TGF-β通过miR-23a-3p/IRF1轴下调主要组织相容性复合体I类表达促进肝癌免疫逃逸

The TGF‑β/miR-23a-3p/IRF1 axis mediates immune escape of hepatocellular carcinoma by inhibiting major histocompatibility complex class I

摘要

目的 探讨肝癌细胞中转化生长因子-β（TGF-β）调控主要组织相容性复合体I类（MHC-I）分子的机制及其在肿瘤免疫逃逸中的作用。 方法 设置对照组、TGF-β处理组及TGF-β联合TGF-β Ⅰ型受体抑制剂SB-431542干预组，通过Western blotting和RT-qPCR评估TGF-β对肝癌细胞MHC-I表达水平的影响；通过RNA转染及其干扰技术、RT-qPCR和Western blotting实验探究TGF-β调控肝癌细胞MHC-I表达水平的分子机制。将各组肝癌细胞与健康人外周血单个核细胞（PBMC）共培养，采用CCK-8、克隆形成实验检测肿瘤增殖能力；通过乳酸脱氢酶（LDH）释放实验、线粒体膜电位检测量化T细胞杀伤效率，并利用流式细胞术及ELISA分析T细胞活化水平。 结果 TGF-β抑制肝癌细胞MHC-I表达（P<0.01），且T细胞活化水平降低，导致共培养体系中肿瘤增殖率上升且死亡率下降；TGF-β通过特异性上调miR-23a-3p（P<0.001，P<0.01），负向调控其靶基因IRF1（P<0.05），进而抑制MHC-I转录（P<0.01）；过表达miR-23a-3p可重现IRF1/MHC-I表达抑制效应（P<0.05）。 结论 TGF-β通过miR-23a-3p/IRF1信号轴下调MHC-I表达，削弱T细胞介导的抗肿瘤免疫应答，揭示了肝癌免疫逃逸的新机制。

Abstract

Objective To investigate the mechanism by which transforming growth factor‑β (TGF‑β) regulates major histocompatibility complex class I (MHC-I) expression in hepatocellular carcinoma (HCC) cells and its role in immune evasion of HCC. Methods HCC cells treated with TGF‑β alone or in combination with SB-431542 (a TGF-β type I receptor inhibitor) were examined for changes in MHC-I expression using RT-qPCR and Western blotting. A RNA interference experiment was used to explore the role of miR-23a-3p/IRF1 signaling in TGF‑β‑mediated regulation of MHC-I. HCC cells with different treatments were co-cultured with human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), and the changes in HCC cell proliferation was assessed using CCK-8 and colony formation assays. T-cell cytotoxicity in the co-culture systems was assessed with lactate dehydrogenase (LDH) release and JC-1 mitochondrial membrane potential assays, and T-cell activation was evaluated by flow cytometric analysis of CD69 cells and ELISA for TNF-α secretion. Results TGF‑β treatment significantly suppressed MHC-I expression in HCC cells and reduced T-cell activation, leading to increased tumor cell proliferation and decreased HCC cell death in the co-culture systems. Mechanistically, TGF-β upregulated miR-23a-3p, which directly targeted IRF1 to inhibit MHC-I transcription. Overexpression of miR-23a-3p phenocopied TGF‑β‑induced suppression of IRF1 and MHC-I. Conclusion We reveal a novel immune escape mechanism of HCC, in which TGF‑β attenuates T cell-mediated antitumor immunity by suppressing MHC-I expression through the miR-23a-3p/IRF1 signaling axis.

Graphical abstract

关键词

肝癌细胞 / 转化生长因子-β / 主要组织相容性复合体I类 / 肿瘤免疫逃逸

Key words

liver cancer cells / transforming growth factor-β / major histocompatibility complex class I / tumor immune escape

肝癌是全球第6大常见癌症，也是癌症相关死亡的第2大原因，肝癌的发生和进展是一个复杂的过程，免疫治疗已成为肝癌治疗的重要手段之一^{［1， 2］}。近年来，许多研究聚焦于肝癌细胞的免疫逃逸机制，其中，肝癌细胞表面主要组织相容性复合物I类（MHC-I）分子表达异常是肝癌逃避免疫监视的重要机制之一^{［3， 4］}。MHC-I分子在机体免疫反应中扮演着关键角色，负责将细胞内源性抗原递呈给细胞毒性T淋巴细胞（CTLs），激活CD8⁺ T细胞介导的抗肿瘤免疫应答^{［5， 6］}。然而，已有研究表明肿瘤细胞常可通过下调MHC-I分子的表达来逃避免疫监视，MHC-I的缺失或下调是癌症免疫逃避的主要机制，它阻断了肿瘤相关抗原的表面呈递，从而抑制CD8⁺T细胞的细胞毒性并损害了适应性免疫反应^{［7， 8］}。

