双术汤通过P53/SLC7A11/GPX4通路诱导胃癌细胞铁死亡

Shuangshu Decoction inhibits growth of gastric cancer cell xenografts by promoting cell ferroptosis via the P53/SLC7A11/GPX4 axis

摘要

目的 探讨双术汤调控胃癌铁死亡的机制。 方法 基于网络药理学筛选双术汤与胃癌铁死亡的共同靶点，通过生物信息学分析（差异基因、HPA数据库、生存分析）及分子对接验证核心靶点。细胞实验分为对照组（未经任何干预的AGS细胞） 、双术汤组（经双术汤含药血清干预的AGS细胞）、双术汤+铁死亡抑制剂组Fer-1（经双术汤含药血清和铁死亡抑制剂Fer-1共同干预的AGS细胞）、铁死亡抑制剂组（仅经Fer-1干预的AGS细胞）4组，检测细胞活力、铁死亡相关指标（活性氧、铁离子、谷胱甘肽）、P53/SLC7A11/GPX4表达水平及线粒体形态的改变。动物实验分为对照组（生理盐水灌胃）、双术汤组（双术汤灌胃）、双术汤+Fer-1组（双术汤灌胃+腹腔注射Fer-1）、Fer-1组（腹腔注射Fer-1），检测裸鼠肿瘤体积与质量、HE染色评估肿瘤病理情况，评估P53/SLC7A11/GPX4表达水平。 结果 双术汤主要活性成分为槲皮素、汉黄芩素，与核心靶点P53结合紧密。双术汤能够抑制AGS细胞增殖，以高剂量浓度的抑制作用最明显（P<0.05）；与对照组及双术汤+Fer-1组比较，双术汤组ROS和Fe²⁺均升高（P<0.05），P53蛋白及mRNA表达水平升高，SLC7A11、GPX4蛋白及基因水平降低（P<0.05）；与双术汤组相比，Fer-1组ROS和Fe ²⁺ 均降低（P<0.05），P53蛋白及mRNA表达水平降低（P<0.05），SLC7A11、GPX4蛋白、基因水平升高（P<0.05）。对照组线粒体形态正常，双术汤组线粒体皱缩、嵴模糊甚至消失、膜密度升高；双术汤+Fer-1组线粒体损伤程度较前减轻，Fer-1组线粒体形态与对照组相似。双术汤组肿瘤体积和质量低于对照组（P<0.05），肿瘤排列紊乱并出现坏死，而联合Fer-1后坏死减轻。与对照组相比，双术汤组P53蛋白及mRNA表达升高，SLC7A11和GPX4蛋白及基因表达降低（P<0.05）；与双术汤组相比，双术汤+Fer-1组ROS和Fe²⁺水平降低（P<0.05），P53表达下降，SLC7A11和GPX4表达升高（P<0.05）。 结论 双术汤能够抑制胃癌皮下移植瘤及胃癌细胞生长，其机制与P53/SLC7A11/GPX4轴诱导胃癌铁死亡有关。

Abstract

Objective To explore the mechanism of Shuangshu Decoction (SSD) for inhibiting growth of gastric cancer xenografts in nude mice. Methods Network pharmacology analysis was conducted to identify the common targets of SSD and gastric cancer cell ferroptosis, and bioinformatics analysis and molecular docking were used to validate the core targets. In the cell experiment, AGS cells were treated with SSD-medicated serum, Fer-1 (a ferroptosis inhibitor), or both, and the changes in cell viability, ferroptosis markers (ROS, Fe²⁺ and GSH), expressions of P53, SLC7A11 and GPX4, and mitochondrial morphology were examined. In a nude mouse model bearing gastric cancer xenografts, the effects of gavage with SSD, intraperitoneal injection of Fer-1, or their combination on tumor volume/weight, histopathology, and expressions of P53, SLC7A11 and GPX4 levels were evaluated. Results The active components in SSD (quercetin and wogonin) showed strong binding affinities to P53. In AGS cells, SSD treatment dose-dependently inhibited cell proliferation, increased ROS and Fe²⁺ levels, upregulated P53 expression, and downregulated the expressions of SLC7A11 and GPX4, but these effects were effectively attenuated by Fer-1 treatment. SSD also induced mitochondrial shrinkage and increased the membrane density, which were alleviated by Fer-1. In the tumor-bearing mouse models, gavage with SSD significantly reduced tumor size and weight, caused tumor cell necrosis, upregulated P53 and downregulated SLC7A11 and GPX4 expression in the tumor tissue, and these effects were obviously mitigated by Fer-1 treatment. Conclusion SSD inhibits gastric cancer growth in nude mice by inducing cell ferroptosis via the P53/SLC7A11/GPX4 axis.

