强骨康疏方通过抑制HIF-1α/BNIP3自噬信号通路减少类风湿性关节炎大鼠的破骨细胞分化

Qianggu Kangshu Formula attenuates osteoclast differentiation in rheumatoid arthritis by inhibiting the HIF-1α/BNIP3 autophagy signaling pathway

摘要

目的 研究强骨康疏方（QGKSF）对HIF-1α/BNIP3自噬信号通路的调控作用及其改善类风湿关节炎的作用机制。 方法 制备含药血清，RAW264.7细胞体外培养，低氧+RANKL诱导破骨细胞。分别设置对照组、模型组、甲氨蝶呤组（MTX）、 QGKSF低剂量组（QGKSF-L）、QGKSF高剂量组（QGKSF-H）。CCK-8法检测细胞活力；TRAP染色观察各组TRAP阳性多核细胞的数量；鬼笔环肽染色检测F-肌动蛋白环形成情况；MDC染色观察自噬泡；透射电镜观察自噬小体；ELISA检测炎症细胞因子（IL-6、TNF-α）水平；Western blotting检测HIF-1α、BNIP3、Bcl-2、Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、P62、TRAP的蛋白水平； RT-qPCR检测HIF-1α、BNIP3、Bcl-2、Beclin1、LC3、P62、TRAP的mRNA水平。 结果 与对照组比较，模型组可见大量TRAP阳性细胞，F-肌动蛋白环形成增多，自噬荧光强度增加，自噬小体增多（P<0.001）；与模型组比较，MTX组、QGKSF-L组和QGKSF-H组的TRAP阳性细胞数量和F-肌动蛋白环形成减少，自噬荧光强度减弱，自噬小体减少（P<0.01）。与对照组相比，模型组IL-6、TNF-α水平升高（P<0.001）；经过MTX和QGKSF治疗后IL-6、TNF-α水平有所降低（P<0.001）。与对照组相比，模型组HIF-1α、BNIP3、Bcl-2、Beclin1、LC3、TRAP蛋白及mRNA水平升高，P62蛋白及mRNA水平降低（P<0.01）；经MTX及QGKSF治疗后，HIF-1α、BNIP3、Bcl-2、Beclin1、LC3、TRAP蛋白及mRNA水平降低，P62蛋白及mRNA水平升高（P<0.05）。 结论 低氧条件下，QGKSF可能通过抑制HIF-1α/BNIP3自噬信号通路来减少RANKL诱导的RAW264.7向破骨细胞分化，从而发挥治疗RA骨破坏的作用。

Abstract

Objective To investigate the effect of Qianggu Kangshu Formula (QGKSF) for alleviating osteoclast differentiation in rheumatoid arthritis and the underlying mechanism. Methods RAW264.7 cells cultured under hypoxic conditions were treated with RANKL to induce osteoclast differentiation and incubated with normal rat serum or sera from rats medicated with methotrexate (MTX) or QGKSF at low and high doses. Cell viability, TRAP-positive multinucleated cells and F-actin ring formation in the treated cells were assessed with CCK-8 assay, TRAP staining and Phalloidin staining, respectively. Autophagy and autophagosomes in the cells were observed with MDC staining and transmission electron microscopy. ELISA was used to measure IL-6 and TNF-α levels in the culture supernatant, and the expressions of HIF-1α, BNIP3, Bcl-2, Beclin1, LC3-I, LC3-II, P62 and TRAP mRNAs and proteins were analyzed using RT-qPCR and Western blotting. Results In hypoxia- and RANKL-induced RAW264.7 cells treated with normal rat serum, significant increments of TRAP-positive cells and F-actin ring formation were observed with an enhanced autophagic fluorescence intensity and increased autophagosomes. Treatment of the induced cells with rat sera medicated with MTX and low- and high-dose QGKSF obviously reduced the TRAP-positive cells, F-actin rings and autophagosomes as well as the autophagic fluorescence intensity. RANKL treatment significantly increased IL-6 and TNF-α levels in RAW264.7 cells, which were obviously decreased by treatment with MTX- and QGKSF-medicated sera. RANKL also significantly increased the mRNA and protein expression levels of HIF-1α, BNIP3, Bcl-2, Beclin1, LC3 and TRAP and lowered P62 expressions, and these changes were effectively reversed by treatment with MTX- and QGKSF-medicated sera. Conclusion QGKSF attenuates RANKL-induced osteoclast differentiation in hypoxic RAW264.7 cells by inhibiting the HIF-1α/BNIP3 autophagy signaling pathway, suggesting its potential for treatment of bone destruction in rheumatoid arthritis.

