温胆汤通过调控肠道菌群-胆汁酸轴改善代谢综合征痰证大鼠的代谢表型

Wendan Decoction ameliorates metabolic phenotypes in rats with metabolic syndrome and phlegm syndrome by modulating the gut microbiota-bile acid axis

摘要

目的 基于肠道菌群-胆汁酸轴探讨温胆汤对代谢综合征（MS）痰证大鼠的影响。 方法 将40只Wistar大鼠随机分为正常组（n=8）和造模组（n=32），采用高脂高糖高盐饮食联合低剂量腹腔注射链脲佐菌素诱导MS痰证大鼠模型。根据模型评价标准筛选成模大鼠，将成模大鼠随机分为模型组、温胆汤组（3.6 g·kg^-1·d^-1）、二甲双胍组（0.1 g·kg^-1·d^-1），分别给予相应药物干预4周。动态记录大鼠一般情况、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、空腹血糖（FBG）、血清胰岛素（FINS）等指标，计算Lee's指数和HOMA-IR。ELSIA检测血清脂多糖水平，HE染色观察肝脏组织病理学改变，Western blotting检测肝脏中FXR、CYP7A1、FGFR4及回肠中FXR、FGF15蛋白表达。16S rDNA测序技术分析盲肠内容物肠道菌群结构，超高液相色谱串联质谱法（UHPLC-MS/MS）测定血清胆汁酸含量。 结果 与正常组相比，模型组大鼠肝细胞出现严重脂肪变性、坏死；体质量、腹围、Lee's指数、FBG、FINS、HOMA-IR、TG、TC、LDL、脂多糖等含量升高（P<0.05），HDL降低（P<0.05）；拟杆菌门、巨单胞菌属、拟杆菌属相对丰度升高（P<0.05）；厚壁菌门丰度、Lachnospiraceae_NK4A136_group、异猪去氧胆酸、甘氨猪脱氧胆酸等降低（P<0.05）；肝组织FXR、FGFR4及回肠组织FXR、FGF15蛋白表达降低（P<0.05），肝脏CYP7A1蛋白表达升高（P<0.05）。与模型组相比，温胆汤治疗后肝组织病理改变明显减轻；体质量、腹围、Lee's指数、FBG、FINS、HOMA-IR、TG、TC、LDL、脂多糖等含量降低（P<0.05），HDL含量升高（P<0.05）；拟杆菌门、拟杆菌属相对丰度降低（P<0.05）；Lachnospiraceae_NK4A136_group、厚壁菌门相对丰度及异猪去氧胆酸、甘氨猪脱氧胆酸等含量升高（P<0.05）；肝组织FXR、FGFR4及回肠组织FXR、FGF15蛋白表达升高（P<0.05），肝脏CYP7A1蛋白表达降低（P<0.05）；相关性分析显示厚壁菌门、Lachnospiraceae_NK4A136_group与异猪去氧胆酸、猪脱氧胆酸含量呈正相关（P<0.01），拟杆菌门、巨单胞菌属、拟杆菌属与异猪去氧胆酸、猪脱氧胆酸含量呈负相关（P<0.05）。 结论 温胆汤能显著改善MS痰证大鼠的代谢表征，其作用机制或与调节肠道菌群-胆汁酸轴功能密切相关，可能通过介导FXR信号通路，调整MS痰证大鼠肠道菌群结构，维持胆汁酸稳态，从而改善MS痰证。

Abstract

Objective To investigate the therapeutic mechanism of Wendan Decoction for phlegm syndrome in rats with metabolic syndrome (MS). Methods Forty Wistar rats were randomly divided into normal control group (n=8) and 3 phlegm syndrome model groups (induced by high-fat, high-sugar, and high-salt feeding and a single-dose intraperitoneal STZ injection; n=24) treated with daily gavage of saline, Wendan Decoction (3.6 g/kg), or metformin (0.1 g/kg) for 4 weeks. General conditions and glucose and lipid metabolism parameters of the rats were monitored, and serum LPS, liver histopathology, hepatic expressions of FXR, CYP7A1 and FGFR4 and ileal expressions of FXR and FGF15 were examined. Gut microbiota structure was analyzed using 16S rDNA sequencing, and serum bile acids were quantified with UHPLC-MS/MS. Results The rat models of phlegm syndrome exhibited severe hepatic steatosis and necrosis, increased body weight, abdominal circumference, Lee's index, FBG, FINS, HOMA-IR, TG, TC, LDL and LPS, and decreased HDL level. The abundance of Bacteroidetes, Megamonas, and Bacteroides in gut microbiota increased while Firmicutes, Lachnospiraceae_NK4A136_group, isohyodeoxycholic acid, and glycohyodeoxycholic acid decreased significantly; hepatic FXR and FGFR4 expressions and ileal FXR and FGF15 expressions decreased while hepatic CYP7A1 expression increased significantly in the rat models. Treatment with Wendan Decoction effectively alleviated hepatic pathology, reduced body weight and abdominal circumference, improved glucose and lipid metabolic profiles and gut microbiota structure, and reversed the changes in hepatic and ileal protein expressions. Correlation analysis revealed that Firmicutes and Lachnospiraceae_NK4A136_group were positively correlated while Bacteroidetes, Megamonas and Bacteroides were negative correlated with the levels of isohyodeoxycholic acid and hyodeoxycholic acid. Conclusion Wendan Decoction can significantly improve metabolic profiles in rats with phlegm syndrome of MS possibly by regulating the intestinal flora-bile acid axis to modulate the intestinal flora structure and maintain bile acid homeostasis via the FXR signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

