下调ACADM介导的脂毒性抑制雌激素受体阳性乳腺癌细胞的侵袭与转移

Down-regulation of ACADM-mediated lipotoxicity inhibits invasion and metastasis of estrogen receptor-positive breast cancer cells

摘要

目的 探讨中链酰基辅酶A脱氢酶（ACADM）对乳腺癌细胞侵袭和转移能力的影响及潜在作用机制。 方法 采用Kaplan-Meier Plotter数据库分析ACADM在乳腺癌组织及正常组织中表达水平与预后关系。通过慢病毒转染构建人乳腺癌MCF-7细胞、T47D细胞ACADM低表达细胞株，并建立原位成瘤及裸鼠尾静脉转移模型。分为ACADM高表达及低表达MCF-7细胞、T47D细胞组，分别进行油红O染色实验、ROS检测、线粒体呼吸链功能检测，ROS清除剂、心磷脂氧化抑制剂Elamipretide、AKT激活剂SC79干预后功能检测，Transwell小室实验、Boyden体外侵袭实验检测细胞迁移及侵袭能力，Western blotting检测相关信号通路蛋白表达水平。 结果 ACADM高表达组的OS要比低表达ACADM更短。ACADM下调表达的MCF-7细胞和T47D细胞中N calnexin、Vimentin、p-P13K和p-AKT蛋白表达下调，游离脂肪酸含量显著增加，活性氧含量也增加，线粒体呼吸链复合物Ⅲ和线粒体呼吸链复合物Ⅴ的活性下降，线粒体内心磷脂明显减少，细胞侵袭能力降低，分别使用ROS清除剂、心磷脂氧化抑制剂Elamipretide、特异性AKT激活剂SC79后可逆转细胞侵袭功能。 结论 下调ACADM可抑制HR阳性乳腺癌细胞迁移、侵袭能力，这一过程是因ACADM低表达导致的脂毒性，损伤线粒体功能，并通过ROS/PI3K/AKT通路实现的。

Abstract

Objective To investigate the effect of downregulation of medium-chain acyl-coenzyme A dehydrogenase (ACADM) on invasion and migration of estrogen receptor-positive breast cancer cells and the underlying mechanism. Methods The Kaplan-Meier Plotter database was used to analyze the ACADM expression levels in breast cancer and normal tissues and their association with patient prognosis. Human breast cancer MCF-7 and T47D cell lines with lentivirus-mediated ACADM knockdown were established, and their in situ tumor formation and metastasis after tail vein injection were evaluated in nude mice. The MCF-7 and T47D cells with ACADM knockdown and their unmodified parental cells were examined with oil-red O staining assay, ROS assay, mitochondrial respiratory chain function assay before and after treatments with ROS scavenger, Elamipretide (a cardiolipin oxidation inhibitor) or SC79 (an AKT activator), and the changes in migration and invasion abilities of the treated cells were analyzed with Transwell invasion assay and Boyden chamber assay. Western blotting was used to detect protein expression levels of related signaling pathways in the treated cells. Results ACADM overexpression was associated with a significantly shorter overall survival of breast cancer patients. In MCF-7 and T47D cells, ACADM knockdown resulted in downregulation of N calnexin, vimentin, p-P13K and p-AKT proteins, increased levels of free fatty acids and reactive oxygen species, lowered activities of mitochondrial respiratory chain complex III and V, and reduced mitochondrial inner phospholipids. ACADM knockdown significantly decreased the invasive capacity of the cells, which were obviously reversed by treatment with ROS scavenger, Elamipretide, and SC79. Conclusion Down-regulation of ACADM inhibits migration and invasion ability of estrogen receptor-positive breast cancer cells by lowering lipotoxicity and impairing mitochondrial function through the ROS/PI3K/AKT pathway.

