补肺益肾方对香烟烟雾提取物诱导的人支气管上皮细胞损伤的保护作用及其机制

Protective effect of Bufei Yishen Formula against cigarette smoke extract-induced human bronchial epithelial cell damage and its mechanism

摘要

目的 探讨补肺益肾方对香烟烟雾提取物（CSE）诱导的人支气管上皮BEAS-2B细胞损伤的保护作用及机制。 方法 以CSE诱导的BEAS-2B细胞构建模型，以羧甲司坦（S-CMC）为阳性对照，将细胞分为对照组、CSE组、补肺益肾方（BYF）含药血清低剂量（BYL）组、BYF高剂量（BYH）组、NF-κB抑制剂PDTC组、BYH+PDTC组及S-CMC组。CCK-8法筛选CSE最佳造模浓度、作用时间及BYF含药血清、S-CMC给药浓度；ELISA法检测细胞上清炎症因子水平及细胞MUC5AC、MUC5B表达；透射电镜观察细胞超微结构；流式细胞术检测细胞凋亡率；qRT-PCR及Western blotting法检测细胞TLR4/NF-κB通路相关mRNA和蛋白表达。 结果 与Control组相比，CSE组细胞IL-1β、IL-6及TNF-α的分泌升高（P<0.01），细胞MUC5AC、MUC5B mRNA和蛋白表达升高（P<0.01），细胞出现凋亡小体，早期凋亡率及总凋亡率升高（P<0.01），细胞TLR4，I-κB，NF-κB mRNA和蛋白表达升高（P<0.01），AQP5 mRNA和蛋白表达降低（P<0.01）。与CSE组相比，各给药组可降低细胞上清炎症因子水平，细胞MUC5AC、MUC5B mRNA和蛋白水平，细胞早期凋亡率及总凋亡率，细胞超微结构损伤及TLR4/NF-κB通路相关mRNA和蛋白表达被部分逆转，其中以BYH+PDTC组更明显。 结论 补肺益肾方可通过抑制TLR4/NF-κB信号通路抑制CSE诱导的BEAS-2B细胞凋亡、炎症和黏液高分泌。

Abstract

Objective To evaluate the protective effect of Bufei Yishen Formula (BYF) against cigarette smoke extract (CSE)-induced injuries in human bronchial epithelial BEAS-2B cells and explore the underlying mechanism. Methods BEAS-2B cells exposed to CSE were treated with normal rat serum, BYF-medicated rat serum at low or high doses, pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC, a NF-κB inhibitor), PDTC combined with high-dose BYF-medicated serum, or S-carbomethyloysteine (S-CMC, as the positive control). CCK-8 assay was used to determine the optimal concentration and treatment time of CSE, BYF-medicated serum and S-CMC. The treated cells were examined for inflammatory factor levels in the supernatant and cellular expressions of MUC5AC and MUC5B using ELISA, cell ultrastructural changes with transmission electron microscopy, and cell apoptosis rate using flow cytometry. The expression levels of TLR4/NF‑κB pathway-associated mRNAs and proteins were determined by qRT-PCR and Western blotting. Results CSE exposure significantly increased secretions of IL-1β, IL-6 and TNF-α, mRNA and protein expressions of MUC5AC and MUC5B, and early and total apoptosis rates in BEAS-2B cells, where the presence of apoptotic bodies was detected. CSE also significantly enhanced the mRNA and protein expressions of TLR4, I-κB, and NF-κB and reduced mRNA and protein expressions of AQP5. Treatments of the CSE-exposed cells with BYF-medicated serum, PDTC and S-CMC all significantly lowered inflammatory factor levels, MUC5AC and MUC5B expressions, and early and total cell apoptosis rates, and partly reversed the changes in cellular ultrastructure and mRNA and protein expressions of the TLR4/NF-κB pathway, and the effects were the most conspicuous following the combined treatment with high-dose BYF-medicated serum and PDTC. Conclusion BYF can inhibit cell apoptosis, inflammation and mucus hypersecretion in CSE-induced BEAS-2B cells by inhibiting the TLR4/NF-κB signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