在肿瘤微环境的众多调节因子中，转化生长因子-β（TGF-β）作为一种典型的多功能细胞因子，在机体免疫调控、炎症反应、细胞增殖与分化等方面发挥着重要的作用。TGF-β通过Smad依赖性和非依赖性信号通路广泛参与肿瘤发生发展的各个环节^{［9， 10］}。有研究报道，与正常细胞和组织相比，恶性肿瘤组织中TGF-β表达水平明显升高^{［11， 12］}。虽然有研究发现TGF-β可以下调多种肿瘤细胞表面MHC-I的表达，如卵巢癌^［13］和前列腺癌^［14］。然而，TGF-β对肝癌细胞膜表面的MHC-I的调控及其分子机制研究仍处于起步阶段，存在诸多空白之处。例如，目前并不清楚TGF-β在肝癌细胞中调控MHC-I表达时是否存在与其他肿瘤类型不同的信号通路与机制；此外，在TGF-β影响下，肝癌细胞的MHC-I表达变化与肝癌患者临床特征之间的关联也尚未被探索。

本研究旨在探讨TGF-β在肝癌中如何影响肿瘤表面MHC-I的表达并深入探索其分子调控机制，通过阐明TGF-β对MHC-I表达及相关信号通路的调控机制，期望能为免疫治疗的靶向设计提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞来源和培养

人肝母细胞瘤细胞HepG2、人肝细胞癌细胞Huh-7（上海青旗有限公司），人肝细胞癌细胞Hep3B和SNU-387（武汉赛维尔生物科技有限公司）。含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基（Gibco）为细胞提供必要的营养和生长所需条件，且将细胞培养置于5% CO₂、37 ℃的恒温培养箱中，以确保细胞培养环境与条件稳定。

1.1.2 试剂和化学品

HLA Class 1 ABC抗体（Abcam），GAPDH抗体（武汉赛维尔生物科技有限公司），重组人TGF-β1蛋白试剂（北京义翘神州科技股份有限公司），SB-431542试剂（CNSpharm），IRF1抗体（Cell Signal Technology），乳酸脱氢酶细胞毒性试剂（碧云天生物技术有限公司），ELISA试剂盒（晶美生物科技有限公司），FITC标记的CD8抗体、PE标记的CD69抗体（BioLend），CD8⁺T细胞分选试剂盒（STEMCELL），JC-1试剂盒（Biosharp），TB Green Premix Ex Taq^TM II试剂、PrimeScript^TM RT Master Mix（Takara），Cell Counting Kit-8细胞增殖和毒性试剂（APE BIO），miRNA 第一链cDNA合成（茎环法）、Total RNA Extractor（Trizol）及RNA转染试剂（上海生工生物有限公司），miRNA引物、miR-23a-3p模拟物、miR-23a-3p抑制物（miR23a-3p mimics，miR23a-3p inhibitor）及阴性对照（NC）、IRF1的siRNA（siRNA-A/B/C）及阴性对照（NC）均由上海生工生物有限公司构建。

1.2 方法

1.2.1 外周血PBMC提取

采集外周血样本时，需采用含有EDTA或肝素等抗凝剂的真空采血管。将取得的抗凝全血与等量的PBS或生理盐水进行均匀混合稀释。将稀释后的血液缓慢地注入盛有Ficoll分离液的离心管中，以形成清晰的分层。在常温条件下，以400~800 g的离心力进行20~30 min的离心操作。离心完成后，可见PBMC层位于血浆层与Ficoll层之间，此时用移液器仔细吸取PBMC层。对收集到的PBMC进行2~3次PBS洗涤，每次洗涤后需弃去上清液。最终，将洗涤干净的PBMC用适量的完全培养基或PBS重新悬浮，以备后续实验使用。