Graphical abstract

关键词

乳腺癌 / 中链酰基辅酶A脱氢酶 / 侵袭 / 脂毒性 / ROS / PI3K-AKT

Key words

breast cancer / medium-chain acyl-coenzyme A dehydrogenase / invasion / lipotoxicity / reactive oxygen species / PI3K-AKT

乳腺癌已经成为全球女性最常见的恶性肿瘤，严重侵害女性的生命健康。根据世界卫生组织国际癌症研究机构发表的数据，2020年全世界乳腺癌新发病例220多万例，乳腺癌成为全球第1大癌^{［1， 2］}。乳腺癌发病率正在逐年上涨，肥胖、雌激素水平高、晚婚晚育是乳腺癌的常见危险因素^［3］。在乳腺癌发生发展过程中，常常伴有脂代谢紊乱^［4］，乳腺癌细胞脂质合成发生改变能力，从而满足其增殖分化及逃逸的需求^［5］。

肿瘤发生侵袭转移仍是造成多数肿瘤患者死亡的主要原因之一，对于转移性乳腺癌来说，临床上大多数治疗是兼顾生活质量与延长生存期^［6］。在肿瘤发展的不同阶段，脂质代谢会出现不同程度的增强^［7］，给肿瘤细胞提供能量，有利于形成转移的细胞膜成分，乳腺癌发生转移时也观察到类似变化^［8］。在脂质代谢增强过程中，常常会伴有不同的脂质代谢酶的活性改变，例如分解脂质的酶肉碱棕榈酰转移酶1A（CPT1A）、长链酰基辅酶A合成酶4（ACSL4）等，合成脂质的酶脂肪酸合成酶（FASN）、ATP-柠檬酸裂解酶（ACLY）等，它们共同影响乳腺癌细胞的侵袭、转移能力^［9-12］，肿瘤细胞发生转移与侵袭时，不仅仅改变自身的脂质代谢情况，并且还改变肿瘤微环境中脂质代谢组成和环境条件，以帮助其逃逸和播散，以及逃避免疫监控^{［13， 14］}。总之，肿瘤发生侵袭转移时，脂质代谢发挥了重要的作用。

中链酰基辅酶A脱氢酶（人类基因ACADM）位于第31.1位染色体1的短（p）臂，催化线粒体中活化的中链脂肪酸的β-氧化的第一个脱氢步骤^［15］。ACADM在乳腺癌、前列腺癌等多种癌种中高表达，且与预后不良高度相关^［16-18］，但在肝癌中ACADM起到了抑癌作用^［19］。我们前期实验筛选到目的基因ACADM与ER阳性乳腺癌存在密切关联。进行的一系列的体外功能实验、动物体内成瘤等实验表明ACADM与ESR1协同通过激活PI3K/AKT通路调节FASN从而增强ER阳性乳腺癌细胞迁移、侵袭能力^［18］。已有研究证实ACADM在胶质母细胞瘤中可保护线粒体免受脂质过氧化的毒害，从而影响胶质母细胞瘤的增殖和成瘤等恶性生物学行为^［20］，但该基因在乳腺癌细胞中对脂质代谢的影响尚未见报道。本研究旨在探索ACADM对于ER阳性乳腺癌细胞脂代谢的影响及其具体机制。

1 材料和方法

1.1 细胞与试剂

人雌激素受体阳性乳腺癌细胞株MCF-7细胞、T47D细胞（上海生命科学院细胞库），于37 ℃，5% CO₂恒温培养。DMEM/HIGH GLUCOSE培养基（百特哈艾迈克公司），FBS（GIBCO），shACADM、阴性对照慢病毒LV（上海吉凯基因公司），改良油红O染色试剂盒、脂质氧化（MDA）检测试剂盒、增强型ATP检测试剂盒（碧云天），游离脂肪酸含量试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司），乙酰辅酶A含量试剂盒（Bioss），ROS活性氧检测试剂盒、线粒体呼吸链复合物Ⅲ、V活性检测试剂盒（索莱宝），辅酶II NADP（H）含量检测试剂盒（茁彩生物有限公司），线粒体超氧化物红色探针（ABclonal）。

1.2 方法

1.2.1 转染慢病毒

细胞内加入根据计算加入2 μL的病毒量（通过慢病毒说明书计算病毒量=（MOI×24孔板内细胞数）/病毒滴度）后，用1∶1000浓度嘌呤霉素进行稳转株的筛查，经Western blotting验证其效率。