Graphical abstract

关键词

强骨康疏方 / 类风湿关节炎骨破坏 / 自噬 / HIF-1α/BNIP3信号通路 / 破骨细胞

Key words

Qianggu Kangshu Formula / rheumatoid arthritis bone destruction / autophagy / HIF-1α/BNIP3 signaling pathway / osteoclasts

类风湿关节炎（RA）是一种以关节炎症、增生肿胀、软骨和骨破坏为特征的慢性炎症性关节疾病^{［1， 2］}。RA患者的骨破坏是由炎症过程中破骨细胞（OC）的激活引起^［3］。RA中存在缺氧情况，缺氧可诱发自噬以激活OC，从而导致骨和软骨的破坏^{［4， 5］}。在缺氧条件下，缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）表达显著增加，伴随地诱导Bcl-2-腺病毒 E1B 相互作用蛋白3（BNIP3）表达上调，BNIP3与Bcl-2相互作用，阻止Bcl-2与Beclin1结合，而释放的Beclin1则激活自噬信号通路^［6］。因此，可以通过抑制HIF-1α/BNIP3信号通路来抑制自噬，从而抑制OC生成，这可能是治疗RA骨破坏的新策略。

目前，现代医学对RA的治疗仅能缓解RA患者临床肿痛症状，不能阻止疾病进展、防治骨破坏，并可能引发胃肠道、肝功能损伤等不良反应^［7］。中药因其具有多成分、多靶点、副作用少等特点，在RA的治疗中得到广泛应用。强骨康疏方（QGKSF）是湖北民族大学附属民大医院基于“补肾活血”法，并结合长期临床经验制成的治疗RA骨破坏的方药。前期实验发现QGKSF总提取物能够有效抑制OC的生成，抑制骨破坏相关酶类的活性^［8］。但其能否在低氧条件下抑制OC生成目前尚不清楚。本研究采用小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7），通过低氧+RANKL诱导其分化，建立OC模型，探讨低氧环境下QGKSF对OC的作用，观察其对HIF-1α/BNIP3自噬信号通路的影响，研究其潜在作用机制，为QGKSF治疗RA的临床应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级SD雄性大鼠28只，体质量230~260 g（湖北贝恩特生物科技有限公司），许可证号：SCXK（鄂）2021-0027，饲养于湖北民族大学风湿性疾病发生与干预湖北省重点实验室。本研究经湖北民族大学医学伦理委员会审核批准（伦理批号：2023065）。

1.2 细胞株

小鼠单核-巨噬细胞系RAW264.7（武汉普诺塞生命科技有限公司）。

1.3 药物及试剂

QGKSF药物由湖北民族大学附属民大医院中药房提供。DMEM培养基、胎牛血清、CCK-8试剂盒、Actin-Tracker Green-488、免疫染色固定液、免疫染色洗涤液、免疫荧光染色二抗稀释液、PMSF蛋白酶抑制剂（大连美仑有限公司）；抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒（Solarbio）；细胞自噬染色检测试剂盒（MDC法）（美谷生物科技有限公司）；RANKL（PEPROTECH）；RIPA裂解液（武汉塞维尔生物科技有限公司）；ECL超敏发光液（武汉科瑞生物科技有限公司）；逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒（新贝生物公司）；PAGE凝胶快速制备试剂盒7.5%，12.5%（上海雅酶生物医药科技有限公司）；anti-TRAP、anti-BNIP3、Goat Anti-Rabbit IgG、Goat Anti-Mouse IgG、预染蛋白Marker（ABclonal生物科技有限公司）；anti-βactin（Servicebio 科技有限公司）；anti-P62、anti-LC3、anti-Beclin1、anti-BCL-2（Proteintech）；anti-Hif-1α（Bioss生物技术有限公司）。

