艾灸通过调控miR-223-3p/NLRP3焦亡通路修复薄型子宫内膜

Moxibustion promotes endometrial repair in rats with thin endometrium by inhibiting the NLRP3/pyroptosis axis via upregulating miR-223-3p

摘要

目的 探讨艾灸通过miR-223-3p/NLRP3/pyroptosis 信号轴促进子宫内膜修复的机制。 方法 将SD大鼠随机分为对照组（CON）、模型组（MOD）、艾灸组（MOX），16只/组。使用95%无水乙醇造模，MOX组给予艾灸关元穴治疗。检索公共数据库结合高通量测序寻找薄型子宫内膜（TE）的靶基因；双荧光素酶验证miR-223-3p和NLRP3的靶向关系；HE染色法观察子宫病理形态；RT-qPCR法检测miR-223-3p、NLRP3表达；ELISA法检测IL-1β、IL-18水平；Western blotting法检测NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD的表达；统计大鼠妊娠情况。 结果 共检索到13个TE与细胞焦亡相交的靶基因，差异基因富集提示TE中炎症反应上调。双荧光素酶实验验证了miR-223-3p靶向抑制NLRP3的表达。与CON组比，MOD大鼠子宫内膜厚度、腺体及血管数量减少（P<0.01），NLRP3的mRNA表达增强（P<0.05），血清IL-1β、IL-18水平升高（P<0.01），NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD蛋白表达增加（P<0.05），患侧妊娠率降低（P<0.05），患侧及健侧妊娠数量和妊娠总数均减少（P<0.01）；与MOD比，MOX组大鼠内膜厚度、腺体和血管数增加（P<0.01），miR-223-3p表达上调（P<0.05），IL-1β、IL-18含量减少（P<0.05），NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD的蛋白表达降低（P<0.05），健侧妊娠数量和妊娠总数量增多（P<0.05）。 结论 艾灸关元穴可以上调miR-223-3p靶向抑制NLRP3，缓解细胞焦亡，促进子宫内膜修复和妊娠功能恢复。

Abstract

Objective To explore the mechanism through which moxibustion promotes endometrial repair in rats with in thin endometrium (TE). Methods Female SD rats were randomized into control group, 95% anhydrous ethanol-induced TE model group and moxibustion (at "Guan Yuan") group. High-throughput sequencing was used to identify the target genes of TE, and the targeting relationship between miR-223-3p and NLRP3 was verified using a dual luciferase assay. Histopathological of rat uterus was observed with HE staining, and expressions of miR-223-3p and NLRP3 were detected using RT-qPCR; serum levels of IL-1β and IL-18 of the rats were detected using ELISA, and protein expressions of NLRP3, ASC, caspase-1 and GSDMD in the uterus were detected with Western blotting. The pregnancies of the rats after treatment were counted. Results Enrichment analysis of the differential genes suggested up-regulated inflammatory response in TE, and dual luciferase assay verified targeted inhibition of NLRP3 expression by miR-223-3p. The rat models of TE had significantly decreased endometrial thickness and reduced endometrial glands and blood vessels with enhanced mRNA expression of NLRP3, increased serum levels of IL-1β and IL-18, up-regulated protein expressions of NLRP3, ASC, caspase-1 and GSDMD, lowered pregnancy rates on both the affected and unaffected sides and the overall number of pregnancies. Treatment of the rat models with mo-xibustion obviously increased the endometrial thickness and the density of glands and blood vessels, up-regulated miR-223-3p expression, lowered serum IL-1β and IL-18 levels and the protein expressions of NLRP3, ASC, caspase-1 and GSDMD, and significantly increased the number of pregnancies. Conclusion Moxibustion at "Guan Yuan" acupoint up-regulates the expression of miR-223-3p, which results in targeted inhibition of NLRP3 to suppress pyroptosis and promote endometrial repair in rat models of TE.

