brasier AR. Innate immunity, epithelial plasticity, and remodeling in asthma[J]. Adv Exp Med Biol, 2023, 1426: 265-85. doi：10.1007/978-3-031-32259-4_13

[3] Global lnitiative for Asthma.Global strategy for asthma management and prevention[EB/OL].Revised, 2024.

[4] Heffler E, Madeira LNG, Ferrando M, et al. Inhaled corticosteroids safety and adverse effects in patients with asthma[J]. J Allergy Clin Immunol Pract, 2018, 6(3): 776-81. doi：10.1016/j.jaip.2018.01.025

[5] 范晓璇, 颜培正, 张庆祥. 黄芪甲苷通过LC3/Beclin 1干预哮喘寒饮蕴肺证大鼠细胞自噬的机制[J]. 中华中医药杂志, 2024, 39(11): 6037-42.

[6] Bao WP, Zhang YY, Hang JQ, et al. Short-acting beta-2 agonist prescription patterns and clinical outcomes in Chinese patients with asthma: an observational study in mainland China for the SABINA programme[J]. Ther Adv Respir Dis, 2022, 16: 17534666221115054. doi：10.1177/17534666221115054/v1/review2

[7] Haughney J, Winders T, Holmes S, et al. A charter to fundamentally change the role of oral corticosteroids in the management of asthma[J]. Adv Ther, 2023, 40(6): 2577-94. doi：10.1007/s12325-023-02479-0

[8] Sachdeva K, Do DC, Zhang Y, et al. Environmental exposures and asthma development: autophagy, mitophagy, and cellular senescence[J]. Front Immunol, 2019, 10: 2787. doi：10.3389/fimmu.2019.02787

[9] Dong HN, Yang W, Li W, et al. New insights into autophagy in inflammatory subtypes of asthma[J]. Front Immunol, 2023, 14: 1156086. doi：10.3389/fimmu.2023.1156086

[10] Wen X, Yang Y, Klionsky DJ. Moments in autophagy and disease: past and present[J]. Mol Aspects Med, 2021, 82: 100966. doi：10.1016/j.mam.2021.100966

[11] Debeuf N, Lambrecht BN. Eicosanoid control over antigen presenting cells in asthma[J]. Front Immunol, 2018, 9: 2006. doi：10.3389/fimmu.2018.02006

[12] Li BB, Chen YL, Pang FZ. microRNA-30a targets ATG5 and attenuates airway fibrosis in asthma by suppressing autophagy[J]. Inflammation, 2020, 43(1): 44-53. doi：10.1007/s10753-019-01076-0

[13] Cao XM, Wang K, Zhu HZ. Yanghepingchuan granule improves airway inflammation by inhibiting autophagy via miRNA328-3p/high mobility group box 1/Toll-like receptor 4 targeting of the pathway of signaling in rat models of asthma[J]. J Thorac Dis, 2023, 15(11): 6251-64. doi：10.21037/jtd-23-1262

[14] Tao ZP, Helms MN, Leach BCB, et al. Molecular insights into the multifaceted functions and therapeutic targeting of high mobility group box 1 in metabolic diseases[J]. J Cell Mol Med, 2022, 26(14): 3809-15. doi：10.1111/jcmm.17448

[15] Zhang D, Zhang JT, Xu CJ, et al. A humanized mouse model to study asthmatic airway remodeling and Muc-5ac secretion via the human IL-33[J]. Allergy, 2024, 79(5): 1364-7. doi：10.1111/all.16030

[16] Quan JY, Wen XX, Su GM, et al. Epithelial SIRT6 governs IL-17A pathogenicity and drives allergic airway inflammation and remodeling[J]. Nat Commun, 2023, 14(1): 8525. doi：10.1038/s41467-023-44179-x

[17] Qu LH, Chen C, Chen YY, et al. High-mobility group box 1 (HMGB1) and autophagy in acute lung injury (ALI): a review[J]. Med Sci Monit, 2019, 25: 1828-37. doi：10.12659/msm.912867