炎症反应 / 香烟烟雾提取物 / 补肺益肾方 / 黏液高分泌 / TLR4/NF-κB信号通路

Key words

inflammation response / cigarette smoke extract / Bufei Yishen Formula / mucin hypersecretion / TLR4/NF‑κB signaling pathway

慢性阻塞性肺疾病（COPD），是一种以持续且不可逆的气流受限为特征的慢性气道疾病，为全球第3大死亡原因，第7大致残疾病^{［1， 2］}。据预测，到2050年全球COPD患者将增长至约6亿例，我国COPD患病人数或将达到2.15亿，如不加大对COPD防控的投入，我国将面临着全球最大的经济损失，约1.4万亿美元^［3］。吸烟是COPD的主要致病因素之一，香烟烟雾提取物（CSE）中尼古丁、丙烯醛等毒性成分可直接损伤气管上皮细胞，通过激活核因子-κB（NF-κB）等信号通路介导白介素6（IL-6）、IL-1β、肿瘤坏死因子α（TNF-α）及其他炎症介质释放，进一步破坏上皮屏障完整性，增加细菌及病毒的易感性，同时上调黏蛋白（MUC）表达，形成炎症-黏液的恶性循环，从而表现为COPD特征性病理改变气道慢性炎症反应和黏液高分泌^［4］。

目前COPD的治疗方案主要包括药物治疗，氧疗及肺康复等，药物治疗通常以支气管扩张剂结合吸入性糖皮质激素来控制炎症反应，然而尚无有效的治疗措施可延缓疾病进展，且长期应用具有一定的不良反应^［5］。由人参、炙黄芪、山茱萸等中药组成的补肺益肾方（BYF）（专利号：ZL201110117578.1）是基于COPD“正虚积损”的主要病机拟定的方剂，前期多中心、随机对照临床研究证实，BYF可明显减轻COPD患者的咳嗽、咳痰等症状，提高肺功能和运动耐量，但其作用机制仍有待进一步阐述^{［6， 7］}。基于此，本研究以CSE诱导的人支气管上皮细胞（BEAS-2B）为COPD体外模型，观察补肺益肾方对BEAS-2B细胞损伤的保护作用及机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物与细胞

SPF级雄性SD大鼠30只，6~8周，180±20 g，由北京斯贝福提供，许可证号SCXK（豫）2022-0001，饲养于河南中医药大学第一附属医院中心实验室动物房，研究经河南中医药大学第一附属医院实验动物伦理委员会批准（伦理批号：YFYDW2021002）。人支气管上皮BEAS-2B细胞（苏州海星生物科技有限公司）。

1.2 实验药物

BYF由人参9 g，黄芪15 g，山茱萸12 g，枸杞子12 g，五味子9 g，淫羊藿9 g，浙贝母9 g，赤芍9 g，地龙12 g，紫苏子9 g，矮地茶15 g，陈皮9 g组成，由河南中医药大学药物分析实验室提供。羧甲司坦（S-CMC，Sigma）；NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代甲酸铵（PDTC，Selleck），均用 DMSO溶解配制成1 mmol/L 的母液，经0.22 μm的滤器过滤除菌后，分装于-80 ℃保存，用前稀释至所需浓度10 μmol/L^［8］。