Graphical abstract

关键词

薄型子宫内膜 / 中医药 / 艾灸 / 关元穴 / 细胞焦亡 / miR-223-3p/NLRP3/pyroptosis 信号轴

Key words

thin endometrium / Chinese medicine / moxibustion / Guan Yuan acupoint / pyroptosis / miR-223-3p/NLRP3/pyroptosis signaling pathway

子宫内膜厚度是受精卵着床和妊娠维系的关键因素，对于维持生理生殖功能发挥着重要作用。薄型子宫内膜（TE）是指排卵期子宫内膜厚度<7 mm，是生殖障碍、复发性流产和胎盘异常的重要原因^［1］，子宫内膜损伤导致的不孕症发病率高达40%^［2］，内膜过薄会导致低胚胎着床率和高胚胎丢失率^{［3， 4］}。

有研究^［5］显示TE引起的植入失败可能与炎症环境的异常激活有关，细胞焦亡是一种促炎性细胞死亡，炎症小体的过度激活会引起致病性炎症、细胞因子风暴、组织损伤等^［6］。MicroRNA-223（miR-223）参与多种疾病，是重要的抗炎调节因子^［7］，可以保护子宫免受炎症损伤^［8］。Calvente等^［9］发现，miR-223可以负向调节肝脏巨噬细胞中核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）mRNA的表达，从而减轻炎症。项目组检索到TE相关基因与多个细胞焦亡靶标基因相交，包括NLRP3、白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素18（IL-18）等，且miR-223与TE存在较强相关性。前期子宫组织转录组（RNA-seq）学和蛋白组（Pro-DIA）学测序发现，TE大鼠的差异基因在炎症反应中显著上调，推测炎症反应的异常激活可能诱导了细胞焦亡，从而引起子宫内膜损伤，这与之前的研究一致^［10］，但目前关于TE中细胞焦亡的调控网络缺乏更深入的探讨。

艾灸是一种简便安全的中医外治法，在多种疾病的治疗中发挥着重要作用，《孟子·离娄》记载：“七年之病，求三年之艾”。现代研究表明艾灸通过影响生物组织温度场和能量的动态变化，激发热敏态腧穴的红外线光谱变化而产生“共振”，对疾病起到治疗作用^［11］。艾灸临床上用于薄型子宫内膜^［12］、排卵障碍性不孕^［13］等疾病的治疗，能提高子宫内膜容受性、排卵率和妊娠率，其机制可能与促进内膜血管生成、改善血流参数、调节体内激素水平等有关。庄海娜等^［14］发现，针灸改善子宫内膜容受性选穴以子宫、关元最为常见。中医认为薄型子宫内膜的病位在胞宫，以肾虚血瘀为基本病机。关元为任脉经穴，任脉起于胞中，为“阴脉之海”，“主胞胎”，统调阴经气血，与女性的月经和生殖密切相关。刺激关元穴可以影响下丘脑-垂体轴，调节激素和内分泌水平，改善卵巢功能^［15］。研究发现督灸能调控外周血miR-223水平，减轻炎性因子对机体的损害，在强直性脊柱炎中发挥抗焦亡的作用^［16］，然而艾灸能否调控miR-223-3p表达抑制NLRP3的激活，缓解细胞焦亡引起的组织损伤，从而达到修复薄型子宫内膜的作用，目前尚不清楚。本研究拟通过体内实验，探讨艾灸关元穴对miR-223-3p/NLRP3/pyroptosis信号轴的调控作用，以及对子宫内膜修复的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

48只未交配的SPF级雌性SD大鼠，8~10周龄，200±20 g；12只性成熟的SPF级雄性SD大鼠，10~12周龄，300±20 g，均购自广东省医学实验动物中心［许可证号：SCXK（粤）2022-0002］，饲养于广州中医药大学实验动物中心［使用许可证号：SYXK（粤）2023-0347］，饲养环境：室温22±2 ℃，湿度50%~60%，光照/黑暗各12 h。实验前适应性喂养1周，期间自由摄食饮水，喂以普通饲料。

于每日9∶00~11∶00进行阴道涂片，选取有规律动情周期的48只雌鼠纳入实验，随机分为对照组（CON）、模型组（MOD）、艾灸组（MOX），16只/组。除CON外，另两组于动情期当天宫腔注射95%无水乙醇建立薄型子宫内膜模型；两组各取8只大鼠进行双侧造模用于后续实验指标检测，剩余8只单侧造模用作后续妊娠实验。动物实验方案已通过广州中医药大学动物伦理审查委员会批准（伦理批号：20230613001），并严格遵照《关于善待实验动物的指导性意见》处置动物。