1.2.2 细胞培养

MCF-7细胞、T47D细胞及shACADM MCF-7细胞和shACADM T47D细胞分别在添加10%胎牛血清的DMEM培养液培养，MCF-10A细胞使用专用的MCF-10A培养液培养，细胞培养在37 ℃、5% CO₂的恒温细胞孵箱内。

实验分3组：4%SA组用4%血清处理48 h。ROS inhibitor组：ROS inhibitor（1∶250）处理24 h。Elami-pretide组：用1 μmol Elamipretide处理细胞24 h，SC79组：使用1 μmol SC79处理细胞24 h。未干预的为对照组。培养基2 d/次更换培养液。

1.2.3 CCK-8实验

细胞计数，加入CCK-8试剂后放入孵箱内孵育2 h，酶标仪记录吸光值A_{450 nm}，并做统计，绘制曲线。

1.2.4 Transwell小室体外迁移实验、Boyden体外侵袭实验

细胞置于Transwell小室上室中加入无血清培养细胞，下室内加入完全培养基，在37 ℃细胞培养箱中培养24 h后，4%多聚甲醛内固定，吉姆萨染色，计数并统计结果，Boyden体外侵袭实验：每个上室内加入约50 μL无血清培基稀释的基质胶至凝固后加入细胞，其余步骤基本同Transwell小室体外迁移实验。

1.2.5 Western blotting

提取细胞内蛋白并配平后电泳，转膜，经封闭后加 入一抗（1∶1000），4 ℃孵育过夜，洗涤后加入兔二抗或鼠二抗（1∶5000）室温孵育1 h，洗涤后利用化学发光凝胶成像分析仪观察蛋白表达情况。

1.2.6 裸鼠尾静脉转移模型

将20只6周龄雌性BALB/c 裸鼠随机分成两组，分别进行尾静脉注射shACADM细胞及阴性对照组（用100 μL无菌PBS重悬配置细胞悬液，每只注射2.0×10⁶ 细胞）。6周后处死裸鼠，观察测量转移瘤的大小，固定包埋组织，切片染色分析结果。

1.2.7 HE染色法

石蜡组织切片放至60 ℃烤箱烘烤2 h后，逐步脱蜡后，苏木精染核2 min放入双蒸水中清洗，盐酸酒精 分化2~5 s，水洗返蓝7~10 min，伊红染色2 min，逐步脱水后中性树脂封片。

1.2.8 原位成瘤

将10只6周龄雌性BALB/c 裸鼠随机分成两组，5只/组，分别将2.0×10⁶细胞将其注射进裸鼠乳腺脂肪垫内，观察裸鼠有无异常，无异常即可转入动物房继续饲养，3 d/次查看裸鼠的状态及成瘤大小，4周后拍照和保留瘤子，

1.2.9 油红O染色

六孔板每个孔加入适量染色洗涤液，吸除染色洗涤液，加入1 mL/孔油红O染色液，染色30 min后，加入适量染色洗涤液，静置30 s后去除染色洗涤液，PBS洗涤，显微镜下观察和拍照。

1.2.10 检测游离脂肪酸

加入萃取液，破碎细胞，低温离心，取有机相液体于另外的离心管待测。配置工作液，离心，取上层有机相，混匀此时液体体积为V1，10 min后酶标仪测定吸光值A_{550 nm}，为A_测定。空白对照管为A_空白。△A=A_测定-A_空白。测定蛋白浓度：取有机相的液体检测样品的蛋白浓度，用BCA检测试剂盒检测，计算：标准曲线：y = 0.0161x-0.0141 R² = 0.9985 x：棕榈酸标准品浓度（nmol/mL）y：吸光值差值ΔA。游离脂肪酸含量（μmol/mg prot）=（ΔA+0.0141）÷0.0161×V1÷（V1×Cpr）÷1000 =0.062×（ΔA+0.0141）÷Cpr（蛋白浓度）。