1.4 主要仪器

Galaxy 170 R低氧培养箱（New Brunswick）；Multiskan FC 多功能酶标仪（Thermo Scientific）；CKX41-C31B 倒置荧光显微镜（奥林巴斯有限公司）；ImageQuantLAS4000mini生物分子成像仪（GE）；HT7700 透射电子显微镜（HITACHI）；153BR79456电泳仪、153BR79456电转膜仪（Bio-Rad）；Light Cycler480Ⅱ实时荧光定量PCR仪（Roche）。

1.5 方法

1.5.1 QGKSF药物煎煮

QGKSF由淫羊藿20 g、三百棒15 g、续断20 g、骨碎补15 g、鸡血藤15 g、当归15 g、黄精10 g、山药10 g组成。药物煎煮方法参考中华药典标准，将药物用10倍水浸泡1 h后，煎煮1 h，滤渣后再加入10倍水量煎煮1 h，合并水煎液，纱布过滤3次，经旋转蒸发仪浓缩至126 mL，终浓度为6.3 g/mL，4 ℃冷藏备用。

1.5.2 含药血清制备

基于相关文献及课题组前期研究^{［9， 10］}，为确保后续实验含药血清用量充足，本实验选取28只雄性SD大鼠适应性喂养1周后随机分为4组（7只/组）：空白组、甲氨蝶呤（MTX）组、QGKSF低剂量（QGKSF-L）组和QGKSF高剂量（QGKSF-H）组。空白组予灭菌蒸馏水灌胃，MTX组给药剂量参考60 kg成人临床常用剂量5~10 mg/kg折算成大鼠剂量1 mg/kg^［11］，QGKSF药物浓度根据大鼠与人用药剂量体表面积换算法，低、高剂量组分别予6.3 g/kg、25.2 g/kg灌胃。各组大鼠均连续给药3 d，早晚各1次，间隔8 h，末次给药2 h后于腹腔注射20%乌拉坦进行麻醉，无菌条件下行腹主动脉取血。常温静置后离心取上清液，进一步灭菌、过滤除菌，标记好后于-80 ℃贮存备用。

1.5.3 细胞培养与分组

将RAW264.7细胞用含10%热灭活胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基，在37 ℃、5% CO₂饱和湿度的培养箱中进行培养。倒置显微镜下观察细胞生长情况，隔天换液，当细胞生长至80%~90%时，轻轻吹打细胞，使贴壁细胞脱落，按1∶3的比例进行传代。将细胞分为对照组（常氧条件+正常血清），模型组（低氧条件+正常血清+RANKL100 ng/mL），MTX组（低氧条件+MTX含药血清+RANKL100 ng/mL），QGKSF-L和QGKSF-H组（低氧条件+QGKSF低、高剂量含药血清+RANKL100 ng/mL）。

1.5.4 低氧条件下建立破骨细胞模型

RAW264.7细胞经计数后按1×10⁴/cm²的浓度接种于培养板，加入100 ng/mL RANKL诱导其分化。将培养板放入低氧培养箱中，使装置内的氧浓度维持在约1%。培养120 h后显微镜下观察，出现细胞核数目大于3个的阳性细胞即为破骨细胞，视为造模成功。

1.5.5 CCK-8法检测低氧条件下QGKSF及MTX对细胞活力的影响

取处于对数生长期的RAW264.7细胞，调整细胞密度为2×10³/mL，100 μL/孔接种于96孔板。细胞分组（同1.5.3），每组设置3个复孔。分别干预72 h、120 h后，将含有10 % 0.5 mg/mL CCK-8试剂的细胞培养基加入每孔，避光孵育30 min。用酶标仪测量各孔的吸光度A_{450 nm}，计算细胞存活率。每个实验重复3次。公式：存活率=（A_干预组-A_对照组）/（A_空白组-A_对照组）×100%。