1.2.2 PBMC与肿瘤细胞共培养

将PBMC重悬于完全培养基中，加入植物血凝素（PHA）至终浓度 50 μg/mL。5% CO₂、37 ℃培养72 h。将PHA预刺激后的PBMC 1500 r/min离心5 min，去除含PHA的培养基。在完全培养基中加入抗人CD3抗体至终浓度10 μg/mL，加入IL-2至终浓度300 IU/mL，加入IFN-γ至终浓度1000 IU/mL，配成含有抗人CD3抗体、IL-2、IFN-γ的完全培养基。通过CD3抗体提供T细胞激活信号，IFN-γ增强Th1免疫应答，IL-2维持T细胞增殖。将PBMC重悬于上述培养液中培养3~4 d。PBMC活化后，按PBMC∶肿瘤细胞=10∶1的比例进行培养48~72 h。

1.2.3 Western blotting

为提取细胞或组织中的蛋白质，需进行裂解以释放蛋白质。根据目标蛋白质的相对分子质量，选取相应浓度的凝胶进行分离。接着，将蛋白质样本与加样缓冲液混合，并通过加热使其变性，然后进行上样。电泳过程首先在80 mV电压下进行30 min，随后提高电压至120 V，继续电泳60 min。电泳完成后，将凝胶中的蛋白质转移至PVDF膜上，此过程在100 V电压下进行2 h。转移后，将PVDF膜置于封闭液中，在室温下摇床封闭1 h，以降低背景的非特异性结合。随后，将封闭的膜浸入一抗工作液（1∶1000，溶于含5% BSA的TBST）中，4 ℃过夜。使用TBST缓冲液清洗膜，10 min/次，清洗3次，以去除未结合的一抗。之后，将膜放入二抗工作液（1∶10 000，溶于含5%脱脂奶粉的TBST）中，室温下摇床孵育1 h，并用TBST缓冲液再次清洗，以去除未结合的二抗。最后，利用凝胶成像系统检测蛋白质条带，并通过Image J软件比较条带与内参的灰度值，以量化蛋白质含量。

1.2.4 细胞总RNA的提取

将Trizol加入培养板以裂解细胞，随后用移液器混匀。放置于室温10 min后，添加0.2 mL氯仿并剧烈震动，静置3 min后在4 ℃以12 000 r/min离心10 min。转移上层水相至新管，加入等体积异丙醇，于冰上沉淀20 min后再次离心。倒掉上清，用75%乙醇清洗沉淀，短暂离心后弃乙醇，空气干燥5 min。最后，向RNA沉淀中加入20 μL无RNase水进行溶解。

1.2.5 实时荧光定量聚合酶链反应

以总RNA（500 ng）为模板，使用逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA加入相应引物（表1），之后利用快速实时PCR系统进行扩增。qPCR 条件如下：95 ℃保温35 min；60 ℃持续34 min；95 ℃保温15 min。循环40次。U6和GAPDH用于归一化。归一化后使用2^-ΔΔCt方法计算mRNA的相对水平。所有实验重复3次。

1.2.6 RNA转染技术

将siRNA、mimics或inhibitor的干粉溶解于DEPC处理水中，制备成所需浓度的溶液。将RNA和RNATransMate分别加入到DMEM培养基中，充分混合后，将两份溶液合并。在室温下静置5~10 min，以促进RNA与RNATransMate形成稳定的复合物。转染前，需将细胞培养液更换为无血清和无抗生素的DMEM培养基。随后，将RNA-RNATransMate复合物均匀滴加至细胞层上，轻轻摇动培养皿，确保复合物均匀覆盖细胞。在适宜的培养条件下，让细胞摄取RNA，培养时间为6~8 h。转染过程完成后，将培养基更换为含有血清和抗生素的完全培养基，并继续培养细胞24~48 h。

1.2.7 CCK-8细胞增殖分析

将细胞以完全培养基接种至96孔板，细胞数量500~10 000/孔。细胞接种后，将其置于培养箱中孵育24 h，以促进细胞贴壁生长。依据实验方案，对细胞施加不同浓度的药物处理或其他相应处理。处理后，细胞应继续在培养箱中培养一段预定时间。处理周期完成后，谨慎地移除孔板中的培养基。随后，向每个孔中加入预先按比例（1∶10）混合CCK-8试剂的新鲜培养基。将处理过的96孔板放回培养箱中，继续孵育2 h。孵育完成后，利用酶标仪测定各孔的A_{450 nm}。