1.2 主要试剂与仪器

艾条（12 cm×0.7 cm，上官氏）；异氟烷（瑞沃德）；大鼠IL-1β、IL-18 ELISA检测试剂盒（江莱生物）；4%多聚甲醛溶液、苏木素伊红染液、RIPA裂解液（Biosharp）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天）；预染蛋白Marker（Thermo Fisher）；GAPDH抗体（proteintech）；ASC抗体（Abcam）；NLRP3、Caspase-1、GSDMD抗体（华安生物）；山羊抗兔IgG（H+L）、山羊抗鼠IgG（H+L）抗体（proteintech）；RNA反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒（南京诺唯赞）；茎环法逆转录试剂盒（Servicebio）；双荧光素酶检测试剂盒（上海吉凯基因）；引物合成（上海捷瑞生物公司）。

小动物麻醉机（瑞沃德）；全波长酶标仪（Thermo Fisher）；组织脱水机、包埋机、切片机（金华市科迪仪器设备有限公司）；倒置荧光显微镜（奥林巴斯）；荧光定量PCR仪（ABI）；低温高速组织研磨仪（Servicebio）；电泳仪（Bio-Rad）；ChemiDoc MP全能型凝胶成像系统（Bio-Rad）。

1.3 动物造模及干预

1.3.1 造模方法

使用3%~3.5%异氟烷对大鼠进行诱导麻醉后，转为2%~2.5%的浓度维持。造模方法参照课题组前期发表的相关论文^［17］，手术区域剃毛消毒后，在大鼠下腹部正中距耻骨联合上约 1cm 做一长约1cm的纵形切口，找到子宫下端Y型分叉，充分暴露一侧子宫，分别用血管钳于近卵巢端及阴道会合处夹闭宫腔，使用1 mL注射器于卵巢端缓慢注入95%无水乙醇，保持宫腔充盈5 min后回抽，再用生理盐水冲洗2~3次；另一侧采用同样方法。造模结束后用无菌生理盐水冲洗腹腔，逐层缝合，于肌层均匀涂抹0.5 g青霉素钠粉剂预防感染。以病理切片见子宫内膜厚度变薄为造模成功的评价标准。

1.3.2 干预方法

造模后2个动情周期开始干预。MOX组：取大鼠关元穴行温和灸，腧穴定位依据参照《实验动物常用穴位名称与定位》^［18］，关元穴位于脐下约25 mm，脐平双髂嵴连线中点。治疗前穴区剃毛，将大鼠固定于自制艾灸架上，将充分燃烧的艾条置于大鼠穴位正上方1~2 cm处，在施灸过程中及时调整距离，使穴区皮肤温度保持在43±1 ℃。治疗15 min/次，1次/d，连续6 d后休息1 d，共3周。CON组，MOD组每日用相同方式固定。

1.4 数据库检索及测序

检索GeneCards数据库获取薄型子宫内膜的靶标基因，与33个细胞焦亡基因取交集，采用jevnn在线平台绘制韦恩图。转录组学（RNA-seq）和蛋白组学（Pro-DIA）测序由上海欧易生物技术有限公司完成。采用TRIzol 试剂提取总 RNA，经RNA质量和完整性评估，采用 llumina Novaseq 6000测序平台进行转录组测序。提取样品中总蛋白，进行蛋白浓度测定及SDS-PAGE检测；对样品进行LC-MS/MS鉴定，采用timsTOF HT质谱仪，通过DIA技术采集每个样品的质谱数据，进行谱图匹配、定量信息的提取和数据分析。MOD组与CON组大鼠表达水平变化倍数Fold change≥2.0且P<0.05认定为差异基因和差异蛋白，并对其进行GO功能聚类分析。

1.5 检测指标及方法

1.5.1 大鼠一般情况

观察大鼠一般行为学表现，包括进食量、毛发色泽、精神状态、行为活动等。

1.5.2 取材

治疗结束后第1个动情期取材，予异氟烷吸入麻醉后行腹主动脉取血，每只大鼠收集5~8 mL全血，在室温下静置1~2 h后以3000 r/min离心15 min，取上清液，置于-80 ℃冰箱储存并尽快检测。取左侧中段子宫组织于4%多聚甲醛溶液中固定，依次脱水、石蜡包埋备用。剩余组织放至冻存管，液氮中速冻后保存至-80 ℃冰箱。