代谢综合征 / 肠道菌群 / 胆汁酸 / 痰证 / 温胆汤 / 代谢表型

Key words

metabolic syndrome / intestinal flora / bile acid / phlegm syndrome / Wendan Decoction / metabolic phenotype

代谢综合征（MS）由中心肥胖、血脂代谢异常、胰岛素抵抗等相互联系的危险因素组成，是多种代谢紊乱聚集发生的一组症候群^［1］，并与非酒精性脂肪肝病、心脑血管疾病、多种癌症的发生风险显著正相关^［2］。随着人们生活方式及饮食结构的改变，其发病率逐年递增，对个人及社会构成严重的负担，早期风险识别是扭转这一趋势的关键^［3］。肠道微生物群与胆汁酸之间具有交互作用，其主要是通过调节胆汁酸信号传导来影响全身代谢稳态，其微生物群的失衡与MS各组分的发生发展密切相关，重塑肠道微生物群结构可以显著改善MS的进展^{［4， 5］}。因此，深入研究肠道菌群-胆汁酸轴与MS之间的机制对早期风险识别具有重要意义。

MS病位主要涉及肝、脾、肾，病性上以虚实夹杂为主^［6］。“痰生百病食生灾”，痰从病理机制上与胰岛素抵抗具有一致性，是MS发生发展的病理基础，而湿和热的兼杂贯穿于MS痰证发生发展的整个过程^{［7， 8］}。温胆汤源自《三因极一病证方论》，具有化痰降浊的功效，是治疗痰湿内蕴型MS的首选方剂^［9］。课题组前期研究表明，温胆汤能够显著改善MS痰证大鼠的代谢表征^［10］。但温胆汤是否通过纠正肠道微生物群结构，激活胆汁酸负反馈调节通路，维持胆汁酸稳态，从而改善MS痰证的代谢表征还有待进一步研究。本研究采用16S rDNA高通量测序及超高液相色谱串联质谱法（UHPLC-MS/MS）探讨温胆汤对MS痰证大鼠肠道菌群结构及胆汁酸谱的影响，以期揭示温胆汤治疗MS痰证的作用机制，为中医药防治MS痰证提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验试剂、仪器及动物

1.1.1 药品及试剂

温胆汤采用《三因极一病证方论》原方，法半夏6 g、茯苓4.5 g、竹茹6 g、枳实6 g、制陈皮9 g、炙甘草3 g，购自福建中医药大学附属第三人民医院；盐酸二甲双胍片（中美上海施宝制药有限公司）；链脲佐菌素STZ（Sigma Aldrich）；0.1 mol/L柠檬酸钠缓冲液（北京索莱宝科技有限公司）；HE染色液（上海源叶生物科技有限公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）；GAPDH一抗、FXR一抗、CYP7A1一抗、FGFR4一抗（武汉三鹰生物技术有限公司）；FGF15抗体（Abcam）；抗兔检测试剂盒、抗鼠检测试剂盒、12 000~230 000 Jess /Wes Separation Module，8x25 capillary cartridges（12 000~230 000）Wes分离试剂盒（Proteinsimple）。

1.1.2 实验仪器

血糖仪（欧姆龙），Chemray 240全自动生化分析仪、Chemray 420全自动生化分析仪，Chemray 800全自动生化分析仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司），生物组织包埋机、石蜡切片机（Leica），正置荧光显微镜（Carl Zeiss），Wes全自动蛋白质表达定量分析系统（Proteinsimple），超高效液相色谱仪、高分辨质谱仪（Vanquish、Orbitrap Exploris 120，Thermo Scientific）。

1.1.3 实验动物

7周龄SPF级Wistar雄性大鼠40只，体质量190±20 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，生产许可证号SCXK（沪）2022-0004，合格证编号：20220004018502。大鼠分笼饲养于福建中医药大学实验动物研究中心SPF级屏障系统。本研究严格按照福建中医药大学动物伦理审查标准进行（伦理批号：FJTCMIACUC2022238）。普通饲料由福建中医药大学实验动物中心提供，高脂高糖高盐饲料（普通饲料40.5%，猪油22%，果糖18%，酪蛋白12%，胆固醇2%，食盐5%，胆盐0.5%）由无锡帆泊生物技术有限公司提供。所有饲料在进入SPF级屏障系统前均进行消毒处理。