1.2.11 酰基辅酶A含量测定

消化离心细胞，超声破碎细胞，低温离心取上清液，取上清液样本和工作液至96孔板中，酶标仪检测340 nm处20 s的吸光值A1和80 s时的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1的数值。计算公式为：乙酰辅酶 A 含量（nmol/10⁴ ）= （ΔA÷ε÷d）×V反×109÷V 样×V 提÷500×F=6.56×ΔA×F （F为细胞数量）。

1.2.12 脂质氧化（MDA）测定

消化离心细胞，加入裂解液低温离心机离心，配置0.37%的TBA储存液。裂解液作为空白对照，加入样品上清液用于测定；随后加入0.2 mL MDA检测工作液。沸水浴，冷却至室温，离心机离心，用酶标仪测定吸光度A_{532 nm}。

1.2.13 ROS活性氧检测

稀释液：染色液的比例为1∶1000，铺好细胞样品，加入稀释好的工作液， 37 ℃ 孵育，PBS润洗2次后，荧光显微镜下检测观察和使用流式细胞仪检测。

1.2.14 线粒体呼吸链复合物Ⅲ活性检测

消化离心细胞，加入提取液，研磨，低温离心，沉淀物中加入提取液，超声波振荡器破碎，用于复合体Ⅲ酶活性测定，并且用于蛋白含量测定。检测线粒体呼吸链复合物Ⅲ活性：酶标仪记录550 nm处初始吸光值A1和2 min后的吸光值A2，分别记为A1_测定、A2_测定，A1_对照、A2_对照。计算ΔA=（A2_测定-A1_测定）-（A2_对照-A1_对照）。计算：复合体Ⅲ（U/mg prot）=［ΔA×V÷（ε×d）×10⁹］÷（Cpr×V样） ÷T=261×ΔA÷Cpr。

1.2.15 线粒体呼吸链复合物V活性检测

细胞处理步骤同线粒体呼吸链复合物Ⅲ活性检测，检测线粒体呼吸链复合物V活性：按照说明书进行样品与试剂混匀， 40 ℃水浴10 min，酶标仪测定吸光值A_{660 nm}，分别记为A_对照管、A_测定管、A_标准管、A_空白管，计算ΔA测定=A_测定管-A_对照管，ΔA标准=A_标准管-A_空白管。计算：复合体Ⅴ活性（U/mg prot）=ΔA测定÷ΔA标准×C标准×V酶促×1000÷（Cpr×V样本）÷T=20×ΔA测定÷ΔA标准÷Cpr （C标准：标准溶液浓度，0.25 μmol/mL；1000：单位换算系数，1 μmol=1000 nmol；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，需自行测定；V样本：样本体积，0.05 mL；V酶促：酶促反应总体积，0.12 mL；T：反应时间，30 min）。

1.2.16 检测增强型ATP

加入裂解液，低温离心机离心取上清液，用于后续的ATP测定或者蛋白浓度测定，按说明书配置ATP检测工作液的配制。加ATP检测工作液到不透光的96孔板内，加上20 μL样品，用化学发光仪（luminometer）测定RLU值。

1.2.17 检测线粒体活性氧ROS

用HBSS按比例1∶1000稀释上述储存液到其最后的浓度为5 μmol/L，在细胞孵箱中37 ℃避光孵育10 min。然后进行清洗，使用共聚焦显微镜检测和流式细胞仪检测细胞线粒体ROS含量。

1.3 统计学分析

采用 SPSS 19.0 和 GraphPad Prism7 统计软件对相应的实验结果数据进行统计学分析，组间差异比较采用独立样本t检验，至少进行3次独立重复实验，结果用均数±标准差表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ACADM在乳腺癌表达水平及对ER阳性乳腺癌细胞恶性生物学行为的影响