Graphical abstract

关键词

胃癌 / 网络药理学 / 生物信息学 / 分子对接 / 双术汤 / 铁死亡 / P53/SLC7A11/GPX4通路

Key words

gastric cancer / network pharmacology / bioinformatics / molecular docking / Shuangshu Decoction / ferroptosis / P53/SLC7A11/GPX4 pathway

胃癌是全球高发的消化道恶性肿瘤^［1］，在中国尤为高发^［2］。尽管现有治疗手段多样^［3］，但该病早期诊断率低、术后复发率高、化疗耐药性强^［4-6］，导致疗效局限，亟需开发新药物以改善患者预后。铁死亡作为一种依赖铁离子积累和脂质过氧化物生成的细胞死亡方式，为肿瘤治疗提供了新方向。在铁死亡过程中，细胞内铁离子水平升高，导致ROS大量生成，同时谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）被活性氧耗竭，脂质代谢产物积累使细胞走向死亡^{［7， 8］}。尽管Erastin作为铁死亡诱导剂已被用于肿瘤治疗，但其脱靶效应显著^［9-11］，因此开发新的高效药物势在必行。中药因其多成分、多靶点、毒副作用低的特点，在肿瘤治疗中展现出独特的优势^［12-14］。研究报道，通过抑制GPX4活性、促进脂质过氧化物蓄积能够抑制胃癌细胞增殖及逆转耐药^{［15， 16］}。

双术汤是桂派名老中医秦家泰教授的经验方，由13味中药组成，具有健脾理气、化湿和胃之效，临床用于癌症防治已有20余年，疗效显著^［17-19］。然而，由于双术汤药味繁多，其作用机制尚未完全阐明。网络药理学研究表明，双术汤可能通过其主要活性成分槲皮素和汉黄芩素诱导铁死亡发挥抗肿瘤作用^［20-22］。因此，本研究从铁死亡的角度出发，结合网络药理学及分子对接、生物信息学、体内外实验验证，系统探讨双术汤防治胃癌的作用机制，揭示双术汤的多靶点作用网络，为名老中医学术经验的推广提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 双术汤活性成分及靶点的获取

利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）（筛选标准为OB≥30%和DL≥0.18）、HERB数据库（HERB.ac.cn）得到中药有效成分，上述得到数据后经Swiss、UniProt数据库校正，筛选出最终的靶点，将靶点转换为基因名。

1.2 胃癌差异表达基因和铁死亡基因的获取

使用R语言“DESeq2”R包分析胃癌与正常组织中m RNA表达差异，筛选|log2（fold change，FC）|>2且P<0.05的基因，并通过火山图进行差异可视化，从铁死亡基因数据库（FerrDb；www.zhounan.org）获得铁死亡基因。

1.3 交集靶点的获取

将胃癌差异基因、铁死亡基因、双术汤靶点三者取交集，并利用微生信平台（www.bioinformatics.com.cn）绘制韦恩图。

1.4 蛋白质-蛋白质（PPI）网络构建

将交集基因输入蛋白互作数据库STRING（search tool for the retrieval of interacting genes/proteins）平台，设置中等置信度阈值，构建PPI网络；导入Cytoscape根据degree值选择关键靶点。