1.5.3 双荧光素酶实验验证

使用TargetScan网站预测miR-223-3p与NLRP3的结合位点，将包含rno-miR-223的载体（上海吉凯基因）和包含靶位点的NLRP3野生型（wt-NLRP3）或突变型（mut-NLRP3）的GV272-荧光素酶载体（上海吉凯基因）共转染293T细胞，以TRAF6 3'-UTR的萤光素酶载体作为3'-UTR的阳性对照，检测与hsa-miR-146b载体的靶向关系，对转染体系进行校正。在转染后48 h收集细胞进行检测。

1.5.4 HE染色法观察大鼠子宫病理形态

将石蜡包埋的组织切片，厚度约4 μm。按流程进行脱蜡复水，苏木精染色，伊红复染，二甲苯透明，中性树脂封片等，于光镜下观察大鼠子宫形态。

1.5.5 RT-qPCR法检测大鼠子宫组织miR-223-3p、NLRP3表达

取20 mg大鼠子宫样品，采用Nuclezol法提取总RNA，测量RNA的浓度和纯度。采用试剂盒将RNA逆转录为cDNA，miRNA采用茎环法进行逆转录，使用PCR扩增仪扩增。扩增条件为：95℃预变性2 min；95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸30 s，共40个循环，充分延伸，采集荧光，反应结束后，获得扩增曲线和熔解曲线。采用2^-△△Ct法计算目的基因的相对表达量。引物序列见表1。

1.5.6 ELISA法检测大鼠血清IL-1β、IL-18含量

将待测血清样品及试剂盒于室温中平衡30 min，按照ELISA说明书，逐步进行孵育和显色后滴加终止液，迅速于酶标仪测各孔吸光度A_{450 nm} 值。

1.5.7 Western blotting法检测大鼠子宫组织细胞焦亡蛋白表达

称取20 mg冻存的子宫组织，加入200 μL RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂（50∶1），于4 ℃静置30 min，研磨后离心，留取含蛋白的上清液。BCA法测定蛋白浓度，按步骤完成电泳、转膜、封闭。一抗NLRP3（1∶1000）、ASC（1∶1000）、Caspase-1（1∶2000）、GSDMD （1∶1000）、GAPDH（1∶10000） 4 ℃孵育过夜。加入对应种属的山羊抗兔IgG（H+L）（1∶5000）、山羊抗鼠IgG（H+L）（1∶5000），室温孵育1h，滴加发光液，于成像仪中曝光。采用ImageJ软件分析蛋白条带的灰度值，以目标条带与内参GAPDH灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

1.5.8 大鼠妊娠功能评价

治疗结束后第1个动情期，各组8只大鼠进行妊娠实验，雌∶雄以2∶1合笼，查见阴栓或次日阴道涂片见精液记为妊娠第0.5天，于妊娠14.5 d取材，分别统计各组的患侧妊娠率，两侧妊娠数量和妊娠总数量，评估大鼠妊娠功能恢复情况。

1.6 统计学分析

采用GraphPad Prism 9.0和SPSS 25.0软件进行数据分析及绘图。计量资料以均数±标准差表示，先行正态分布及方差齐性检验，满足正态分布及方差齐性采用单因素方差分析，否则采用Welch ANOVA分析。不符合正态分布则使用Kraskal wall's检验。计数资料采用卡方检验。采用双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况

CON组大鼠毛色光泽，精神良好，行动灵敏；造模后的大鼠毛色暗淡，精神稍差，活动和进食量减少，3~5 d后逐渐恢复；MOX组大鼠治疗期间进食量及排便量多于MOD组及CON组。

2.2 数据库检索及高通量测序结果

GeneCards数据库中共检索到2009个薄型子宫内膜的靶基因，共13个与细胞焦亡通用靶标基因相交（图1A）：CASP3、CASP8、CASP9、ELANE、IL-1β、IL-18、IL-6、NLRP3、NLRP7、NOD1、NOD2、PRKACA、TNF。对MOD组和CON组大鼠的差异基因和蛋白进行GO 富集分析，筛选出生物过程（BP）对应的-log₁₀ P值最大的前20 个条目，发现炎症反应在转录组和蛋白组分析中均上调（图1B、C）。

2.3 双荧光素酶报告结果

与miR-223-3p质粒共转染后，wt-NLRP3 产生的荧光素酶强度较NC-NLRP3降低（P<0.01）；相反mut-NLRP3的荧光素酶活性较NC-NLRP3升高（P<0.01）。相比阳参miRNA NC group（TRAF6+NC-miR-223-3p），阳参miRNA组（TRAF6+miR-146b）相对荧光强度下降（P<0.01），符合miR-146b和阳参靶基因TRAF6的调控机制，证明转染检测体系可信（图2）。