Western blotting结果显示，对比正常乳腺上皮细胞，MCF-7细胞和T47D细胞中ACADM蛋白表达量增加（图1A），在Kaplan-Meier Plotter 查询ACADM在乳腺癌相关预后信息，发现ACADM高表达组的OS（总生存时间）要比低表达ACADM更短，高表达ACADM的乳腺癌患者预后不良（图1B）。慢病毒成功构建了ACADM表达下调的MCF-7细胞（shACADM MCF-7）与T47D细胞（shACADM T47D）（图1C）。CCK8检测验证了shACADM MCF-7细胞和shACADM T47D细胞与MCF-7细胞和T47D细胞相比，细胞增殖能力没有明显改变（P>0.05，图1D），同样在动物实验中原位成瘤中shACADM MCF-7细胞与对照组相比，成瘤大小无明显差异（P>0.05，图1E、F）。与对照组相比，shACADM MCF-7细胞和shACADM T47D细胞中EMT相关指标N calnexin和Vimentin蛋白下调（P<0.05），E calnexin蛋白上调（P<0.05，图1G）。

2.2 下调ACADM后的脂毒性影响MCF-7细胞与T47D细胞的侵袭能力

shACADM MCF-7细胞和shACADM T47D细胞中，可见脂滴的积累（图2A）；并且游离脂肪酸比对照组显著增加4~5倍（P<0.05，图2B），酰基辅酶A含量也增加（P<0.05，图2C）。shACADM MCF-7细胞和shACADM T47D细胞在4%浓度血清干预下比未干预下的shACADM MCF-7细胞和shACADM T47D细胞穿膜细胞数量增多（P<0.05，图2D、E）。

2.3 下调ACADM导致ROS增加影响细胞侵袭能力

shACADM MCF-7细胞和shACADM T47D细胞活性氧含量比对照组增加（P<0.05，图3A、B），同时脂质氧化（MDA）含量增加（P<0.05，图3C）。

使用ROS清除剂后，shACADM MCF-7细胞和shACADM T47D细胞比未干预下的shACADM MCF-7细胞和shACADM T47D细胞ROS含量下降（P<0.05，图3D）、穿膜细胞数增加（P<0.05，图3E、F）。

2.4 ACADM通过损害细胞线粒体功能影响细胞侵袭能力

作为对产生的 ATP 总量的补偿，shACADM MCF-7细胞比MCF-7细胞提高了糖酵解能力（图4A、B），shACADM MCF-7细胞和shACADM T47D细胞比对照组的ATP含量下降（P<0.05，图4C）、线粒体ROS的含量增加（P<0.05，箭头所指暗红色为活性氧含量高，图4D、E）。并且shACADM MCF-7细胞和shACADM T47D细胞中线粒体呼吸链复合物Ⅲ和线粒体呼吸链复合物Ⅴ的活性比对照组下降（P<0.05，图4F、G）。

2.5 ACADM通过线粒体心磷脂影响细胞侵袭转移能力

下调ACADM表达后的MCF-7细胞进行脂质代谢组学分析（图5A），发现shACADM MCF-7细胞，很多脂质分子发生调变，其中筛选出表达量明显减少的心磷脂（CL）。shACADM MCF-7细胞和shACADM T47D细胞，在使用特异性心磷脂氧化抑制剂Elamipretide（MTP-131）干预后，线粒体ROS的含量相较于未干预shACADM MCF-7细胞和shACADM T47D细胞明显减少（P<0.05，图5B）、穿膜细胞数增加（P<0.05，图5C、D）。

2.6 ACADM通过调控PI3K/AKT信号通路影响细胞侵袭能力

与对照组相比，shACADM MCF-7细胞和shACADM T47D细胞中p-P13K和p-AKT蛋白的表达量下降（P<0.05，图6A）。特异性AKT激活剂SC79作用下， shACADM MCF-7细胞和shACADM T47D细胞比未干预下的shACADM MCF-7细胞和shACADM T47D细胞穿膜数量增多（P<0.05）并且p-AKT 表达增加（P<0.05，图6B~D），同时减少了ROS含量（P<0.05，图6E）。使用ROS抑制剂干预下的shACADM MCF-7细胞和shACADM T47D细胞比未干预的shACADM MCF-7细胞和shACADM T47D细胞的PI3K/AKT通路蛋白的表达增加（P<0.05，图6F）。