1.5 生存分析及免疫组织化学分析

根据肿瘤蛋白P53（P53）表达中位数将患者分为高、低表达组。使用R语言中的survival包和survminer包绘制Kaplan-Meier生存曲线，比较P53高低表达组患者的生存差异。使用The Human Protein Atlas project 数据库（https：//www，proteinatlas.org/），查询免疫组织化学（IHC）明确交集基因在人类正常胃组织和胃癌组织的表达。

1.6 分子对接

采用分子对接软件AutoDock Vina验证双术汤活性成分与关键铁死亡靶点相互作用。

1.7 实验动物与饲养管理

无特定病原体动物级SD雄性大鼠20只用于制备含药血清，4周龄裸鼠12只，由湖南省斯莱克景达实验动物有限公司提供 （实验动物合格证号：430727231103594983，实验动物饲养生产许可证号为SYXK桂2024-0004号），于广西中医药大学内进行实验。常规分笼饲养，自由饮水进食，人工光照，12 h的明暗周期。饲养室温度为20~25 ℃，相对湿度为40%~70%。实验程序符合动物研究伦理原则，并得到广西中医药大学实验伦理委员会的批准（伦理批号：DW20240507-099）。

1.8 细胞株

人胃癌AGS细胞，购自普诺赛公司（CL-0022，230911041801）。

1.9 药物与试剂

双术汤组成包括麸炒苍术20 g，白术20 g、石斛15 g，姜半夏10 g，茯苓15 g，陈皮10 g，厚朴10 g、生鸡内金15 g、六神曲15 g、川楝子10 g，炒麦芽15 g，焦山楂15 g，延胡索10 g，药材饮片由广西中医药大学第一附属医院提供并煎煮，由唐春丽主任中药师鉴定。焦山楂、白术、六神曲、茯苓、厚朴、陈皮、延胡索（广西仙茱中药科技有限公司），姜半夏、生鸡内金、川楝子（四川新荷花中药饮片股份有限公司），炒麦芽、麸炒苍术、石斛（广西宝正药业有限公司）。CCK8试剂盒（苏州优逸兰迪生物科技有限公司）、Ham's F-12K培养基（普诺赛公司）、铁死亡抑制剂（Fer-1）、二乙酸酯（H2DCFDA） 活性氧荧光探针（MCE）、铁离子试剂盒（伊莱瑞特）、谷胱甘肽试剂盒（南京建成）、总蛋白定量测试盒（BCA法）（碧云天）、cDNA反转录试剂盒、SYBR扩增试剂盒（TOLOBIO生化科技有限公司）、GPX4一抗、山羊抗兔IgG（H+L）二抗HRP、蛋白maker（武汉三鹰生物技术有限公司）、β-肌动蛋白（β-actin）、P53、SLC7A11一抗（武汉赛维尔生物科技有限公司）、高效RIPA裂解液（上海雅酶生物医药科技有限公司）。电镜固定液（Servicebio）、无水乙醇、丙酮、柠檬酸三钠（国药集团化学试剂有限公司）、812 包埋剂、醋酸铀（SPI）、锇酸（Ted Pella）、硝酸铅（Sigma）。

1.10 主要仪器

CCL⁃170B⁃8细胞培养箱（ESCO）；电泳仪（北京六一生物科技有限公司），转膜仪（Bio-Rad），PCR仪（杭州朗基科学仪器有限公司）、荧光显微镜（徕卡DMi8）。LSRFortessa型流式细胞细胞仪（BD）、Infinite M200 PRO型全波长多功能酶标仪（赛默飞世尔科技公司）、超薄切片机（Leica，UC7）、钻石切片刀（Daitome，Ultra 45°）、透射电子显微镜（HTACHI，HT7800/HT7700）。

1.11 细胞分组及处理

含药血清浓度实验中，将AGS细胞分为对照组、双术汤低、中、高浓度组以明确含药血清最佳浓度；在铁死亡实验中，将AGS细胞分为对照组、双术汤高浓度组、双术汤高浓度加铁死亡抑制剂组、铁死亡抑制剂组以明确双术汤是否诱导细胞发生铁死亡。