1.5.6 TRAP染色观察各组细胞TRAP阳性多核细胞数量

按1.5.3进行分组和药物干预，120 h后弃去孔内培养基，PBS清洗2次，固定液室温固定5 min，三蒸水清洗，TRAP染液37 ℃水浴锅内孵育1 h，三蒸水洗涤，室温晾干，甘油封片，镜下观察，选取细胞核≥3个的TRAP阳性细胞视为破骨细胞，进行计数。

1.5.7 鬼笔环肽染色观察F-肌动蛋白环形成情况

按1.5.3进行分组和药物干预，120 h后弃去孔内培养基，PBS洗涤3次，室温下4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗涤3次，加入0.1%的Triton X-100透膜10 min，5% BSA封闭60 min，PBS洗涤3次，DAPI核染3 min，PBS洗涤3次，镜下观察拍照。

1.5.8 MDC染色法标记自噬泡

按1.5.3进行分组和药物干预，120 h后弃去孔内培养基，1×Wash Buffer，300 μL洗涤3次，将MDC染液与1×Wash Buffer 1∶9混合，加入100 μL/孔混合后的染液，室温避光孵育45 min。荧光显微镜下观察、计数并拍照。

1.5.9 透射电子显微镜观察自噬小体

按1.5.3进行分组和药物干预，120 h后弃去孔内培养基。加入4 ℃预冷的电镜专用固定液固定1~2 h。细胞刮刀刮下细胞转移至10 mL的离心管，2000 r/min离心5 min。弃去上清液，PBS洗涤3次后将样品浸入2.5 %戊二醛溶液中固定2~4 h。琼脂预包埋，磷酸漂洗液漂洗3次，1%锇酸4 ℃固定2 h；ddH₂O漂洗3次后乙醇梯度脱水，环氧丙烷过渡，812树脂梯度渗透后包埋，60 ℃聚合。包埋块进行超薄切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅双染色切片，用透射电镜观察细胞超微结构。

1.5.10 ELISA检测细胞培养上清液中炎症因子水平

按1.5.3进行分组和药物干预，72 h后收集细胞上清液，使用TNF-α和IL-6 ELISA试剂盒检测细胞因子含量。按照试剂盒说明书进行操作，使用酶标仪测量吸光度A_{450 nm}，并计算炎症因子浓度。

1.5.11 Western blotting检测相关蛋白表达

按1.5.3进行分组和药物干预，72 h后离心收集细胞，加入RIPA裂解液、PMSF蛋白酶抑制剂，离心取上清，BCA法测定蛋白浓度。依次加样、电泳分离（浓缩胶电压80 V，30 min；分离胶电压120 V， 60 min）、转膜（280 V， 90 min）、室温封闭15 min，孵育一抗（β-actin体积稀释比例为1∶5000，其余均为1∶1000），孵育二抗（1∶5000），TBST洗膜，滴加ECL显色液，凝胶成像仪曝光条带，用Image J计算灰度值。

1.5.12 RT-qPCR检测相关mRNA水平

按1.5.3进行分组和药物干预，72 h后用Trizol一步法提取总RNA，-80 ℃保存备用。实时荧光定量PCR选用10 µL反应体系，反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s， 60 ℃ 30 s，40个循环。绘制熔解曲线，最终数据以2^-ΔΔCt法进行分析。引物序列由武汉塞维尔生物科技有限公司设计合成（表1）。

1.6 统计学分析

采用GraphPad Prism9.0软件制作图表并对进行统计分析。所有实验独立重复3次，实验结果以均数±标准差表示，对于符合正态分布的实验数据比较采用单因素方差分析，方差齐性时组间比较采用LSD 法，方差不齐时则采用Dunnete's T₃法；实验数据不符合正态分布则用Kruskal-Wallis检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 低氧条件下QGKSF及MTX对细胞活力的影响

CCK-8实验结果显示，72 h后与对照组比较，模型组、MTX组、QGKSF-H组和QGKSF-L组细胞活力无明显变化（P>0.05）；120 h后与对照组相比，模型组、MTX组细胞活力降低（P<0.01，P<0.05），QGKSF-H组和QGKSF-L组细胞活力无明显变化（P>0.05，图1）。