2.4 大鼠子宫内膜病理形态比较

CON组大鼠子宫结构完整，各层分界清晰，子宫内膜厚度正常，腺体及血管丰富，腺上皮及管腔上皮排列规则。MOD组子宫内膜间质细胞水肿，腺上皮缺失，排列紊乱，内膜厚度变薄（P<0.001），腺体（P<0.01）及血管减少（P<0.001），符合薄型子宫内膜的病理表现。MOX较MOD子宫内膜增厚（P<0.001），腺上皮较为完整，腺体（P<0.01）和血管增多（P<0.001，图3）。

2.5 大鼠子宫组织miR-223-3p、NLRP3 表达

与CON比较，MOD组大鼠miR-223-3p表达差异无统计学意义（P>0.05），NLRP3的mRNA相对表达量明显升高（P<0.05）；与MOD比较，MOX组miR-223-3p的表达上调（P<0.05），同时NLRP3被抑制（P<0.05，图4）。

2.6 大鼠血清IL-1β、IL-18水平比较

与CON比较，MOD组大鼠血清IL-1β、IL-18含量升高（P<0.01）；与MOD比较，MOX组IL-1β（P<0.001）、IL-18（P<0.05）含量均降低（图5）。

2.7 大鼠子宫组织NLRP3、ASC、Caspase-1、 GSDMD蛋白表达比较

与CON比较，MOD组大鼠NLRP3（P<0.01）、ASC（P<0.05）、Caspase-1（P<0.01）、GSDMD（P<0.01） 的蛋白相对表达量升高；艾灸下调了模型大鼠的NLRP3（P<0.01）、ASC（P<0.05）、Caspase-1（P<0.01）、GSDMD（P<0.01）表达（图6）。

2.8 大鼠妊娠情况比较

与CON比较，MOD组大鼠患侧妊娠率下降（P<0.05），患侧及健侧妊娠数量（P<0.01）和妊娠总数量均减少（P<0.001），提示薄型子宫内膜大鼠妊娠功能严重受损。艾灸增加了健侧妊娠数量（P<0.05）和妊娠总数量（P<0.001），同时有助于患侧妊娠率和妊娠数量的提高，但差异无统计学意义（表2）。各组孕鼠胚胎发育情况良好（图7）。

3 讨论

近年来，有人流、宫腔镜等手术操作史的女性大大增加，频繁的宫内操作造成子宫内膜基底层破坏，是TE的主要致病因素。Zong等^［19］发现TE的枢纽基因富集在细胞生长调控、炎症反应调控和自噬通路，这与本研究的测序结果相符。MicroRNA 是天然存在的小 RNA 分子，在调节各种细胞过程（包括炎症）的基因表达中起重要作用。miR-223 优先在粒细胞中表达 ，是 NLRP3 的关键负调节因子^［20］。NLRP3是最具特点的炎症小体，其过度激活促进了多种炎症性疾病的发生发展。NLRP3炎性小体被激活后，与ASC结合将pro-Caspase-1裂解成Caspase-1^［21］，促进了IL-1β、IL-18前体成熟并释放到细胞外，导致炎症级联反应^［22］；同时，炎症小体复合物将GSDMD切割形成活性氮端（GSDME-N），在细胞膜上形成大量直径约10~21 nm 的孔隙，诱导焦亡形成^［23］。本研究通过双荧光素酶实验证实了miR-223-3p可直接与NLRP3的3'UTR 结合并抑制其激活，先前的研究也发现miR-223靶向调节NLRP3在骨关节炎^［24］、肝炎^［9］、肺部感染^［25］等疾病中参与了炎症反应过程。本研究中miR-223-3p在MOD组大鼠的表达未明显下降，而NLRP3的mRNA表达升高，可能因为 miR-223-3p通过翻译后修饰过程对靶基因产生了影响。