1.12 含药血清的制备及细胞给药

按体表面积折算SD大鼠等效剂量（低：9.45 g/kg，中：18.9 g/kg，高：37.8 g/kg），连续灌胃7 d，制备含药血清。

在含药血清浓度探索实验中，取对数生长期的AGS细胞接种于96孔板贴壁后，对照组中加入培养基、含药血清低中高组分别加入10%的各浓度的含药血清；在探索铁死亡实验中，对照组加入培养基，双术汤组加入10%高剂量含药血清，双术汤组加Fer-1组加入10%高剂量含药血清和（浓度2 μm）的Fer-1，Fer-1组加入同浓度的Fer-1，于37 ℃、5% CO₂条件下培养。

1.13 CCK-8 检测细胞活力

将AGS细胞按100 μL/孔接种于96孔板中，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育1.5 h。酶标仪测定A_{450 nm}，计算AGS细胞的存活率。

1.14 ROS荧光及流式细胞术检测

将AGS细胞（5×10⁵/孔）接种到6孔板中，然后按组别干预24 h后，加入细胞穿透探针DCFHDA（浓度为1 μm），孵育30 min后用PBS清洗，使用荧光显微镜拍照，流式细胞仪检测活性氧（ROS），并用FlowJo分析ROS荧光强度。

1.15 GSH、Fe²⁺检测

将AGS细胞接种于6孔板中，待细胞贴壁生长密度达到80%以上时，按组别干预24 h后收集细胞，分别按谷胱甘肽（GSH）、亚铁离子（Fe²⁺）检测试剂盒说明书进行检测。通过酶标仪检测标本在405、593 nm波长的吸光度，计算各组相对GSH、Fe²⁺水平并统计作图。

1.16 Western blotting检测细胞中P53、GPX4、SLC7A11蛋白表达

各组药物干预24 h后，加入RIPA裂解液从细胞、组织中提取总蛋白并调平蛋白样品浓度。SDS-PAGE电泳，转移至PVDF膜，封闭1h，加入一抗（1∶1000），4 ℃孵育过夜，TBST清洗3次，加二抗（1∶1000）室温孵育1 h，曝光、显影、成像，β-actin条带作为内参。

1.17 qPCR检测细胞中P53、GPX4、SLC7A11 mRNA表达

取各组细胞提取总RNA，逆转录后PCR扩增。反应体系包括CDNA模板2 μL，2×Q3 sybr qPCR master mix （universal）10 μL，上下游引物各0.4 μL，RNase⁃free ddH₂O 7.2 μL。反应条件为95 ℃，预变性30 s，60 ℃退火30 s，共重复40各循环。以β-actin为内参，2^-ΔΔCT法计算mRNA的表达。引物由南宁捷尼斯生物有限公司设计、合成，具体产物和产物长度见表1。

1.18 透射电镜观察细胞线粒体形态

收集经过处理的AGS细胞，将其离心后加入电镜专用戊二醛溶液在4 ℃下固定 2.5 h。经脱水、浸润、包埋、切片流程后，再经醋酸铀和枸橼酸铅双重金属染色，然后电镜检测，观察试验结果，并拍照记录试验结果，并使用Image J Mitochondria Analyzer进行线粒体基质密度分析。

1.19 动物造模、分组及给药

裸鼠适应性喂养3 d，将人胃癌细胞AGS（4×10⁶个细胞）皮下注射至右腋窝区域。当皮肤下观察到直径5~10 mm的肿瘤时，提示造模成功。成瘤后的裸鼠分为对照组（生理盐水灌胃）、双术汤组（27.3 g/kg，100 μL双术汤灌胃）、双术汤+Fer-1组（双术汤灌胃+腹腔注射Fer-1，5 mg/kg，3次/周）、Fer-1组（腹腔注射Fer-1）。