1.3 主要试剂与仪器

CCK-8试剂盒（同仁）；Gluta固定液（索莱宝）；IL-6、IL-1β、TNF-α、MUC5AC、MUC5B酶联免疫吸附测定法（ELISA）试剂盒、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（伊莱瑞特）；总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒（翌圣）；TLR4、I-κB、NF‑κB、AQP5、β-actin抗体（武汉三鹰）；HRP标记山羊抗兔、鼠二抗（华安生物）。NanoDrop2000超微量紫外分光光度仪（Thermo）；SpectraMax i3x型酶标仪（Molecular Devices）；全自动树脂处理机、超薄切片机（Leica）；EM-1400型透射电子显微镜（JEOL）；FACSCelesta流式细胞仪（BD Biosciences）；7500 Real time 梯度PCR（Applied Biosystems）；Light Cycler480荧光定量PCR仪（Roche）；蛋白电泳仪，转膜仪，化学发光成像系统（BioRad）。

1.4 方法

1.4.1 含药血清制备

根据前期研究^［9］，30只大鼠分别以生理盐水、补肺益肾方（18.5 g/kg）连续灌胃7 d， 1次/d，末次灌胃1 h后，腹主动脉采血，无菌分离血清即为空白血清、补肺益肾含药血清。

1.4.2 CSE制备

根据前期实验方法^［10］，将1支红旗渠香烟连接负压抽吸装置，烟雾导入2 mL 无血清培养基中制成悬液，再稀释悬液至吸光度A_{320 nm} =2，校正悬液 pH 值为中性，将过滤除菌后的悬液记为100% CSE，细胞干预前制配并在30 min内完成干预操作。

1.4.3 CSE造模浓度和干预时间的筛选

将BEAS-2B细胞接种于96孔板，每组设6个复孔，将100% CSE原液用无血清DMEM培养基稀释成不同浓度，细胞贴壁后分别加入0%、2.5%、5%、10%、20%、40%浓度的CSE稀释液，分别刺激6、12、24、48 h后，加入CCK-8孵育适宜时间，测定吸光度A_{450 nm}值，计算细胞存活率。

1.4.4 BYF含药血清、S-CMC给药浓度的筛选

将BEAS-2B细胞接种于96孔板，每组设6个复孔，将空白血清及含药血清用无血清DMEM培养基稀释成不同浓度，贴壁后分别加入0%、2.5%、5%、10%、20%浓度的BYF含药血清或0、10、100、1000、5000、10 000、20 000 μmol/L浓度的S-CMC，不同浓度含药血清用空白血清平衡至总血清浓度均为20%，干预24 h后采用CCK-8法检测A值，计算细胞存活率。

1.4.5 细胞上清炎症因子水平

BEAS-2B细胞培养在含有10% 胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基中，分成对照组、CSE组、BYF低剂量（BYL）组、BYF高剂量（BYH）组、BYH+PDTC组、PDTC组、S-CMC组，除对照组外，其余各组均加入终浓度为10%的CSE稀释液；对照组、CSE组、PDTC组及S-CMC组分别加入终浓度为10%的空白血清，BYH组、BYH+PDTC组加入终浓度为10%的含药血清；BYL组分别加入终浓度为5%的空白血清及含药血清；PDTC组及BYH+PDTC组加入10 μmol/L PDTC，S-CMC组加入10 μmol/L S-CMC，各组细胞干预24 h（表1）。收集细胞上清，3000 r/min离心15 min，根据ELISA试剂盒说明书步骤操作，酶标仪测定吸光度A_{450 nm}值，构建标准曲线，通过回归方程对各组细胞上清IL-6、IL-1β、TNF-α水平进行定量分析。

1.4.6 细胞MUC5AC、MUC5B蛋白表达

收集各组细胞至离心管中，冰浴条件下超声破碎，提取液离心取上清。根据ELISA试剂盒说明进行检测，计算各组细胞MUC5AC、MUC5B含量。

1.4.7 细胞超微结构观察

各组细胞分别给予相应药物处理后，电镜固定液常温固定5 min后，用细胞刮沿一个方向刮下细胞，吸管收集细胞至EP管中，低速离心5min，更换新的电镜固定液后，包埋并制备成超薄切片，在透射电子显微镜下观察细胞超微结构。