TE的治疗以口服雌激素、阿司匹林，或宫腔灌注粒细胞集落刺激因子等药物促进内膜增殖和改善血供为主，长时间雌激素治疗有一定副作用，宫腔灌注治疗也存在操作限制。艾灸是一种传统中医外治法，患者接受度较高，其通过艾条燃烧产生的温热、温通、温补效应达到治疗疾病的作用。“温通”即温通经脉气血，《灵枢·刺节真邪》载：“火气已通，血脉乃行”，艾灸产生的温热作用能加快损伤部位的气血运行速度，促进创面的修复与愈合^［26］。“温补”指艾灸增强体质、补益气血的作用。艾灸“温通、温补”效应相互结合，可以激发人体的正气，共奏温通气血经脉之效。关元为调经要穴，是“男子藏精、女子藏血”之处，具有补益肾气、调理冲任、培元固本、维系胎元之效^{［27， 28］}。艾条燃烧产生的持续温热效应，通过刺激皮肤下的经络气血运行，调理冲任，达到补益气血、化瘀通络的功效。本研究证明了艾灸可以上调miR-223-3p表达，限制NLRP3的激活，减少促炎因子释放，从而抑制细胞焦亡因子的表达，促进子宫内膜修复。综合考虑模型稳定性，病因多样性等因素，本研究选择了TE研究中最为常用且稳定的95%无水乙醇化学损伤法造模。Li等^［29］研究证明，乙醇造模法能模拟TE的病理改变和性激素水平变化。但因其无法完全模拟临床上因手术操作或者宫内感染等病因造成的薄型子宫内膜或宫腔粘连，故未来需要进一步完善艾灸用于不同病因模型的基础研究，以增加结论的普适性。

本研究发现，艾灸治疗后50%的大鼠患侧成功妊娠，健侧妊娠数量和妊娠总数量均增加，提示艾灸关元穴对妊娠功能的改善有一定积极作用。但患侧妊娠率和妊娠数量无统计学意义，推测其原因可能为：妊娠过程受多种因素影响，如子宫内膜蜕膜化、胚胎植入和着床、胎儿生长发育等，艾灸显著改善了乙醇诱导的TE大鼠内膜病理形态，缓解了炎症反应和细胞焦亡，但对子宫内膜蜕膜化和胚胎着床的影响及调控作用尚不明确；大鼠妊娠率和胚胎数量的变化初步评估了妊娠功能恢复情况，但难以全面反应完整妊娠过程的变化，艾灸对胚胎生长发育各个阶段的影响及具体调控机制，需要进行更细化和深入的研究。MOD组健侧妊娠数量较CON组明显减少，其原因可能为子宫内膜损伤引起全身炎症反应的激活，表现为血清中促炎因子增多，炎症反应会引起子宫收缩的节律紊乱，影响胚胎的血液供应，导致胚胎发育不良^［30］；同时，炎症环境也会导致子宫内膜的免疫微环境异常，不利于胚胎植入^［31］。先前研究证实了艾灸能改善血管新生，从而加速创面愈合^［32］，本研究MOX组健侧妊娠数量和妊娠总数量的增加可能是艾灸的“温热”和“温通”效应改善了子宫内膜微循环血供，促进了血管生成，提升了胚胎侵入过程中内膜血管的通透性与稳定性，使宫腔内妊娠环境得到优化。下一步可从性激素水平、血管生成、子宫内膜容受性调控等角度更为全面地探讨艾灸的作用机制。

有研究^［33-36］证实了艾灸关元穴联合中西药治疗有助于改善TE患者的子宫内膜厚度，提升内膜容受性和临床妊娠率。本研究通过动物实验验证了艾灸在体内的疗效及其可能的作用机制，进一步佐证了临床试验的结果。本实验中艾灸的治疗周期为3周，结合大鼠动情周期规律与女性月经周期的变化，推导至临床应用时建议患者的治疗周期为3个月为宜，这与目前临床治疗周期吻合^［33-36］。另外，临床应用时应考虑到女性月经期出血现象，嘱患者于月经干净后开始艾灸，15 min/d，经期停止，该治疗方案的可行性在先前的研究中得以证实^［34］。

综上，本研究发现艾灸关元穴通过上调miR-223-3p，抑制NLRP3激活诱导的细胞焦亡，促进了大鼠子宫内膜修复和妊娠功能恢复。本实验为艾灸的临床应用提供了一定的实验基础，为进一步研究其作用机制提供了思路。

参考文献

[1] 佟亚菲, 王晓红. 辅助生殖技术中异常子宫内膜诊疗的中国专家共识解读[J]. 实用妇产科杂志, 2020, 36(4): 257-60.