1.2.8 克隆形成能力分析

在六孔板中接种细胞1000/孔培养1周，加入药物处理并与PBMC细胞共培养。2周后，弃去培养基，用生理盐水洗涤样本，甲醇固定后用结晶紫染色。最后，通过观察细胞克隆团数量来分析细胞增殖情况，获得实验结果。

1.2.9 线粒体膜电位（JC-1）检测

依据实验方案，对细胞实施相应的药物处理。随后，弃去细胞培养基，并以PBS缓冲液轻轻清洗细胞表面，重复此步骤3次。依据JC-1试剂盒指南推荐的浓度，向细胞中加入JC-1染色剂。将细胞在37 ℃的培养箱中孵育30 min，弃去JC-1染色剂，并用PBS缓冲液清洗细胞，以清除未结合的染料，此过程重复3次。利用荧光显微镜对细胞进行观察，并分别拍摄红色（J-聚集体）和绿色（单体）荧光图像。通过比较对照组与实验组的荧光图像，评估线粒体膜电位的变动。

1.2.10 乳酸脱氢酶细胞毒性释放实验（LDH）

首先，将适量细胞接种至96孔板中。倒掉培养液，用PBS清洗细胞3次。更换新鲜培养液，并进行药物处理，持续72 h，随后与PBMC细胞共培养24 h。在“最高酶活性参照孔”中加入LDH释放剂，充分混合后，继续孵育1 h。以400 g的转速进行离心处理5 min，取出120 μL的上清液，分别与LDH检测液相混合，并在室温下孵育30 min。利用分光光度计测量吸光度A_{490 nm}值，同时以620 nm作为参比波长。

1.2.11 ELISA检测细胞因子分泌

将适量细胞接种至96孔板，于37 ℃、5% CO₂条件下培养至融合度80%~90%。药物处理72 h后与PBMC细胞共培养12 h。终止培养后，300 g离心10 min，收集无细胞上清。检测前将待测样本及ELISA试剂盒室温平衡120 min。按说明书设置标准品梯度、待测样本及空白对照孔，加入50 μL/孔标准品或样本，加入100 μL辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体，37 ℃恒温水浴孵育60 min。弃去反应液，用洗涤缓冲液清洗5次。依次加入底物溶液A、B各50 μL/孔，避光反应15 min后，加入50 μL终止液终止反应，立即使用酶标仪测定A_{450 nm}值，绘制标准曲线，计算浓度。

1.2.12 CD8⁺T细胞的分选与流式细胞术

将共培养后的PBMC悬液与CD8⁺ T细胞分选微珠按说明书推荐比例混合，4 ℃孵育15 min。随后加入10倍体积的磁性分选缓冲液，300 g离心5 min，弃上清后以500 μL分选缓冲液重悬细胞。将预润洗的磁性分选柱置于磁场中，缓慢加入细胞悬液，收集未结合的流出液；移除磁场后，使用1 mL分选缓冲液洗脱获得高纯度CD8⁺ T细胞。为检测T细胞活化状态，取分选后的CD8⁺ T细胞，分别加入FITC标记的CD8抗体（5 μL）及PE标记的CD69抗体（5 μL），避光条件下孵育30 min。孵育结束后，加入2 mL PBS洗涤液，300 g离心5 min，重复洗涤两次以去除未结合抗体。用500 μL PBS重悬细胞，立即上机检测。使用流式分析软件（Flow Jo）分析数据。

1.3 统计学分析

采用GraPhPad Prism 8软件进行统计分析，所有实验操作均重复至少3遍。计量数据以均数±标准差表示，两组数据比较采用t检验；比较3组或以上数据时，采用单因素方差分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 TGF-β下调肝癌细胞MHC-I分子表达

Western blotting结果显示，在不同的肝癌细胞中均能检测到一定水平的MHC-I蛋白表达。其中，HepG2和Huh-7细胞系中MHC-I蛋白的表达水平高于SNU-387和Hep3B细胞系（P<0.05，P<0.01，图1A、B）。RT-qPCR结果显示，HepG2与Huh-7细胞系的HLA-A转录丰度高于SNU-387、Hep3B细胞系（P<0.05，P<0.01，图1C）。因此后续实验选取HepG2和Huh-7细胞系作为研究对象。