1.2 方法

1.2.1 动物分组、模型制备及干预给药

40只SPF级雄性Wistar大鼠适应性喂养1周后，按随机数字表法分为正常组8只和造模组32只。正常组大鼠予普通饲料喂养，造模组大鼠予高脂高糖高盐饲料喂养，持续造模15周。造模期间每5周动态测量两组大鼠的体质量、体长、腹围、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、空腹血糖（FBG），计算Lee's指数。饲养至14周末，造模组大鼠禁食不禁水12 h后一次性腹腔注射25 mg/kg的链脲佐菌素（STZ），正常组大鼠予同剂量的柠檬酸钠缓冲液腹腔注射^{［11，12］}。造模结束增加测量血清胰岛素（FINS），计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）。模型评价参考前期文献^{［13，14］}：造模组大鼠体质量超过正常组平均体质量1.4倍标准差，或两组腹围差异有统计学意义；符合上述条件后，若造模组FBG升高、TG升高、HDL降低、HOMA-IR异常，与正常组差异具有统计学意义，并出现体型肥胖、精神萎靡、倦怠懒动、毛色晦暗、大便粘腻等证候表现，即表明MS痰证大鼠模型复制成功。诱导过程中造模组大鼠死亡2只，6只造模不成功，故予以剔除。将24只造模成功的大鼠按随机数字表法分为模型组、温胆汤组、二甲双胍组，8只/组。大鼠的给药剂量按等效剂量系数折算法，约为人类给药剂量的6.3倍^［15］。温胆汤组予温胆汤3.6 g·kg^-1·d^-1灌胃，二甲双胍组予二甲双胍0.1 g·kg^-1·d^-1灌胃，模型组及正常组予等量的生理盐水灌胃，连续干预4周。给药期间正常组继予普通饲料喂养，其余各组均予高脂高糖高盐饲料喂养。

1.2.2 样本采集

造模期间，每5周进行尾静脉采血。末次干预后，禁食不禁水12 h，麻醉后腹主动脉采血，离心（4 ℃，3000 r/min，15 min），取上清。迅速找到回盲部，采集盲肠内容物后立即装入无菌冻存管中，液氮速冻。剥离肝脏、回肠组织，用生理盐水冲洗干净，将肝脏组织切成大小均匀的小块并用4%多聚甲醛固定24 h，其余肝脏组织、回肠组织分装于冻存管中。病理组织样本置于4 ℃保存，血清、盲肠内容物、肝脏、回肠组织样本均置于-80 ℃保存。

1.2.3 一般情况观察及相关指标测定

观察各组大鼠造模前后及干预后的精神状态、活动情况、毛色的光泽度、二便、体质量、体长、腹围；采用血糖试纸检测大鼠FBG，ELISA检测大鼠血清FINS、LPS水平，全自动生化分析仪检测TG、TC、HDL、LDL水平，以上操作步骤均严格按照试剂盒说明书执行。

1.2.4 HE染色观察肝脏组织病理学改变

将固定后的组织经乙醇梯度脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、组织切片、摊片、捞片、烤片后，进行脱蜡、HE染色、中性树胶封片，最后置于光学显微镜下观察组织的病理变化。

1.2.5 Western blotting检测

提取肝脏、回肠组织中蛋白，BCA测定蛋白浓度。采用全自动蛋白分离试剂盒进行实验，GAPDH、FXR、CYP7A1、FGFR4、FGF15一抗稀释比例分别为1∶2000、1∶50、1∶500、1∶1000、1∶1000，蛋白定量分析使用Wes全自动蛋白质表达定量分析系统，运用Compass for SW软件对结果进行成像、分析。

1.2.6 盲肠内容物肠道菌群测序分析

对收集的盲肠内容物进行总DNA提取及质检。引物合成由上海百趣生物医学科技有限公司进行，对16S V3-V4区进行PCR扩增，上游引物为341F（5'-CCTACGGGNGGCWGC AG-3'），下游引物为805R（5'-GACTACHVGGGTATC TAATCC-3'）。扩增产物采用凝胶电泳检测后，使用AMPure XT beads对其目的片段进行回收，随后使用荧光计Qubit进行定量分析，构建文库并利用Illumina MiSeq平台进行测序。

1.2.7 UHPLC-MS/MS分析血清胆汁酸含量

以69种胆汁酸标准品建立绝对定量标准曲线，进行UHPLC-MS/MS分析。对末次腹主动脉采血收集的大鼠血清样本进行代谢物提取，取100 μL样品于微型离心管中，加入400 μL提取液后涡旋30 s混匀，超声10 min，放入-40 ℃冰箱静置1 h，离心（4 ℃，12 000 r/min，15 min），取上清置于LC进样瓶中备用。称取相应量的标准品配制为1 mg/mL的标准品储备液。流动相条件为Waters ACQUITY UPLC BEH C18 （150 ×2.1 mm， 1.7 μm， Waters），液相色谱A相为5 mmol/L的乙酸铵水溶液，B相为乙腈。柱温箱45 ℃，样品盘4 ℃，进样体积为1 μL。质谱条件：使用Orbitrap Exploris 120高分辨质谱仪，并通过平行反应监测模式对样品中化合物的物质信息进行质谱分析。具体检测委托上海百趣生物医学科技有限公司执行。