2.2 QGKSF对OC分化的影响

TRAP染色结果显示，与对照组相比，模型组可以观察到许多体积巨大、呈酒红色、内含多个细胞核的破骨细胞（P<0.001）；经QGKSF及MTX干预后，破骨细胞数量明显减少（P<0.001，图2）。

2.3 QGKSF对F-肌动蛋白环的影响

与对照组相比，模型组可以观察到明显的F-肌动蛋白环，并且细胞核数量随着细胞在分化期间融合而减少（P<0.001），MTX和QGKSF干预后，肌动蛋白环不同程度的减少（P<0.001，图3）。

2.4 QGKSF对自噬泡的影响

MDC染色结果显示，与对照组相比，模型组荧光亮度较强（P<0.001）；经MTX和QGKSF给药后，荧光强度变弱（P<0.01，P<0.001，图4）。

2.5 QGKSF对自噬小体的影响

透射电子显微镜观察显示，对照组细胞的胞质中展现出了线粒体的正常形态与分布、细胞染色质结构亦保持正常状态，未见明显的自噬小体出现，但可观察到少量自噬溶酶体的存在；相较于对照组，模型组细胞内自噬溶酶体的数量明显增多，并且伴随着较多自噬小体的形成；而经MTX和QGKSF干预后，细胞内自噬小体和自噬溶酶体的数量相较于模型组减少（图5）。

2.6 QGKSF对相关炎症因子的影响

ELISA实验结果显示，与对照组比较，模型组的IL-6和TNF-α的含量升高（P<0.001）；与模型组比较，MTX组、QGKSF-H组的IL-6和TNF-α含量降低（P<0.001），QGKSF-L组TNF-α含量降低（P<0.001，图6）。

2.7 QGKSF对OC、自噬及通路相关蛋白表达的影响

Western blotting实验结果显示，与对照组相比，模型组TRAP蛋白表达水平上升（P<0.001）；与模型组比较，MTX和QGKSF-H组TRAP蛋白水平降低（P<0.05）。与对照组相比，模型组Bcl-2、Beclin1、LC3-Ⅱ的蛋白表达水平增加（P<0.01，P<0.001），P62蛋白表达水平减少（P<0.001）；与模型组相比，MTX组、QGKSF-H组和QGKSF-L组Bcl-2、Beclin1、LC3-Ⅱ的蛋白表达水平降低（P<0.05），P62蛋白表达水平升高（P<0.01，P<0.001）。与对照组相比，模型组HIF-1α、BNIP3蛋白表达水平升高（P<0.001）；与模型组相比，MTX组、QGKSF-H组和QGKSF-L组的HIF-1α、BNIP3蛋白表达水平降低（P<0.05，图7）。

2.8 QGKSF对OC、自噬和通路相关mRNA水平的影响

RT-qPCR结果显示，与对照组比较，模型组TRAP的mRNA水平升高（P<0.001）；经MTX和QGKSF治疗后，TRAP的mRNA水平降低（P<0.05）。与对照组比较，模型组Bcl-2、Beclin1、LC3 mRNA水平升高（P<0.001），P62 mRNA水平降低（P<0.001）；与模型组比较，MTX、QGKSF-H组和QGKSF-L组BCL-2、Beclin1、LC3 mRNA水平降低（P<0.01，P<0.001），MTX组、QGKSF-H组的P62 mRNA水平升高（P<0.01）。与对照组比较，模型组的HIF-1α、BNIP3 mRNA水平升高（P<0.001）；经过MTX和QGKSF治疗后HIF-1α、BNIP3 mRNA水平降低（P<0.001，图8）。