1.4.8 细胞总体凋亡率

收集各组细胞及上清，离心后将细胞重悬于500 μL Annexin V缓冲液，分别加入Annexin V及PI染液各5 µL，混匀孵育15 min，再加入400 μL Annexin V缓冲液，30 min内流式上机检测。

1.4.9 细胞TLR4、I‑κB、NF‑κB、AQP5、MUC5AC、MUC5B mRNA水平

提取各组细胞总RNA，检测RNA浓度和纯度，以反转录完成的cDNA为模板，加入引物进行qRT-PCR扩增（翌圣，表2）。

1.4.10 细胞TLR4、I-κB、NF-κB、AQP5蛋白水平

提取各组细胞总蛋白，蛋白在10% SDS-PAGE凝胶中分离，随后转移至PVDF膜，用5%脱脂奶粉封闭后，4 ℃过夜孵育相应一抗TLR4、I-κB、NF-κB、AQP5（稀释比1∶1000）及β-actin（稀释比1∶5000），条带经漂洗、孵育二抗后，在暗室条件下显影。

1.4.11 统计学分析

数据以均数±标准差表示，应用SPSS19.0及GraphPad Prism 9对实验数据进行统计及作图，组间比较用t检验，多组比较用ANOVA分析，P<0.05为差异具有统计学意义，实验均独立重复3次。

2 结果

2.1 CSE造模浓度和干预时间的确定

CCK-8法结果显示随着CSE浓度和作用时间的增加，细胞存活率逐渐降低。与Control组比，2.5%和5%的CSE对细胞存活率降低的影响差异无统计学意义，10% CSE干预6 h时细胞存活率的降低无统计学意义，而10% CSE干预24 h、48 h后细胞存活率降低（P<0.05），且低于10%浓度CSE干预6 h（P<0.05、图1）。结合前期研究，选择10% CSE干预24 h为造模浓度及干预时间。

2.2 BYF、S-CMC给药浓度筛选

CCK-8法结果显示，当S-CMC浓度越大时，BEAS-2B细胞存活率越低，1000、5000、10 000、20 000 μmol/L的S-CMC可抑制BEAS-2B细胞存活率（P<0.05，P<0.01），因此选择对细胞活力无明显影响的10 μmol/L作为S-CMC最佳干预浓度。随着BYF含药血清浓度越大，细胞存活率越高，20%含药血清干预24 h后细胞出现增殖（P<0.05、图2），因此选择对细胞活力无明显影响5%、10% BYF含药血清分别作为低、高干预浓度。

2.3 BYF对CSE诱导的BEAS-2B细胞上清炎症因子的影响

与Control相比，CSE组细胞上清中IL-1β、IL-6及TNF-α的蛋白表达升高（P<0.01）；与CSE组相比，各治疗组细胞上清中IL-1β、IL-6及TNF-α水平均明显降低（P<0.01），其中BYH组、BYH+PDTC组细胞上清中IL-1β、IL-6及TNF-α的蛋白表达低于PDTC组（P<0.05），BYH+PDTC组细胞上清中IL-1β的蛋白表达低于S-CMC组（P<0.01），BYH组细胞上清中TNF-α的蛋白表达低于BYL组及S-CMC组（P<0.01、图3）。

2.4 BYF对CSE诱导的BEAS-2B细胞黏蛋白基因与蛋白表达影响

与Control相比，CSE组MUC5AC、MUC5B mRNA和蛋白水平明显升高（P<0.01），与CSE组比较，BYL组、BYH组、PDTC组、BYH+PDTC组、S-CMC组MUC5AC、MUC5B mRNA和蛋白水平明显降低，差异有统计学意义（P<0.01），且BYH+PDTC组MUC5AC蛋白水平低于S-CMC组（P<0.05，图4）。