1.3 统计学分析

采用SPSS 24.0软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料用均数±标准差表示，两组计量资料比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析；方差齐时多重比较采用LSD检验，方差不齐时采用 Games-Howell检验。若数据不符合正态分布则用中位数（四分位间距）表示，两组间比较采用Mann-Whitney U，多组间比较采用Kruskal-Wallis，以P<0.05为差异有统计学意义。所有实验均独立重复3次。

2 结果

2.1 大鼠一般情况及相关指标观察

2.1.1 造模后两组大鼠比较

造模前两组大鼠毛色、二便、活动状况、体质量等差异无统计学意义。随着造模周期的增加，与正常组相比，造模组大鼠逐渐出现体型、精神状态、毛色、饮水量、二便等不同程度的变化。于第15周末造模结束，共24只大鼠造模成功。与正常组相比，造模组大鼠出现精神萎靡，毛色晦暗，饮水量大，大便黏腻异味重，懒动等，体质量、腹围、Lee's指数、TG、TC、LDL、FBG、FINS、HOMA-IR均升高（P<0.05，P<0.01），HDL降低（P<0.01，表1）。

2.1.2 干预后对大鼠的影响

经药物干预4周后，温胆汤组及二甲双胍组大鼠体型、精神状况、皮毛光泽度、活动度、二便等情况有所改善，但与正常组大鼠相比仍有一定差异。与正常组相比，模型组大鼠腹围、Lee's指数、TG、TC、LDL、FBG、FINS、HOMA-IR、LPS均升高（P<0.01），HDL降低（P<0.01），体质量有升高趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）。与模型组相比，各给药组大鼠体质量、腹围、Lee's指数、TG、TC、LDL、FBG、HOMA-IR、LPS降低（P<0.05，P<0.01），HDL升高（P<0.01），温胆汤组FINS降低（P<0.01），二甲双胍组FINS有降低趋势，但差异无统计学意义（表2）。

2.2 对大鼠肝脏组织形态的影响

HE染色结果显示：正常组大鼠肝细胞结构清晰，放射状排列呈肝索状，胞质均匀，胞核大小形态正常，位置居中；模型组大鼠肝细胞轮廓不清晰，排列杂乱，胞质中可见大量大小不一的脂滴空泡填充，胞核出现明显的压缩、位移，大量肝细胞变性、坏死；与模型组相比，各给药组大鼠肝细胞脂滴空泡减少，肝细胞脂肪变性明显改善，细胞结构相对清晰，排列较整齐（图1）。

2.3 对大鼠肝脏FXR、CYP7A1、FGFR4及回肠FXR、FGF15蛋白表达的影响

与正常组相比，模型组大鼠肝脏FXR、FGFR4及回肠FXR、FGF15蛋白表达降低（P<0.01），CYP7A1蛋白表达升高（P<0.01）。与模型组相比，各给药组大鼠肝脏FXR、FGFR4和回肠FXR、FGF15蛋白表达均升高（P<0.05，P<0.01），温胆汤组大鼠肝脏中CYP7A1蛋白表达降低（P<0.01），二甲双胍组大鼠肝脏CYP7A1蛋白表达呈降低趋势，但差异无统计学意义（表3、4，图2、3）。

2.4 对肠道菌群结构的影响

2.4.1 α多样性分析

与正常组相比，模型组大鼠Chao1、Observed species、shannon指数均降低（P<0.01，P<0.05），simpson指数呈降低趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）；与模型组相比，温胆汤组及二甲双胍组大鼠的Chao1、Observed species、shannon、simpson差异无统计学意义（P>0.05，表5）。

2.4.2 β多样性分析

基于weighted UniFrac距离矩阵的非度量多维尺度分析与主坐标分析结果显示，模型组与正常组大鼠菌群距离较大，而正常组、温胆汤组、二甲双胍组大鼠菌群的组内与组间距离相近，微生物组成结构具有一定的相似性（图4）。

2.4.3 物种组成分析

根据物种丰度表和物种注释表，选取丰度前30的物种分类进行门、属水平上的丰度分析（图5）。结果显示，在门水平上，厚壁菌门、拟杆菌门占比最大。与正常组相比，模型组厚壁菌门丰度降低（P<0.01），拟杆菌门丰度增加（P<0.05）；与模型组相比，温胆汤组厚壁菌门丰度增加（P<0.01），拟杆菌门丰度降低（P<0.01，表6）。在属水平上，与正常组相比，模型组Lachnospiraceae_NK4A136_group相对丰度降低（P<0.01），巨单胞菌属、拟杆菌属相对丰度增加（P<0.01）。与模型组相比，温胆汤组拟杆菌属相对丰度降低（P<0.01），Lachnospiraceae_NK4A136_group相对丰度升高（P<0.05），巨单胞菌属相对丰度呈降低趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）；二甲双胍组Lachnospiraceae_NK4A136_group、巨单胞菌属、拟杆菌属相对丰度差异无统计学意义（P>0.05，表7）。

2.4.4 LEfSe差异分析

在门、纲、目、科、属、种分类水平上共有76个显著差异菌。属水平上共有16个，其中正常组中包括Lachnospiraceae_NK4A136_group、杜博氏菌属、瘤胃球菌属等6个差异菌属；模型组包括拟杆菌属、梭杆菌属、 考拉杆菌属等5个差异菌属；温胆汤组包括Ligilactobacillus属、异杆菌属2个显著差异菌属；二甲双胍组中包括螺杆菌属、巨单胞菌属、阿克曼菌属3个显著差异菌属（图6）。