3 讨论

RA是一种以滑膜增生和关节组织进行性破坏为特征的慢性疾病，对称性关节肿痛为其主要表现，晚期可出现关节强直或畸形，功能严重受损^［12］。研究表明，RA患者滑膜存在缺氧微环境，滑膜缺氧是RA的致病因素之一^［13］。缺氧会增加OC的数量和活性，导致骨吸收增强^［14］，抑制OC的分化或下调其功能是治疗RA骨破坏的希望。HIF-1α是细胞应对缺氧反应的主要组成部分，然而，HIF-1α对OC的直接影响尚未完全阐明^［15］。因此，本实验通过在缺氧环境下构建OC模型来探讨QGKSF如何通过下调HIF-1α通路改善RA骨破坏。

强骨康疏方是湖北民族大学附属民大医院通过临床实践，不断加减化裁而成的治疗RA骨破坏的经验方，临床应用多年，疗效确切。已有研究表明，QGKSF可能通过下调TRAP、MMP-9以及OC分化关键转录因子NFATc1的表达来有效抑制OC的生成，抑制骨破坏相关酶类的活性^［8］。然而，QGKSF在缺氧条件下的作用机制尚不清楚。因此，本实验进一步探索了QGKSF改善缺氧诱导的OC的可能机制。在本研究中，模型组可以观察到许多体积巨大、内含多个细胞核的OC，并且F-肌动蛋白环紧密围绕在细胞表面。这使OC能够将氢离子和裂解液分泌到吸收坑中以溶解骨骼^{［16， 17］}。经过QGKSF治疗后OC数量较模型组明显减少，肌动蛋白环面积明显缩小，数量减少。同时，QGKSF降低了TRAP蛋白及mRNA水平。表明QGKSF对缺氧环境下诱导的OC有很好的抑制作用。

许多炎性细胞因子对骨骼具有破坏作用。RA患者的关节腔中存在缺氧环境，会导致大量炎性细胞聚集加重炎症反应^［18］，从而加重RA患者的骨破坏。相关研究表明，在RA中由滑膜巨噬细胞和T细胞产生的TNF-α、IL-1β和IL-6通过不同的信号传导通路促进OC的成熟及分化^{［19， 20］}。本实验中，QGKSF的干预降低了TNF-α和IL-6水平，证明QGKSF具有一定的抗炎作用。研究表明缺氧刺激OC分化，且分化的OC内自噬上调^［21］。由于炎症关节微环境中氧张力的变化，HIF-1α在RA缺氧滑膜中高表达^［22-24］。BNIP3作为HIF-1α下游靶分子，可由缺氧诱导，体内外实验表明它与自噬的启动有关^{［25， 26］}，其表达水平升高并与LC3反应，并诱导包括Beclin1在内的自噬蛋白的表达^［27］。P62与LC3一同调节蛋白聚合物的形成，且P62参与破骨细胞F-肌动蛋白环的形成^［28］。近期研究显示，缺氧触发了RA中BNIP3介导的线粒体自噬和NLRP3炎症介导的细胞焦亡，HIF-1α作为二者共同的调节因子，可能是针对RA滑膜炎的一个重要治疗靶点^［29］。另一研究发现^［30］，抑制BNIP3降低了RA成纤维样滑膜细胞在缺氧下的存活率，同时RA成纤维样滑膜细胞在缺氧条件下通过线粒体自噬清除细胞中积累的ROS，以维持氧化还原平衡，减少细胞凋亡，而缺氧条件下的线粒体自噬正是由BNIP3介导的。所以我们猜测，缺氧条件下QGKSF是否可以通过抑制HIF-1α/BNIP3自噬信号通路来抑制OC生成。本研究显示，QGKSF显著降低了自噬荧光强度，减少了自噬小体的数量，且通过QGKSF的治疗HIF-1α、BNIP3、Bcl-2、Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白及mRNA水平明显下降，P62蛋白及mRNA表达水平升高。这提示缺氧条件下，QGKSF可抑制HIF-1α/BNIP3信号通路来降低自噬水平，减少OC生成。

综上所述，在缺氧条件下QGKSF可能通过抑制HIF-1α/BNIP3自噬信号通路来减少OC的分化，进而影响骨代谢过程，发挥抗RA骨破坏的作用。这一发现为临床进一步科学使用QGKSF治疗RA骨破坏提供了新的思路。

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