2.5 BYF对CSE诱导的BEAS-2B细胞超微结构的影响

Control组细胞未见明显异常，线粒体结构完整、脊形态清晰。CSE组细胞体积缩小，细胞核高度固缩，细胞周围可见较多凋亡小体，表现为高电子密度团块状结构，内可见少量细胞器样结构。与CSE组相比，其余各干预组细胞形态均有不同程度的改善，但仍无法恢复至对照组细胞形态，如BYL组及S-CMC组细胞内均出现脂滴；BYL组、PDTC组及S-CMC组出现胞质水肿，线粒体脊和膜的破坏及融合；BYH组线粒体较肿胀，但形态仍较完整；BYH+PDTC组线粒体形态恢复最明显，膜和脊较完整清晰（图5）。

2.6 BYF对CSE诱导的BEAS-2B细胞凋亡比例的影响

与Control组相比，CSE组细胞早期凋亡率及总凋亡率升高（P<0.01），晚期凋亡率有升高趋势；与CSE组相比，各治疗组可降低早期凋亡率及总凋亡率（P＜0.05），而对晚期凋亡率的改善无统计学意义；与BYL组相比，BYH组及BYH+PDTC组总凋亡率降低，差异具有统计学意义（P<0.01、图6）。

2.7 BYF对CSE诱导的BEAS-2B细胞TLR4/NF-κB通路mRNA表达影响

与Control相比，CSE组TLR4、I-κB、NF-κB mRNA水平明显升高（P<0.01），而AQP5 mRNA水平明显降低（P<0.01）；与CSE组比较，各治疗组TLR4、I-κB、NF-κB mRNA水平明显降低（P<0.01），AQP5 mRNA水平明显升高（P<0.01）；与BYL组相比，BYH组及BYH+PDTC组NF-κB mRNA水平降低（P<0.05）；与PDTC组相比，BYH+PDTC组TLR4 mRNA水平降低，AQP5 mRNA水平升高，差异具有统计学意义（P<0.01）；与S-CMC组相比，BYH组及BYH+PDTC组TLR4 mRNA水平降低（P<0.01），AQP5 mRNA水平升高（P<0.05、图7）。

2.8 BYF对CSE诱导的BEAS-2B细胞TLR4/NF-κB通路蛋白表达影响

与Control相比，CSE组TLR4、I-κB、NF-κB蛋白水平升高（P<0.01），而AQP5蛋白水平降低（P<0.01）；与CSE组比较，各治疗组TLR4、I-κB、NF-κB蛋白水平明显降低（P<0.01），AQP5蛋白水平明显升高（P<0.01）；与BYL组相比，BYH+PDTC组TLR4、I-κB、NF-κB蛋白水平降低（P<0.05），AQP5蛋白水平明显升高（P<0.05）；且BYH+PDTC组TLR4、I-κB蛋白水平低于PDTC组及S-CMC组（P<0.05），AQP5蛋白水平高于PDTC组及S-CMC组（P<0.05，图8）。

3 讨论

中医学认为COPD属“咳嗽”、“喘病”、“肺胀”等范畴，慢性咳嗽、咳痰、气短是慢阻肺的主要临床症状，气道慢性炎症及黏液高分泌为呼吸道内“痰”的形成创造了条件。本团队提出慢阻肺以肺肾气虚为本，痰瘀互结为标，并拟定了具有补益肺肾、化痰祛瘀之效的补肺益肾方^［11］，经系列临床研究发现该方在改善患者症状、提高生活质量、减少急性加重等方面具有较好的疗效^［12］，动物实验研究显示该方可改善COPD大鼠气道炎症、抑制气道黏液高分泌^{［13， 14］}，体外实验证实BYF对CSE诱导的BEAS-2B细胞黏液高分泌具有抑制作用，本研究进一步证实BYF可抑制CSE诱导的BEAS-2B细胞凋亡、炎症和黏液高分泌。