与对照组相比，TGF-β处理48 h可抑制HepG2与Huh-7细胞MHC-I蛋白表达（P<0.01），TGF-β受体抑制剂SB-431542预处理可逆转此效应（P<0.01，图1D、E）。RT-qPCR进一步证实，与对照组相比，TGF-β处理使HLA-A mRNA水平下降（P<0.01）；当采用TGF-β联合SB-431542时，HLA-A mRNA水平较TGF-β处理组恢复（P<0.01，图1F）。

2.2 TGF-β通过抑制PBMC活化削弱其抗肿瘤细胞毒性杀伤效应

CCK-8实验结果显示，TGF-β组的肿瘤细胞活力较对照组升高（P<0.05），而SB-431542联合处理可逆转此效应（P<0.05，图2A）。细胞克隆形成实验进一步证实，TGF-β组肿瘤细胞形成的克隆团数量多于对照组（P<0.001，P<0.01），而联合抑制剂组克隆团数量相较于TGF-β组减少（P<0.001，P<0.01，图2B、C）。LDH释放实验结果显示，相较于对照组，TGF-β组肿瘤细胞死亡率下降（P<0.01，P<0.05），而联合抑制剂组肿瘤细胞死亡率相较于TGF-β组升高（P<0.01，P<0.05，图2D）。JC-1实验对线粒体膜电位进行检测，结果显示，与对照组相比，TGF-β组绿色荧光/红色荧光比值减小（P<0.001），加入TGF-β受体抑制剂后该比值增大（P<0.001，图2E、F）。ELISA实验显示，TGF-β组的TNF-α浓度相比于对照组明显降低（P<0.05），而联合抑制剂组的TNF-α浓度相比于TGF-β组升高（P<0.05，图2G）。CD8⁺T细胞与不同处理组的肿瘤细胞共培养后，流式细胞术实验结果显示，TGF-β组高表达CD69的CD8⁺T细胞的比例相比于对照组明显降低，而联合抑制剂组高表达CD69的CD8⁺T细胞比例相比于TGF-β组升高（图2H）。

2.3 TGF-β下调IRF1表达

Western blotting结果显示，与对照组相比，经TGF-β处理的实验组中IRF1的表达水平降低（P<0.05），而在TGF-β处理的基础上同时给予SB-431542后，IRF1的表达水平相较于仅TGF-β处理组升高（P<0.05，图3A、B）。

2.4 IRF1参与MHC-I表达正向调控

Western blotting结果显示，与对照组和阴性对照组相比，3种针对IRF1的siRNA干扰组中的IRF1蛋白水平均下降（P<0.05，P<0.01，图4A、B）。相较于对照组和阴性对照组，3个敲低IRF1的实验组中MHC-I的表达水平降低（P<0.01，图4A、C）。

2.5 IRF1表达缺陷通过抑制PBMC活化介导抗肿瘤细胞毒性杀伤功能下调

CCK-8实验结果显示，IRF1敲低组的细胞活力高于对照组、阴性对照组（P<0.05，图5A）。LDH实验结果显示，IRF1敲低组的细胞死亡率较对照组和阴性对照组下降（P<0.01，图5B）。JC-1实验结果显示，IRF1敲低组的线粒体膜电位绿色荧光/红色荧光比值低于对照组和阴性对照组（P<0.001，图5C、D）。ELISA实验结果显示，IRF1敲低组PBMC释放的TNF-α水平低于对照组和阴性对照组（P<0.05，图5E）。流式细胞术分析显示，IRF1敲低组中高表达CD69的CD8⁺T细胞比例较对照组和阴性对照组减少（图5F）。

2.6 TGF-β通过miR-23a-3p/IRF1下调MHC-I的表达

通过整合TargetScan、miRDB和miRWalk 3个miRNA预测数据库进行交叉筛选（图6），获得37个具有共表达特征的候选miRNA，基于UALCAN肿瘤数据库的转录组数据进一步筛选出在肝癌组织中显著高表达的miRNA亚群，通过综合各数据库的预测评分体系，遴选出4个高置信度候选miRNA（miR-23a-3p、miR-106b-5p、miR-17-5p、miR-24-2-5p）作为后续实验验证的核心研究对象。