2.5 对MS痰证大鼠胆汁酸的影响

2.5.1 PCA分析

结果显示，正常组与模型组距离较远，分离趋势明显，提示MS痰证模型会影响大鼠正常的胆汁酸组成；而各药物组与模型组的样本分布点部分重合，需进一步分析来评估组间的差异（图7）。

2.5.2 OPLS-DA分析

模型组与正常组各自聚集，组间分离趋势显著；温胆汤组与模型组呈现各自聚集趋势，但组间存在部分区域重叠；二甲双胍组与模型组同样各自聚集，组间距离显著。为防止模型过拟合，通过200次置换检验对OPLS-DA模型进行验证，显示模型组与正常组模型Q²=-1.38，温胆汤组与模型组Q²=-0.73，二甲双胍组与模型组Q²=-1.30（图8）。以上置换检验Q²均为负数，回归线斜率均大于0，OPLS-DA 模型较为稳健，且各组间存在一定的区分度。

2.5.3 差异胆汁酸分析

胆汁酸靶向代谢组学共检出54种胆汁酸成分，经差异代谢物的层次聚类分析发现，4组之间主要有20种差异胆汁酸，其中鼠脱氧胆酸、异猪去氧胆酸、猪脱氧胆酸、12-酮基石胆酸、6-酮石胆酸、脱氧胆酸差异较为显著。与正常组相比，模型组中鼠脱氧胆酸、异猪去氧胆酸、猪脱氧胆酸、12-酮基石胆酸、6-酮石胆酸、脱氧胆酸相对表达量均降低（P<0.05）；各药物干预后上述胆汁酸相对表达量均有回调趋势（图9、10）。

正常组和模型组中筛选出28种差异表达的胆汁酸成分，其中15种胆汁酸差异胆汁酸在模型组中含量高于正常组，13种差异胆汁酸在模型组中含量低于正常组。模型组和温胆汤组中共筛选到7种大鼠血清差异胆汁酸，它们在温胆汤组中含量均高于模型组；模型组和二甲双胍组中共筛选到21种大鼠血清差异胆汁酸，其中19种差异胆汁酸在二甲双胍组中含量高于模型组，2种差异胆汁酸在二甲双胍组中含量低于模型组。通过对正常组、模型组、二甲双胍组大鼠血清差异胆汁酸取交集，共筛选出9个共同差异胆汁酸，发现仅有12-酮基石胆酸、异猪去氧胆酸、猪脱氧胆酸、脱氧胆酸这4个差异胆汁酸在模型组与二甲双胍组中含量呈相反趋势（其余共同差异胆汁酸在模型组、二甲双胍组中均升高，不具有对比意义）。与正常组相比，这4个共同差异胆汁酸在模型组中均降低（P<0.05）；与模型组相比，4个共同差异胆汁酸在二甲双胍组中含量均升高（P<0.05）。对正常组、模型组、温胆汤组大鼠血清差异胆汁酸取交集，共筛选出2个共同差异胆汁酸，分别为异猪去氧胆酸、甘氨猪脱氧胆酸，其中异猪去氧胆酸也是正常组、模型组、二甲双胍组3组间的共同差异胆汁酸。与正常组相比，2个共同差异胆汁酸在模型组中均降低（P<0.05）；与模型组相比，2个共同差异胆汁酸在温胆汤组中含量均升高（P<0.05）。

2.6 肠道菌群-胆汁酸相关性分析

将厚壁菌门、拟杆菌门、Lachnospiraceae_NK4A136_group、巨单胞菌属、拟杆菌属与异猪去氧胆酸、猪脱氧胆酸进行相关性分析，结果显示，厚壁菌门、Lachnospiraceae_NK4A136_group与异猪去氧胆酸、猪脱氧胆酸含量呈正相关（P<0.01），拟杆菌门、巨单胞菌属、拟杆菌属与异猪去氧胆酸、猪脱氧胆酸含量呈负相关（P<0.01，P<0.05，表8，图11）。