1.20 测量肿瘤体积及称量肿瘤质量

给药后每3 d对裸鼠瘤体体积进行测量。使用游标卡尺测量移植瘤的长径及短径，计算瘤体体积。V_肿瘤=长径×短径²/2。

1.21 HE染色

剥离肿瘤组织后，4%多聚甲醛溶液固定，经脱水、包埋、切片等处理后进行常规HE染色，显微镜下观察。

1.22 统计学分析

结果采用SPSS 26.0软件进行数据处理，符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，多组间比较用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD检验，方差不齐时组间两两比较采用Tamhane's T₂检验。不符合正态分布时采用非参数检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 网络药理学及分子对接验证

2.1.1 双术汤的靶点获取

双术汤共得到包括槲皮素、汉黄芩素、柚皮素等221个活性化学成分，1158个靶点，以下是其中度值排名前10的活性成分（表2）。

2.1.2 胃癌疾病、铁死亡靶点获取

使用R语言“DESeq2”R包分析得到胃癌差异基因4513个（图1A）。从FerrDb数据库得到564个铁死亡基因的数据集。将胃癌差异基因、铁死亡相关基因及双术汤药物靶点取交集，得到29个共同靶点。根据PPI网络中节点的度值对靶点进行排序，筛选出排名前9位的核心靶点，并绘制PPI核心网络图（图1B、C）。

2.1.3 核心基因的差异表达分析、HBA分析及生存分析

差异表达验证分析显示，与正常组织相比，肿瘤患者的肿瘤蛋白P53的基因表达上调（P<0.0001，图1D）。HBA中免疫组织化学数据显示，胃癌样品中的P53表达水平较高（图1E）。KM分析结果显示，胃癌患者P53表达与总体生存率呈正相关（P<0.05，图1F）。

2.1.4 分子对接结果分析

根据双术汤“活性成分‐靶点基因”网络分析结果，选取度值较高的槲皮素、汉黄芩素作为配体，根据PPI 网络筛选核心靶点P53受体进行分子对接。分子间结合能越低，对接活性越大。AutoDock Vina结果显示槲皮素、汉黄芩素均与中心节点蛋白P53的结合能为-6.5、-6.8 kcal/mol，均与P53存在较强的结合作用。Discovery Studio 2019 软件预测的结合口袋位置比对结果（图1G）。

2.2 双术汤诱导胃癌AGS细胞发生铁死亡

2.2.1 含药血清浓度的摸索

CCK-8结果显示，12 h对照组、低、中、高剂量组的细胞存活率分别为：97.87%±5.88%、81.49%±2.93%、82.68%±1.50%、71.91%±0.81%；24 h对照组、低、中、高剂量组的细胞存活率分别为：100.00%±1.31%、75.71%±1.84%、66.50%±0.73%、58.11%±0.79%；48 h对照组、低、中、高剂量组的细胞存活率分别为：100.00%±5.37%、57.32%±2.70%、53.42%±2.75%、50.12%±1.66%。与对照组相比，各剂量双术汤含药血清均能抑制AGS细胞生长，细胞存活率与给药时间和浓度呈负相关（P<0.05）。与对照组相比，高剂量含药血清干预24 h后，AGS细胞抑制效果最显著，抑制率可达58.11%±0.79%（P<0.05），因此选择高剂量组作为后续实验药物（图2A）。

2.2.2 双术汤血清对AGS细胞铁死亡的影响

与对照组相比，双术汤含药血清能降低细胞存活率（P<0.05）；而双术汤联合Fer-1干预后，细胞存活率上升（P<0.05）。此外，与双术汤含药血清联合Fer-1干预组相比，单独使用Fer-1干预的细胞存活率高于双术汤联合Fer-1组（P<0.05，图2B）。正常组和Fer-1干预组的AGS细胞呈上皮样贴壁生长，状态良好；双术汤含药血清干预24 h后，细胞形态发生明显变化，表现为皱缩、变圆、数量减少，提示细胞增殖受到了抑制。与双术汤组相比，双术汤联合Fer-1干预组的细胞数量有所增加（P<0.05，图2C）。