[18] Yang QN, Li M, Hou YJ, et al. High-mobility group box 1 emerges as a therapeutic target for asthma[J]. Immun Inflamm Dis, 2023, 11(12): e1124. doi：10.1002/iid3.1124

[19] Chen YJ, Shimizu Bassi G, Wang Y, et al. Research hotspot and frontier analysis of traditional Chinese medicine in asthma using bibliometric methods from 1991 to 2021[J]. J Allergy Clin Immunol Glob, 2022, 1(4): 185-97. doi：10.1016/j.jacig.2022.07.004

[20] 方向明, 孙子凯. 平喘宁对哮喘患者血清嗜酸细胞阳离子蛋白及白细胞介素2受体的影响[J]. 中国中医药科技, 2002, 9(3): 160. doi：10.3969/j.issn.1005-7072.2002.03.038

[21] 方向明, 王德均. 平喘宁对哮喘患者白细胞流变特性CD₁₈ ⁺表达及SICAM-1水平的影响[J]. 辽宁中医杂志, 2001, 28(12): 732. doi：10.3969/j.issn.1000-1719.2001.12.016

[22] 杨勤军, 王 卉, 徐淑钰, 等. 参芪调肾方减轻慢阻肺肺肾气虚证大鼠气道炎症的机制: 基于铁死亡途径[J]. 南方医科大学学报, 2024, 44(10): 1937-46. doi：10.12122/j.issn.1673-4254.2024.10.12

[23] 杨勤军. 麻芍平喘汤治疗支气管哮喘(冷哮证)临床疗效观察及实验研究[D]. 合肥: 安徽中医药大学, 2020.

[24] Ridzuan N, Zakaria N, Widera D, et al. Human umbilical cord mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles ameliorate airway inflammation in a rat model of chronic obstructive pulmonary disease (COPD)[J]. Stem Cell Res Ther, 2021, 12(1): 54. doi：10.1186/s13287-020-02088-6

[25] 蔡 旻, 方向明. 平喘宁调节PI3K信号通路干预寒哮大鼠肺组织气道炎症机制[J]. 辽宁中医药大学学报, 2024, 26(5): 19-24. doi：10.13194/j.issn.1673-842x.2024.05.004

[26] 陈林林, 谢金根, 樊学程, 等. 麻黄与杏仁配伍后在支气管哮喘模型大鼠体内的药动学研究[J]. 中国药房, 2024, 35(13): 1588-93. doi：10.6039/j.issn.1001-0408.2024.13.08

[27] 马继兴. 神农本草经辑注[M]. 北京: 人民卫生出版社, 1995: 74, 96, 201, 335, 398.

[28] 周亚丽, 杨 萍, 李喜香, 等. 半夏化学成分与药理作用研究进展及其质量标志物(Q-Marker)预测[J]. 中草药, 2024, 55(14): 4939-52. doi：10.7501/j.issn.0253-2670.2024.14.029

[29] 金 鑫, 李春楠, 张 辉. 贝母属药材中生物碱类化学成分及其药理活性研究进展[J]. 中药材, 2022, 45(9): 2273-9. doi：10.13863/j.issn1001-4454.2022.09.044

[30] 李思维, 郝二伟, 杜正彩, 等. 广地龙化学成分和药理作用的研究进展及其质量标志物(Q-Marker)的预测分析[J]. 中草药, 2022, 53(8): 2560-71. doi：10.7501/j.issn.0253-2670.2022.08.033

[31] 王 为, 潘赐明, 胡 倩, 等. 基于网络药理学研究半夏-陈皮-茯苓角药治疗胃癌的分子生物学机制[J]. 实用中医内科杂志, 2023, 37(8): 39-42, 181-2.