3 讨论

MS归属于中医学中“痰”、“肥满”、“脂浊”等范畴，其形成有外因与内因之分。外因则与饮食失调、运动过少有关：过食肥甘厚味或久坐不动，损伤脾胃，升降失常，运化失职，津停为饮，饮聚成痰；内因与脾、肾功能失调有关：脾失健运，肾失蒸腾，津液代谢失常，痰湿内生。痰是人体津液代谢障碍所产生的一种病理产物，会导致各脏腑系统功能的紊乱，由于MS的病变涉及各脏腑系统，因此痰被认为是引起MS发病的重要原因。温胆汤以化痰降浊、理气和胃为主要功效，方中半夏、竹茹清热燥湿化痰，枳实、陈皮理气行滞化痰，茯苓利湿健脾，甘草缓急和中。诸药合用，旨在化痰降浊，理气和胃，以期达到标本兼治的目的。MS中各组代谢紊乱均与慢性炎症相关。研究显示，肠道微生物群可将膳食纤维代谢合成为短链脂肪酸^［16］，这些短链脂肪酸为肠上皮细胞提供能量，并在保护肠粘膜屏障、抑制肠道炎症以及参与脂质代谢等方面发挥关键作用^{［17，18］}。长期的高脂、低纤维饮食习惯会致使肠道微环境稳态发生变化，进而引起短链脂肪酸合成减少、肠上皮屏障功能障碍以及有害细菌过度生长，并产生LPS等微生物衍生物，这些微生物衍生物可通过不完整的肠道屏障进入循环，促进多种炎性细胞因子的产生，使机体处于可持续的慢性低度炎症状态^［19］。本实验结果与上述文献研究结果一致，在长期喂养高脂高糖高盐饲料的MS痰证大鼠血清中，LPS水平较正常组大鼠显著升高，并出现糖脂代谢紊乱等表征，而经温胆汤干预后显著改善了MS痰证大鼠的代谢表征，并降低了体内LPS的水平，提示温胆汤可显著缓解MS痰证大鼠的机体炎症反应。

本研究运用16S rDNA高通量测序及胆汁酸靶向代谢组学技术分别对MS痰证大鼠盲肠内容物、血清样本进行检测，分析MS痰证大鼠肠道菌群、胆汁酸谱的变化情况。结果发现，MS痰证大鼠肠道菌群丰富度及多样性明显降低，表明造模后大鼠的肠道菌群原有的结构遭到一定的破坏，运用温胆汤干预后，肠道菌群丰富度及多样性有进一步降低的趋势，可能由温胆汤的抑菌、抗炎作用所致^［20］。据报道，在肥胖儿童肠道菌群中，其拟杆菌门相对丰度升高，厚壁菌门相对丰度降低^［21］。厚壁菌门中多数有益菌可产生乙酸盐等物质，为肠道细胞提供能量，防止病原体干扰机体健康^［22］，而拟杆菌门中某些菌群参与蛋白质分解过程中有毒产物的释放，如氨、硫化氢等，对肠黏膜产生毒性，可进一步加剧机体炎症反应^［23］。已有研究证实Lachnospiraceae_NK4A136_group可通过发酵膳食多糖产生短链脂肪酸来增强肠道上皮屏障的完整性和抑制机体炎症反应，与多种代谢性疾病和慢性炎症呈负相关^［24］。巨单胞菌属是一种主要在肥胖人群中富集的菌群，可通过降解肌醇来促进肠道对脂质的吸收^［25］。拟杆菌属既可引起机体严重感染，又可对病原体产生抗药性^［26］。本研究与上述研究结果相符，在门水平上，MS痰证大鼠厚壁菌门相对丰度降低，拟杆菌门相对丰度增加，经温胆汤干预后逆转了这一现象。在属水平上，MS痰证大鼠巨单胞菌属、拟杆菌属相对丰度显著增加，Lachnospiraceae_NK4A136_group相对丰度显著降低，给予温胆汤干预后拟杆菌属相对丰度显著降低、Lachnospiraceae_NK4A136_group相对丰度显著升高，而巨单胞菌属相对丰度也呈降低的趋势。由此可见，温胆汤可能通过增加MS痰证大鼠的优势菌群丰度，从而降低机体炎症反应、改善糖脂代谢紊乱。

胆汁酸是由肝脏中的胆固醇代谢产生的，并由肠道微生物群进一步代谢合成次级胆汁酸。FXR、CYP7A1、FGF15、FGFR4作为胆汁酸负反馈调节通路，可以抑制胆汁酸合成，维持体内的胆汁酸稳态，调整胆固醇代谢紊乱，升高胰岛素敏感性，降低机体炎症反应等。FXR作为胆汁酸的受体和生物感受器，在肝脏、回肠组织中高表达，是肝脏各种代谢过程的重要调节因子，可通过激活肝细胞中的FXR来抑制CYP7A1的表达，从而预防各种代谢疾病。FGF15在胆汁酸合成、脂肪代谢中具有重要调节作用，能够促进机体能量消耗，改善胰岛素抵抗^［27］。在回肠中，FXR主要通过促使FGF15的分泌，并与肝脏中的FGFR4结合，下调CYP7A1表达，进而抑制肝脏内胆汁酸的合成，防止胆汁酸过度积累^［28］。研究发现，猪胆酸种类（HCAs）的胆汁酸的血清浓度降低与2型糖尿病的形成密切相关，且受肠道微生物群的调控，可通过激活G蛋白偶联BA受体与FXR来上调胰高血糖素样肽-1的水平，改善机体糖代谢紊乱^［29］。本研究发现，MS痰证大鼠中HCAs胆汁酸含量降低，且胆汁酸负反馈调节功能也受到显著抑制，肠道中胆汁酸的重吸收降低，进而经肝-肠循环到达肝脏中的胆汁酸减少，导致肝脏中胆汁酸合成代偿性增加，破坏了体内胆汁酸的稳态，导致机体出现糖、脂代谢紊乱，肝脂肪变性，慢性低度炎症等。经温胆汤干预后，回调了大鼠中胆汁酸负反馈调节功能，并增加了异猪去氧胆酸、甘氨猪脱氧胆酸等HCAs胆汁酸的含量，促进了肠道胆汁酸重吸收，减少肝脏中新的胆汁酸合成。由此可见，温胆汤可以通过激活大鼠中胆汁酸负反馈调节通路，调节机体代谢紊乱，维持体内胆汁酸稳态。