目前国内外构建体外COPD细胞模型的主要有CSE、脂多糖、蛋白酶、炎症因子等诱导的BEAS-2B、16HBE、A549等细胞，其中CSE诱导的BEAS-2B细胞模型是模拟COPD体外病理的经典方法，可重现与COPD患者相似的炎症因子谱及MUC过表达^［15］。本研究结果显示10%浓度CSE诱导BEAS-2B细胞24 h可显著降低细胞存活率，以此为细胞模型可诱导BEAS-2B细胞凋亡，上调炎症因子和MUC表达，激活TLR4/NF-κB通路相关基因与蛋白表达，提示COPD细胞模型构建成功。

气道上皮细胞是COPD病理生理损伤的主要靶细胞，香烟烟雾等有害物质可直接破坏气道上皮细胞DNA和线粒体功能，导致细胞凋亡^［16］，受损上皮细胞释放IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎因子，招募中性粒细胞和巨噬细胞浸润，形成慢性炎症微环境；同时，有害物质长期刺激导致气道上皮杯状细胞增生，MUC表达上调，表现为黏液高分泌与纤毛功能障碍，增加病原体和过敏原的跨上皮渗透风险，进一步加重上皮组织破坏^［17］。正常生理状态下，气道表面有一层稀薄的黏液，杯状细胞分泌的MUC5AC和黏膜下腺分泌的MUC5B是黏液层的主要黏蛋白^［18］，AQP5通过调节黏液水合状态影响其黏弹性^［19］。COPD患者气道上皮杯状细胞增生，气道黏液的主要成分MUC分泌增强，AQP5表达降低，导致黏液脱水浓缩，黏稠度增加，从而加重气道阻塞^［20］。IL-6、IL-1β和TNF-α是COPD气道炎症的核心驱动因子，可通过持续招募中性粒细胞和巨噬细胞等免疫细胞，上调金属蛋白酶降解细胞外基质，破坏上皮组织，抑制上皮修复，导致气道持续炎症反应，针对这些细胞因子的靶向治疗，如TNF-α抑制剂、IL-6受体拮抗剂已成为缓解COPD疾病进展的研究方向^［21］。

TLR4/NF-κB通路是参与COPD气道上皮损伤的关键信号轴。TLR4作为模式识别受体，广泛分布在细胞膜表面，可被CSE激活信号诱发炎性反应。NF-κB是免疫炎症反应的中心转录因子，CSE激活TLR4后，通过IκB磷酸化降解促使NF-κB入核，促进IL-6、IL-1β和TNF-α等促炎因子的释放，加重炎症细胞浸润，进一步驱动慢性炎症，形成炎症级联放大连锁反应，参与气道炎症反应全过程。同时，NF-κB的持续活化不仅可直接诱导MUC的过度表达，降低AQP5的蛋白合成^［22］，而且还可通过促进IL-6、IL-1β、TNF-α等的释放间接刺激MUC分泌^［23］。此外，TLR4/NF-κB信号通路还可调控下游线粒体凋亡途径^［24］。研究报道NF-κB通路抑制剂PDTC可抑制IL-6、IL-1β、TNF-α的分泌，减少黏蛋白分泌和肺上皮细胞凋亡^［25］。本研究显示BYF含药血清干预CSE诱导的BEAS-2B细胞后，IL-6、IL-1β、TNF-α、MUC5AC、MUC5B水平显著降低，AQP5水平显著增加，细胞凋亡减少，并利用NF-κB抑制剂PDTC验证BYF通过抑制TLR4/NF-κB信号通路的过度激活，从而抑制气道炎症和黏液高分泌发挥对COPD细胞模型的保护作用。

综上所述，本实验以CSE诱导BEAS-2B细胞成功构建了COPD体外模型，补肺益肾方可通过抑制TLR4/NF-κB信号通路抑制CSE诱导的BEAS-2B细胞凋亡、炎症和黏液高分泌。然而本研究仍存在一定的局限性，体外实验无法完全模拟体内环境的复杂性，这可能影响结果的普适性，未来仍需通过体内实验进一步验证。

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