RT-qPCR分析显示，TGF-β处理48 h后，miR-23a-3p在肝癌细胞中呈现跨细胞系上调（P<0.001，P<0.01）。miR-17-5p表现出细胞特异性调控特征：在HepG2细胞中上调（P<0.05），而在Huh-7细胞中差异无统计学意义。miR-106b-5p和miR-24-2-5p的表达水平在2种细胞系中均未观察到改变（图7A、B）。TGF-β组中miR-23a-3p表达水平相比与对照组升高（P<0.001，P<0.01）；在TGF-β刺激的基础上添加SB-431542，miR-23a-3p表达水平又降低（P<0.001，P<0.01，图7C）。

Western blotting结果显示，与对照组相比，转染miR-23a-3p模拟物后，IRF1的表达下降（P<0.05）；转染miR-23a-3p抑制物后，IRF1的表达水平升高（P<0.05，图7D、E）。与对照组相比，转染模拟物后，IRF1表达水平降低，与此同时，MHC-I的表达水平也降低（P<0.05）；转染抑制物后，IRF1表达水平升高，MHC-I的表达水平也升高（P<0.05，图7D、F）。

2.7 MiR-23a-3p影响PBMC活化并降低其对肿瘤细胞的毒性和杀伤作用

CCK-8实验结果显示，miR-23a-3p转染组的肿瘤细胞活力较对照组及阴性对照组升高（P<0.05，图8A）。LDH实验结果进一步证实，miR-23a-3p过表达降低肿瘤细胞死亡率（P<0.01，图8B）。JC-1实验结果显示，miR-23a-3p转染组中的线粒体膜电位绿色荧光/红色荧光比值低于对照组和阴性对照组（P<0.005，图8C、D）。ELISA检测显示，miR-23a-3p过表达组的PBMC分泌TNF-α水平较对照组及阴性对照组降低（P<0.01，图8E）。流式细胞术结果显示，与对照组和阴性对照组相比，miR-23a-3p转染实验组高表达CD69的CD8⁺T细胞的比例降低（图8F）。

3 讨论

肝癌是一种高度恶性的实体瘤，其发病过程中涉及到多种复杂的分子机制^{［15， 16］}。在肿瘤与人体免疫系统的相互对抗过程中，肿瘤细胞能够规避宿主的免疫监控，这成为肿瘤进展的一个重要环节^{［17， 18］}。其中，肿瘤细胞通过下调或丧失MHC-I分子的表达，从而逃避细胞毒性T淋巴细胞的识别和杀伤，这一现象在肿瘤发展进程中具有重要意义^［19-22］。TGF-β作为一种多功能的细胞因子，在肝癌的发生发展中的作用具有两面性。一方面，TGF-β可抑制正常细胞的增殖，发挥肿瘤抑制作用^{［23，24］}；另一方面，在肝癌进展过程中，TGF-β通过诱导上皮-间质转化（EMT）、促进血管生成、抑制细胞凋亡等机制，反而促进肿瘤的恶性转化和转移^{［25，26］}。本研究证实TGF-β可以下调肝癌细胞的表面MHC-I的表达，从而减弱PBMC对肿瘤细胞的杀伤作用，介导肿瘤细胞免疫逃逸。

已有研究表明，TGF-β可下调卵巢癌和前列腺癌等多种肿瘤细胞表面的MHC-I的表达^{［13，14］}。本研究发现TGF-β能够下调肝癌细胞MHC-I的表达，这一结果与之前在其他肿瘤类型中的发现相符，提示TGF-β对MHC-I表达的下调可能是一种在多种肿瘤中普遍存在的机制。本研究通过建立肿瘤细胞-PBMC共培养模型，揭示了TGF-β/MHC-I轴的双重免疫抑制效应：一方面，MHC-I表达缺失直接削弱肿瘤抗原呈递，导致CD8⁺ T细胞活化标志物CD69表达降低及TNF-α分泌减少；另一方面，线粒体膜电位检测及LDH释放实验证实，TGF-β可增强肿瘤细胞对T细胞介导凋亡的抵抗，从而形成利于肿瘤进展的免疫耐受微环境。