2.2.3 双术汤血清对ROS生成的影响

与对照组相比，双术汤组绿色荧光增多，可见大量ROS生成；与双术汤组相比，双术汤+Fer-1组荧光减少（P<0.05，图2D）。流式细胞仪结果显示，经双术汤处理过的组别ROS荧光值高于对照组和Fer-1组（P<0.05），双术汤+Fer-1组荧光值低于双术汤组，但高于Fer-1组（P<0.05，图2E）。

2.2.4 各组细胞中Fe²⁺、GSH的表达水平

在Fe²⁺检测中，与对照组相比，双术汤组和双术汤+Fer-1组的Fe²⁺含量升高（P<0.05）。与双术汤组相比，双术汤+Fer-1组和Fer-1组的Fe²⁺含量降低（P<0.05）；进一步比较发现，Fer-1组的Fe²⁺含量低于双术汤+Fer-1组（P<0.05，图2F）。在GSH检测中，与对照组相比，双术汤组和双术汤+Fer-1组的GSH含量降低（P<0.05）。与双术汤组相比，双术汤+Fer-1组和Fer-1组的GSH含量升高（P<0.05）；同时，Fer-1组的GSH含量也高于双术汤+Fer-1组（P<0.05，图2G）。

2.2.5 各组细胞中P53、SLC7A11、GPX4蛋白及基因表达水平

与对照组比较，双术汤组P53表达升高，SLC7A11、GPX4表达降低；与双术汤血清组相比，双术汤+Fer-1组P53表达降低（P<0.05），SLC7A11、GPX4表达升高（P<0.05）。与双术汤+Fer-1组相比，Fer-1组P53表达降低，SLC7A11、GPX4表达升高（P<0.05），蛋白与基因表达水平呈现一致的趋势（图3A、B）。

2.2.6 各组线粒体损伤情况

对照组线粒体结构正常、形态正常，与对照组比较，双术汤组线粒体皱缩、膜密度增加，线粒体嵴减少甚至消失；与双术汤组比较，双术汤+Fer-1组线粒体及膜损伤程度较轻；而Fer-1组线粒体结构、线粒体嵴清晰，从线粒体量化结果来看，双术汤组线粒体灰度值明显高于其它各组（P<0.05），说明双术汤组膜密度增加，符合铁死亡的典型表现（图3C、D）。

2.2.7 裸鼠肿瘤体积及质量图

通过观察肿瘤体积变化，发现与对照组相比，双术汤组瘤体体积、质量明显缩小（P<0.05）；与双术汤组相比，双术汤+Fer-1组肿瘤明显增大（P<0.05，图4A~C）。

2.2.8 HE染色观察肿瘤病理

HE染色结果显示，对照组肿瘤细胞结构完整，排列紧密，胞浆丰富，核分裂活跃。与对照组相比，双术汤组肿瘤细胞出现核固缩和坏死现象，组织排列疏松，细胞密度降低。当双术汤与Fer-1联合使用时，肿瘤坏死区域较双术汤单用组有所减少（图4D）。

2.2.9 各组细胞中P53、SLC7A11、GPX4蛋白及基因表达水平

与对照组比较，双术汤血清组的P53表达升高，SLC7A11、GPX4表达降低；与双术汤血清组相比，双术汤+Fer-1组P53表达降低，SLC7A11、GPX4表达升高（P<0.05）。与双术汤+Fer-1组相比，Fer-1组P53表达降低，SLC7A11、GPX4表达升高（P<0.05）。动物组织呈现与细胞一致的变化趋势（图4E、F）。

3 讨论

基于网络药理学分析，我们发现双术汤的主要活性成分是槲皮素和汉黄芩素，这两种成分均具有抗肿瘤作用，并且可通过脂质过氧化途径诱导癌细胞发生铁死亡^［20-22］。通过PPI核心靶点预测和分子对接分析，我们证实P53是双术汤调控铁死亡途径治疗胃癌的关键靶点，且槲皮素和汉黄芩素均与P53蛋白表现出良好的结合能力。进一步的生物信息学分析显示，P53在胃癌组织中呈现显著高表达，其表达水平与患者预后呈显著正相关。免疫组化结果证实，胃癌组织中P53蛋白的阳性表达率显著高于癌旁正常组织。生存分析表明，P53高表达组患者的5年生存率明显优于低表达组，提示P53可作为胃癌预后的潜在生物标志物和治疗靶点。