[2] Roy KK, Baruah J, Sharma JB, et al. Reproductive outcome following hysteroscopic adhesiolysis in patients with infertility due to Asherman's syndrome[J]. Arch Gynecol Obstet, 2010, 281(2): 355-61. doi：10.1007/s00404-009-1336-1

[3] Kasius A, Smit JG, Torrance HL, et al. Endometrial thickness and pregnancy rates after IVF: a systematic review and meta-analysis[J]. Hum Reprod Update, 2014, 20(4): 530-41. doi：10.1093/humupd/dmu011

[4] von Wolff M, Fäh M, Roumet M, et al. Thin endometrium is also associated with lower clinical pregnancy rate in unstimulated menstrual cycles: a study based on natural cycle IVF[J]. Front Endocrinol (Lausanne), 2018, 9: 776. doi：10.3389/fendo.2018.00776

[5] Maekawa R, Taketani T, Mihara Y, et al. Thin endometrium transcriptome analysis reveals a potential mechanism of implantation failure[J]. Reprod Med Biol, 2017, 16(2): 206-27. doi：10.1002/rmb2.12030

[6] Sundaram B, Pandian N, Mall R, et al. NLRP12-PANoptosome activates PANoptosis and pathology in response to heme and PAMPs[J]. Cell, 2023, 186(13): 2783-801. e20. doi：10.1016/j.cell.2023.05.005

[7] Fu YJ, Mackowiak B, Feng DC, et al. microRNA-223 attenuates hepatocarcinogenesis by blocking hypoxia-driven angiogenesis and immunosuppression[J]. Gut, 2023, 72(10): 1942-58. doi：10.1136/gutjnl-2022-327924

[8] Zhao G, Jiang KF, Yang YP, et al. The potential therapeutic role of miR-223 in bovine endometritis by targeting the NLRP3 inflammasome[J]. Front Immunol, 2018, 9: 1916. doi：10.3389/fimmu.2018.01916

[9] Calvente CJ, Tameda M, Johnson CD, et al. Neutrophils contribute to spontaneous resolution of liver inflammation and fibrosis via microRNA-223[J]. J Clin Invest, 2019, 129(10): 4091-109. doi：10.1172/jci122258

[10] 伍娟娟, 邓海婷, 严斯琪, 等.补肾调冲汤对薄型子宫内膜大鼠细胞焦亡的作用研究[J].中药材, 2021, 44(9): 2179-83.

[11] 王晓梅, 穆敬平, 丁光宏, 等. 艾灸效应的红外物理特性研究进展[J]. 辽宁中医药大学学报, 2010, 12(4): 63-6.

[12] 胡玉姣, 夏良君, 姚 兵, 等. 麦粒灸对大鼠薄型子宫内膜的修复作用[J]. 中国针灸, 2019, 39(9): 963-9.

[13] 韩兴军, 王 璇. 脐疗治疗肾虚血瘀型排卵障碍性不孕症的机理与临床疗效研究[J]. 中国中医基础医学杂志, 2017, 23(7): 999-1000, 1008.

[14] 庄海娜, 钱 婧, 杨泽冠, 等. 针灸改善子宫内膜容受性的临床研究特点分析[J]. 中医学报, 2019, 34(5): 1126-30.

[15] 寇任重, 邹洋洋, 张建斌. 艾灸关元穴生物学效应及其影响因素探讨[J]. 中国针灸, 2016, 36(12): 1273-7. doi：10.13703/j.0255-2930.2016.12.013

[16] 姚志城, 黄小冰, 卓善蓝, 等. 督灸联合柳氮磺吡啶治疗早中期强直性脊柱炎疗效观察[J]. 上海针灸杂志, 2022, 41(12): 1200-4. doi：10.13460/j.issn.1005-0957.2022.12.1200

[17] 许春燕, 宋 阳, 李坤寅, 等. 薄型子宫内膜模型的动物选择及其造模方法改进[J]. 中国实验动物学报, 2016, 24(2): 217-20. doi：10.3969/j.issn.1005-4847.2016.02.021

[18] 中国针灸学会. 实验动物常用穴位名称与定位第2部分: 大鼠[J]. 针刺研究, 2021, 46(4): 351-2.