3 讨论

ACADM是分解活化的中链脂肪酸β-氧化第一个脱氢步骤的关键酶，在临床上中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症是一种常染色体隐形遗传病，通常是由ACADM基因突变造成的^［22］，中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症患者发病时常常出现精神状况紊乱、呕吐、低血糖等症状，严重时会造成死亡^［23］。在乳腺癌中，ACADM与脂代谢之间的关系并不明确。

本研究通过分子水平、细胞水平和动物实验证实了下调ACADM后，ER阳性的乳腺癌细胞的侵袭、转移能力的降低，但其增殖能力并没有改变。中链脂肪酸可以直接进入线粒体内^［24］，故病理状态下活化的中链脂肪酸能大量堆积在线粒体内^［25］。在结肠癌细胞中，中链脂肪酸可以抑制结肠癌细胞的侵袭与转移^［26］。我们的研究也发现，下调ACADM后的MCF-7细胞和T47D细胞无法顺利分解中链脂肪酸从而堆积在细胞内形成脂滴。脂滴是富含脂质的细胞器^［27］，脂滴的形成通常与氧化应激、线粒体功能障碍有关^［28］，脂质（胆固醇、脂肪酸等）过度累积可引起活性氧（ROS）增多，是引起脂毒性对细胞造成损害的方式之一^［21］，ROS是其侵袭转移能力下降的原因之一。在结肠癌HCT116细胞中活性氧ROS的不可逆性的上调会抑制肿瘤细胞的侵袭与转移能力^［29］，胰腺癌细胞中，大量的ROS生产也会导致癌细胞的侵袭转移能力的下降^［30］。越来越多的证据表明，活性氧具有两面性，一方面能促进乳腺癌肿瘤细胞的凋亡，引起乳腺癌细胞凋亡的ROS含量比正常的乳腺癌细胞的5倍以上^［31］，另一方面可以促进乳腺癌肿瘤细胞的增殖、侵袭与转移能力，引起促进乳腺癌细胞ROS含量约为比正常的乳腺癌细胞的1.2~1.5倍^［32］， ACADM表达下调的 MCF-7细胞和T47D细胞所产生的这些活性氧数值仅仅影响细胞侵袭与转移能力。所以我们推测下调ACADM后，雌激素受体乳腺癌细胞所产生的活性氧ROS对于MCF-7细胞和T47D细胞可能处于适量与过量之间的“中间量”。我们的研究发现了能够抑制MCF-7细胞与T47D细胞侵袭能力的ROS“中间量”大约为正常的MCF-7细胞与T47D细胞的2~3倍，这为通过ROS抑制ER阳性的乳腺癌细胞提供理论依据。

脂滴导致线粒体活性氧含量增加^［33-35］。可能与线粒体呼吸链的复合物损伤有关^{［36， 37］}。ROS主要由线粒体内膜呼吸链中的复合物产生，线粒体内膜呼吸链中的复合物活性异常会导致ROS的增加^［38］。通过脂质代谢组学分析发现，ACADM下调的MCF-7细胞中很多脂质分子发生了改变，这可能是ACADM表达下调后的MCF-7细胞和T47D细胞发生的适应性脂质代谢重编，其中明显减少的脂质有CL、PC（磷脂酰胆碱）、Cer（神经酰胺）这三种。我们筛选出减少最明显的CL（心磷脂），心磷脂是线粒体内膜中的特征性脂质，与线粒体呼吸链有关^［39］。在肝癌细胞与前列腺癌细胞中，心磷脂减少可影响肿瘤细胞的增殖、侵袭与转移能力^{［39， 40］}。我们的实验发现，抑制特异性心磷脂氧化可减少ROS生成，同时ACADM表达下调的MCF-7细胞和T47D细胞中p-PI3K、p-AKT蛋白表达量下降，提示ROS增加可通过调控抑制PI3K/ATK通路的激活抑制细胞的侵袭与转移。我们研究阐明了ACADM表达下调后的MCF-7细胞、T47D细胞出现脂肪酸的堆积，导致细胞内脂质重编。心磷脂含量的减少破坏线粒体功能，造成线粒体活性氧ROS含量增加，抑制PI3K/ATK通路的活性，最终导致细胞的侵袭转和移能力下降。

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