在细胞实验中，双术汤呈剂量和时间依赖性抑制AGS细胞增殖。为探究其作用机制是否涉及铁死亡，我们联合Fer-1进行干预，光镜和CCK-8结果显示，双术汤抑制细胞生长，而Fer-1能逆转细胞死亡；流式细胞仪及荧光显微镜实验结果显示，双术汤组ROS水平显著高于对照组，而Fer-1可阻断这一现象；双术汤组GSH水平显著低于对照组，而加入Fer-1干预后GSH水平升高；双术汤组Fe²⁺含量较对照组明显升高，Fer-1能逆转此效应。此外，透射电镜观察发现，双术汤处理组AGS细胞的线粒体形态发生显著变化，包括皱缩、嵴变浅或部分消失，符合铁死亡的典型超微结构特征，而Fer-1可缓解线粒体损伤，形态趋于正常。以上结果支持了双术汤诱导胃癌AGS细胞发生铁死亡这一科学假设^［7］。

为进一步揭示双术汤诱导胃癌细胞铁死亡的机制，我们检测了铁死亡相关蛋白的变化。GPX4是铁死亡表型中的明星分子，其是一种硒依赖的抗氧化酶，能够利用GSH将脂质过氧化物还原为无毒的脂质醇，从而保护细胞膜免受氧化损伤，当GPX4活性被抑制时，脂质过氧化物积累，导致细胞膜破裂和铁死亡^［5］。研究表明，某些中药可通过下调GPX4诱导铁死亡，从而抑制胃癌细胞侵袭与迁移^［12］。我们的实验结果显示，双术汤显著下调GPX4蛋白水平，而Fer-1可逆转此效应。此外，双术汤显著上调P53表达，同时下调溶质载体家族7成员11（SLC7A11），且Fer-1共培养可逆转P53与SLC7A11的表达变化。动物实验结果显示，与对照组相比，双术汤能够抑制裸鼠皮下移植瘤生长，HE提示双术汤组肿瘤细胞呈坏死状态，细胞排列稀疏，能够上调肿瘤组织中的P53，下调SLC7A11及GPX4表达水平。这表明双术汤可能通过P53/SLC7A11/GPX4通路诱导铁死亡，从而影响胃癌的发展。

P53是一种与铁死亡密切相关的肿瘤抑制因子，近年来研究表明，P53通过多种机制调控铁死亡过程^［13］。作为“基因卫士”，P53在DNA修复、细胞周期调控及细胞凋亡中发挥核心作用^［14］。此外，P53还通过抑制其代谢靶标SLC7A11的表达参与铁死亡调控。SLC7A11是细胞膜上的一种转运蛋白，通过调控胱氨酸和谷氨酸的跨膜转运来合成GSH，而GSH是GPX4的合成底物^［23-25］，GPX4作为铁死亡的关键调控分子，进而触发铁死亡。因此，P53通过抑制SLC7A11的表达，调控细胞内GPX4的表达，最终调控铁死亡过程，因此，P53/SLC7A11/GPX4轴可能是双术汤调控铁死亡的关键机制。

本研究首次揭示了双术汤通过P53/SLC7A11/GPX4轴诱导铁死亡治疗胃癌的潜在机制，为胃癌的治疗提供了新的分子靶点和理论依据。此外，本研究综合运用网络药理学、生物信息学、分子对接及体内外实验，展示了多学科交叉在中药现代化研究中的重要作用。同时本研究也存在着一些局限性，未明确双术汤成分，后续应使用液相质谱联用手段对双术汤的药液及入血成分进一步说明；P53/SLC7A11/GPX4轴在胃癌铁死亡中的具体调控网络尚需进一步解析。未来研究可结合多组学技术，全面揭示双术汤的抗肿瘤作用机制，并探索其与其他治疗手段的联合应用潜力。

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