近年来研究已证实肠道菌群-胆汁酸之间具有交互作用。肠道微生物群在肠道中经多种形式的作用将初级胆汁酸转化为次级胆汁酸，而胆汁酸也通过促进具有胆汁酸代谢酶的菌群生长及抑制具有胆汁敏感性的菌群生长来维持肠道微生态平衡，二者互相保持动态平衡的状态，若一方平衡遭到破坏则会影响另一方的稳定^{［30， 31］}。研究发现，厚壁菌门经脱羟基化作用产生次级胆汁酸，次级胆汁酸又通过FXR途径来调节机体胆固醇含量和脂类代谢，改善高胆固醇血症，并维持肠道微生物平衡^［32］。本实验相关性分析结果揭示了厚壁菌门、Lachnospiraceae_NK4A136_group与异猪去氧胆酸、猪脱氧胆酸含量之间存在正相关关系，而拟杆菌门、巨单胞菌属、拟杆菌属与异猪去氧胆酸、猪脱氧胆酸含量呈负相关关系，该结果证实了肠道微生物群紊乱与胆汁酸代谢失衡之间密切相关。

综上所述，本研究表明高脂高糖高盐饮食联合一次性低剂量腹腔注射链脲佐菌素能够成功复制MS痰证大鼠模型；以方测证运用温胆汤干预后，可显著改善MS痰证大鼠全身炎症水平及糖脂代谢紊乱，其作用机制可能与调节肠道菌群-胆汁酸轴功能密切相关。温胆汤或通过介导FXR信号通路，调整MS痰证大鼠肠道菌群结构，维持胆汁酸稳态，从而改善MS痰证。

参考文献

[1] Cornier MA, Dabelea D, Hernandez TL, et al. The metabolic syndrome[J]. Endocr Rev, 2008, 29(7): 777-822. doi：10.1210/er.2008-0024

[2] Belladelli F, Montorsi F, Martini A. Metabolic syndrome, obesity and cancer risk[J]. Curr Opin Urol, 2022, 32(6): 594-7. doi：10.1097/mou.0000000000001041

[3] Gesteiro E, Megía A, Guadalupe-Grau A, et al. Early identification of metabolic syndrome risk: a review of reviews and proposal for defining pre-metabolic syndrome status[J]. Nutr Metab Cardiovasc Dis, 2021, 31(9): 2557-74. doi：10.1016/j.numecd.2021.05.022

[4] Ussar S, Griffin NW, Bezy O, et al. Interactions between gut microbiota, host genetics and diet modulate the predisposition to obesity and metabolic syndrome[J]. Cell Metab, 2015, 22(3): 516-30. doi：10.1016/j.cmet.2015.07.007

[5] Li T, Chiang JY. Bile acid signaling in metabolic disease and drug therapy[J]. Pharmacol Rev, 2014, 66(4): 948-83. doi：10.1124/pr.113.008201

[6] 庄耀东, 高碧珍, 王永发, 等. 代谢综合征“痰证” 的病位、病性兼杂特征及与胰岛素抵抗、生化指标的相关性研究[J]. 中华中医药杂志, 2017, 32(2): 546-8.

[7] 庄耀东, 王永发, 陈晓红, 等. 代谢综合征痰证与胰岛素抵抗指数、血脂及BMI的相关性研究[J]. 中医药临床杂志, 2016, 28(11): 1600-2. doi：10.16448/j.cjtcm.2016.0563

[8] 熊红萍，李灿东，高碧珍，等. 代谢综合征的中医痰证病理与血糖、血胰岛素及胰岛素抵抗的相关性研究[J]. 中华中医药杂志, 2010, 25(5): 763-5.

[9] 代谢综合征病证结合诊疗指南[J]. 世界中医药, 2023, 18(22): 3157-66.

[10] 陈珍真, 康 洁, 郭屿洵, 等. 温胆汤干预大鼠代谢综合征的研究[J]. 中华中医药杂志, 2018, 33(4): 1373-6.

[11] Wanrooy BJ, Kumar KP, Wen SW, et al. Distinct contributions of hyperglycemia and high-fat feeding in metabolic syndrome-induced neuroinflammation[J]. J Neuroinflammation, 2018, 15(1): 293. doi：10.1186/s12974-018-1329-8

[12] 曹 彬. 二陈汤合桃红四物汤干预痰瘀互结证代谢综合征大鼠血清代谢组学研究[D]. 沈阳: 辽宁中医药大学, 2017.

[13] 陈珍真，甘慧娟，康 洁，等. 大鼠代谢综合征痰证造模方法探究[J]. 辽宁中医药大学学报, 2017, 19(11): 75-8.