[19] Zong L, Zheng SX, Meng Y, et al. Integrated transcriptomic analysis of the miRNA-mRNA interaction network in thin endometrium[J]. Front Genet, 2021, 12: 589408. doi：10.3389/fgene.2021.589408

[20] Bauernfeind F, Rieger A, Schildberg FA, et al. NLRP3 inflamm-asome activity is negatively controlled by miR-223[J]. J Immunol, 2012, 189(8): 4175-81. doi：10.4049/jimmunol.1201516

[21] Yu ZW, Zhang J, Li X, et al. A new research hot spot: The role of NLRP3 inflammasome activation, a key step in pyroptosis, in diabetes and diabetic complications[J]. Life Sci, 2020, 240: 117138. doi：10.1016/j.lfs.2019.117138

[22] Luo T, Jia X, Feng WD, et al. Bergapten inhibits NLRP3 inflammasome activation and pyroptosis via promoting mitophagy[J]. Acta Pharmacol Sin, 2023, 44(9): 1867-78. doi：10.1038/s41401-023-01094-7

[23] Wang YQ, Kanneganti TD. From pyroptosis, apoptosis and necroptosis to PANoptosis: a mechanistic compendium of pro-grammed cell death pathways[J]. Comput Struct Biotechnol J, 2021, 19: 4641-57. doi：10.1016/j.csbj.2021.07.038

[24] Liu WX, Liu AQ, Li XJ, et al. Dual-engineered cartilage-targeting extracellular vesicles derived from mesenchymal stem cells enhance osteoarthritis treatment via miR-223/NLRP3/pyroptosis axis: Toward a precision therapy[J]. Bioact Mater, 2023, 30: 169-83. doi：10.1016/j.bioactmat.2023.06.012

[25] Zhang D, Lee H, Wang XY, et al. A potential role of microvesicle-containing miR-223/142 in lung inflammation[J]. Thorax, 2019, 74(9): 865-74. doi：10.1136/thoraxjnl-2018-212994

[26] 陈宝珍. 消化性溃疡中医证候与相关因素的研究[D]. 福州: 福建中医药大学, 2014.

[27] 李凌云, 陈文裕, 廖剑艺, 等. 针刺配合滋肾填精方对子宫内膜薄性不孕症的影响[J]. 上海针灸杂志, 2020, 39(4): 411-5.

[28] 马娟娟, 张勤华, 翁晓晨, 等. 温针灸对IVF-ET肾阳虚型反复移植失败患者子宫内膜容受性及妊娠结局的影响[J]. 上海针灸杂志, 2018, 37(12): 1339-44. doi：10.13460/j.issn.1005-0957.2018.12.1339

[29] Li CC, Tan XY, Deng DS, et al. A dopamine-modified hyaluronic acid-based mucus carrying phytoestrogen and urinary exosome for thin endometrium repair[J]. Adv Mater, 2024, 36(39): 2407750.

[30] Pinto V, Matteo M, Tinelli R, et al. Altered uterine contractility in women with chronic endometritis[J]. Fertil Steril, 2015, 103(4): 1049-52. doi：10.1016/j.fertnstert.2015.01.007

[31] 江奕楠, 生秀杰. 子宫内膜炎与不孕的关系[J]. 中国实用妇科与产科杂志, 2025, 41(3): 263-8.

[32] 薛慧琴, 丁 劲, 陈若岚, 等. 不同灸温对2期压力性损伤大鼠创面修复的实验研究[J]. 护理学杂志, 2024, 39(8): 70-3, 96.

[33] 江 亮, 王 安, 胥杜鹃, 等. 针灸在IVF-ET周期中辅助治疗薄型子宫内膜(肾阳虚证)不孕患者的临床应用研究[J]. 现代诊断与治疗, 2024, 35(4): 479-81.

[34] 黎玉婷, 刘桂英, 何志群, 等. 补肾活血中药联合艾灸治疗薄型内膜不孕患者40例疗效观察[J]. 云南中医中药杂志, 2020, 41(6): 31-3.

[35] 秦爱华, 林 燕, 邓佳妮. 补肾调经汤联合温和灸法对辅助生殖子宫内膜薄的临床观察[J]. 世界中医药, 2019, 14(12): 3364-8. doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.12.059

[36] 李 月, 陈惠芳, 曾 伟, 等. 悬灸加阿司匹林治疗对于薄型子宫内膜修复的临床研究[J]. 中医临床研究, 2018, 10(29): 102-4.

基金资助

广东省自然科学基金(2024A1515012194)

国家中医药传承发展示范试点项目-中山市中医院中医药科研立项(YN2024B008)

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