[32] Ying Y, Sun CB, Zhang SQ, et al. Induction of autophagy via the TLR4/NF-κB signaling pathway by astragaloside Ⅳ contributes to the amelioration of inflammation in RAW_264.7 cells[J]. Biomed Pharmacother, 2021, 137: 111271. doi：10.1016/j.biopha.2021.111271

[33] Hyrkäs-Palmu H, Jaakkola MS, Mäkikyrö EMS, et al. Subtypes of asthma and cold weather-related respiratory symptoms[J]. Int J Environ Res Public Health, 2022, 19(14): 8790. doi：10.3390/ijerph19148790

[34] Michaeloudes C, Abubakar-Waziri H, Lakhdar R, et al. Molecular mechanisms of oxidative stress in asthma[J]. Mol Aspects Med, 2022, 85: 101026. doi：10.1016/j.mam.2021.101026

[35] Ong G, Logue SE. Unfolding the interactions between endoplasmic reticulum stress and oxidative stress[J]. Antioxidants, 2023, 12(5): 981. doi：10.3390/antiox12050981

[36] Rahman I, Morrison D, Donaldson K, et al. Systemic oxidative stress in asthma, COPD, and smokers[J]. Am J Respir Crit Care Med, 1996, 154(4 Pt 1): 1055-60. doi：10.1164/ajrccm.154.4.8887607

[37] Mizushima N, Levine B. Autophagy in human diseases[J]. N Engl J Med, 2020, 383(16): 1564-76. doi：10.1056/nejmra2022774

[38] Jiang L, Diaz PT, Best TM, et al. Molecular characterization of redox mechanisms in allergic asthma[J]. Ann Allergy Asthma Immunol, 2014, 113(2): 137-42. doi：10.1016/j.anai.2014.05.030

[39] Frisardi V, Matrone C, Street ME. Metabolic syndrome and autophagy: focus on HMGB1 protein[J]. Front Cell Dev Biol, 2021, 9: 654913. doi：10.3389/fcell.2021.654913

[40] Tang DL, Kang R, Zeh HJ, et al. The multifunctional protein HMGB1: 50 years of discovery[J]. Nat Rev Immunol, 2023, 23(12): 824-41. doi：10.1038/s41577-023-00894-6

[41] Xu SL, Liu WH, Zhang LC, et al. High mobility group box 1 levels as potential predictors of asthma severity[J]. Chin Med J, 2023, 136(13): 1606-8. doi：10.1097/cm9.0000000000002491

[42] Rong YL, Fan J, Ji CY, et al. USP11 regulates autophagy-dependent ferroptosis after spinal cord ischemia-reperfusion injury by deubiquitinating Beclin 1[J]. Cell Death Differ, 2022, 29(6): 1164-75. doi：10.1038/s41418-021-00907-8

[43] Wu WL, Gao JL, Chen D, et al. Epithelial microRNA-30a-3p targets RUNX2/HMGB1 axis to suppress airway eosinophilic inflammation in asthma[J]. Respir Res, 2022, 23(1): 17. doi：10.1186/s12931-022-01933-x

[44] Zeng XN, Liu FW, Liu KY, et al. HMGB1 could restrict 1, 3-β-glucan induced mice lung inflammation by affecting Beclin1 and Bcl2 interaction and promoting the autophagy of epithelial cells[J]. Ecotoxicol Environ Saf, 2021, 222: 112460. doi：10.1016/j.ecoenv.2021.112460

[45] Zhu Q, Song JX, Chen JY, et al. Corynoxine B targets at HMGB1/2 to enhance autophagy for α-synuclein clearance in fly and rodent models of Parkinson's disease[J]. Acta Pharm Sin B, 2023, 13(6): 2701-14. doi：10.1016/j.apsb.2023.03.011

[46] Meng QY, Pu LY, Qi MR, et al. Laminar shear stress inhibits inflammation by activating autophagy in human aortic endothelial cells through HMGB1 nuclear translocation[J]. Commun Biol, 2022, 5(1): 425. doi：10.1038/s42003-022-03392-y

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