[14] 魏 佳, 曾华霖, 林书颖, 等. 代谢综合征痰证大鼠模型建立与评价的实验研究[J]. 辽宁中医杂志, 2022, 49(6): 195-9. doi：10.13192/j.issn.1000-1719.2022.06.054

[15] 魏伟, 吴希美, 李元建. 药理实验方法学[M]. 4版. 北京: 人民卫生出版社, 2010: 69-73.

[16] Li WB, Fu XY, Lin D, et al. Conjugated linoleic acid alleviates glycolipid metabolic disorders by modulating intestinal microbiota and short-chain fatty acids in obese rats[J]. Food Funct, 2023, 14(3): 1685-98. doi：10.1039/d2fo03760b

[17] Ahmed H, Leyrolle Q, Koistinen V, et al. Microbiota-derived metabolites as drivers of gut-brain communication[J]. Gut Microbes, 2022, 14(1): 2102878. doi：10.1080/19490976.2022.2102878

[18] 王 丽，张之豪，李燕春. 代谢综合征与肠道菌群关系及有氧运动干预效果机制[J]. 中国生物化学与分子生物学报, 2024, 40(11):1504-12. doi：10.13865/j.cnki.cjbmb.2024.08.1148

[19] Cani PD, Amar J, Iglesias MA, et al. Metabolic endotoxemia initiates obesity and insulin resistance[J]. Diabetes, 2007, 56(7): 1761-72. doi：10.2337/db06-1491

[20] 王家豪，花海兵，薛 昊，等. 古代经典名方温胆汤的研究进展及质量标志物的预测分析[J]. 世界科学技术-中医药现代化, 2024, 26(06): 1528-36. doi：10.11842/wst.20230302003

[21] Quiroga R, Nistal E, Estébanez B, et al. Exercise training modulates the gut microbiota profile and impairs inflammatory signaling pathways in obese children[J]. Exp Mol Med, 2020, 52(7): 1048-61. doi：10.1038/s12276-020-0459-0

[22] White BA, Lamed R, Bayer EA, et al. Biomass utilization by gut microbiomes[J]. Annu Rev Microbiol, 2014, 68: 279-96. doi：10.1146/annurev-micro-092412-155618

[23] Shin JH, Tillotson G, MacKenzie TN, et al. Bacteroides and related species: The keystone taxa of the human gut microbiota[J]. Anaerobe, 2024, 85: 102819. doi：10.1016/j.anaerobe.2024.102819

[24] Ma L, Ni Y, Wang Z, et al. Spermidine improves gut barrier integrity and gut microbiota function in diet-induced obese mice[J]. Gut Microbes, 2020, 12(1): 1-19. doi：10.1080/19490976.2020.1832857

[25] Wu C, Yang FM, Zhong HZ, et al. Obesity-enriched gut microbe degrades myo-inositol and promotes lipid absorption[J]. Cell Host Microbe, 2024, 32(8): 1301-14. e9. doi：10.1016/j.chom.2024.06.012

[26] Mandal RK, Mandal A, Denny JE, et al. Gut Bacteroides act in a microbial consortium to cause susceptibility to severe malaria[J]. Nat Commun, 2023, 14(1): 6465. doi：10.1038/s41467-023-42235-0

[27] Owen BM, Mangelsdorf DJ, Kliewer SA. Tissue-specific actions of the metabolic hormones FGF15/19 and FGF21[J]. Trends Endocrinol Metab, 2015, 26(1): 22-9. doi：10.1016/j.tem.2014.10.002

[28] Zhou X, Cao L, Jiang C, et al. PPARα-UGT axis activation represses intestinal FXR-FGF15 feedback signalling and exacerbates experimental colitis[J]. Nat Commun, 2014, 5: 4573. doi：10.1038/ncomms5573

[29] Zheng XJ, Chen TL, Jiang RQ, et al. Hyocholic acid species improve glucose homeostasis through a distinct TGR5 and FXR signaling mechanism[J]. Cell Metab, 2021, 33(4): 791-803.e7. doi：10.1016/j.cmet.2020.11.017

[30] Watanabe M, Fukiya S, Yokota A. Comprehensive evaluation of the bactericidal activities of free bile acids in the large intestine of humans and rodents[J]. J Lipid Res, 2017, 58(6): 1143-52. doi：10.1194/jlr.m075143

[31] 何 萍, 林以宁. 肠道菌群和胆汁酸在非酒精性脂肪肝性病中的交互作用[J]. 药学研究, 2021, 40(5): 316-8, 338. doi：10.13506/j.cnki.jpr.2021.05.007

[32] Wahlström A, Sayin SI, Marschall HU, et al. Intestinal crosstalk between bile acids and microbiota and its impact on host metabolism[J]. Cell Metab, 2016, 24(1): 41-50. doi：10.1016/j.cmet.2016.05.005

基金资助

福建省自然科学基金(2022J01361)

第五批全国中医临床优秀人才研修项目(国中医药人教函[2022]239号)

福建中医药大学校管科研课题(XJC2023004)

RIGHTS & PERMISSIONS

版权所有©《南方医科大学学报》编辑部2021