本研究发现TGF-β可降低MHC-I的转录因子IRF1的表达水平。IRF1作为一种重要的转录因子，在调节免疫相关基因表达方面的作用已被广泛研究^{［27， 28］}。本研究显示，通过siRNA敲低IRF1后，MHC-I的表达显著下调，这表明IRF1在MHC-I表达调控中扮演着重要角色，其表达的改变可能是TGF-β影响MHC-I表达的关键环节。本研究通过整合TargetScan、miRDB及miRWalk三大预测数据库的互补算法，系统筛选调控IRF1转录抑制的潜在miRNA。通过交叉验证策略从37个候选分子中，进一步结合UALCAN数据库的TCGA肝癌转录组数据，深度挖掘出具有病理相关性的高表达miRNA亚群，并且最终揭示TGF-β可特异性诱导miR-23a-3p表达上调。合成miR-23a-3p的模拟物和抑制物并分别转染进细胞后，经Western blotting检测发现miR-23a-3p能够下调IRF1表达的同时也能够下调MHC-I的表达。另外，依据Targetscan数据分析，miR-23a-3p与MHC-I mRNA缺乏保守型序列，这表明miR-23a-3p对MHC-I的直接调控作用较弱。由此可知，miR-23a-3p并非直接抑制MHC-I的表达，而是通过下调IRF1的表达来间接降低MHC-I的表达。以上结果表明，TGF-β能够上调miR-23a-3p，而miR-23a-3p又可通过影响IRF1间接调控MHC-I的表达。进一步的免疫共培养实验证实，miR-23a-3p过表达或IRF1沉默可显著抑制CD8⁺ T细胞活化，并降低T细胞介导的肿瘤细胞杀伤，最终形成利于免疫逃逸的微环境。这些数据共同阐明了一条全新TGF-β/miR-23a-3p/IRF1/MHC-I信号轴，其通过抑制抗原呈递与T细胞功能双重机制促进肝癌进展。

已有研究发现^［29］，TGF-β能够诱导小鼠肺癌细胞中具有无名指结构域1（UHRF1）的表观遗传调节因子发生磷酸化，并促进其从细胞核易位到细胞质，磷酸化的UHRF1与MHC-I分子相互作用，加速了MHC-I的降解。此外，TGF-β能够激活卵巢癌细胞内的DNA甲基转移酶的表达和活性，从而促进DNA的甲基化^［30］。经TGF-β处理后，低甲基化卵巢癌细胞MHC-I的表面表达降低，而抑制TGF-β可恢复其正常表达水平^［13］。在胃癌细胞中，TGF-β可以抑制miR-152的表达进而诱导HLA-G的表达^［31］，而HLA-G是非经典的MHC-I类分子，它能够抑制NK细胞功能来促进免疫监视的逃逸^［32］。近年来，尽管关于肿瘤细胞MHC-I的研究成果较多，但是关于TGF-β在下调肿瘤细胞表面的MHC-I分子表达方面的分子机制研究似乎进展缓慢。本研究的发现为这一领域带来了新的思路与进展，即除直接影响MHC-I抗原呈递过程和调节MHC-I分子的表观遗传修饰状态外，TGF-β还能通过调节microRNA途径来调控MHC-I的表达，这为TGF-β调控MHC-I表达的分子机制增添了新的维度。这进一步表明，TGF-β在肿瘤免疫逃逸中的作用可能比我们之前所理解的更为复杂，TGF-β能够在多个层面影响MHC-I的表达，从而在肿瘤细胞与免疫系统之间的相互作用中发挥关键作用。

本研究存在一定的局限性：仅进行了体外细胞实验，未进行动物模型验证，因此结果在体内环境的应用尚需进一步动物实验来确认。此外，TGF-β还可能通过其他机制影响MHC-I表达，这将是未来研究的重点。尽管存在这些局限性，本研究发现在肝癌细胞中TGF-β可以通过miR-23a-3p-IRF1这一调控通路影响MHC-I的表达，为我们深入理解TGF-β下调肝癌中MHC-I表达的分子机制提供了重要的理论依据，为开发新型免疫治疗策略奠定了基础，例如通过miR-23a-3p抑制剂恢复MHC-I表达，或联合TGF-β受体抑制剂增强免疫检查点阻断疗效。我们将继续深入探索这一调控网络的分子调控机制及其在肿瘤免疫治疗中的价值。

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