益气滋肾方通过抑制PI3K/Akt/NF-κB通路改善小鼠慢性阻塞性肺疾病的炎症反应

Yiqi Zishen Formula ameliorates inflammation in mice with chronic obstructive pulmonary disease by inhibiting the PI3K/Akt/NF-κB signaling pathway

摘要

目的 明确益气滋肾方（YZF）的化学成分和入血成分，并阐明YZF改善慢性阻塞性肺疾病（COPD）炎症的整合作用机制与药效物质。 方法 通过超高效液相色谱串联四极杆轨道离子阱质谱（UHPLC-Q-Extractive-Orbitrap MS）鉴定YZF化学成分和入血成分。基于YZF入血成分构建YZF改善COPD的成分-疾病靶点网络，并进行富集分析筛选关键通路与作用靶标。通过香烟烟雾诱导构建小鼠COPD模型评价YZF抗炎作用及验证网络药理学富集到相关通路中关键蛋白的表达情况。50只C57BL/6J雄鼠随机分为对照组、模型组、YZF高、低剂量组和N-乙酰半胱氨酸组，10只/组。采用全身体积描记系统检测肺功能；HE染色法观察各组小鼠肺病理并进行肺泡和气道评估；ELISA法检测小鼠肺泡灌洗液中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量；采用免疫组化法检测肺组织PI3K、Akt、p-Akt、p65和p-p65的表达水平。 结果 从YZF中共鉴定出156种化学成分，包括26种黄酮及黄酮苷类、27种生物碱类、11种皂苷类等成分；从含药血清样本中鉴定出43种原型入血成分。网络药理学分析获得YZF成分704个靶点和COPD 1199个疾病靶点；整合分析成分-疾病靶点后发现YZF缓解COPD可能与PI3K-Akt等信号通路相关；动物实验表明YZF可增加COPD模型小鼠的平均肺泡数和呼气峰流速（P<0.05）；降低COPD模型小鼠的肺泡平均线性截距和支气管壁厚度和肺系数以及肺泡灌洗液的IL-1β、IL-6、TNF-α含量（P<0.01），并能够抑制肺组织PI3K、Akt、p-Akt、p65和p-p65蛋白的表达（P<0.01）。 结论 YZF能有效改善COPD症状，缓解COPD炎症，机制可能与其通过多成分-多靶点作用抑制PI3K/Akt/NF-κB通路相关。

Abstract

Objective To investigate pharmacologically active components of Yiqi Zishen Formula (YZF) and their mechanisms for alleviating airway inflammation in mice with chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Methods Ultra-high-performance liquid chromatography coupled with quadrupole-orbitrap mass spectrometry was employed to characterize the chemical components in YZF and YZF-medicated rat serum. A compound-disease target network was constructed based on serum components of YZF to screen the key pathways and targets using enrichment analysis. A mouse model of cigarette smoke-induced COPD was used to evaluate the anti-inflammatory effect of YZF and validate the expression of key proteins in network pharmacology-enriched pathways. Fifty male C57BL/6J mice were randomized equally into control group, COPD model group, high- and low-dose YZF treatment groups, and N-acetylcysteine treatment group. Pulmonary function of the mice was assessed using whole-body plethysmography, and lung histopathology, alveolar structure, and airway remodeling were analyzed using HE staining. The levels of IL-1β, IL-6, and TNF‑α in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were determined with ELISA, and pulmonary expressions of PI3K, Akt, phosphorylated Akt (p-Akt), p65, and phosphorylated p65 (p-p65) were detected using immunohistochemistry. Results We identified a total of 156 chemical components (including 26 flavonoids or flavonoid glycosides, 27 alkaloids, and 11 saponins) in YZF and 43 prototype components in medicated rat serum. Network pharmacology revealed 704 YZF-related targets and 1199 COPD-associated targets. Integrated analysis suggested that the anti-COPD effects of YZF were associated with the PI3K-Akt signaling pathway. In mouse models of COPD, YZF treatment significantly increased mean alveolar number and peak expiratory flow (P<0.05), reduced mean linear intercept, bronchial wall thickness, lung coefficient, and BALF cytokine levels, and suppressed the expressions of PI3K, Akt, p-Akt, p65, and p-p65 in the lung tissues. Conclusion YZF alleviates COPD symptoms and airway inflammation in mice possibly by inhibiting the PI3K/Akt/NF‑κB pathway through its multiple components that interact with multiple targets.

Graphical abstract

关键词

益气滋肾方 / 慢性阻塞性肺疾病 / 入血成分 / 网络药理学 / 炎症

Key words

Yiqi Zishen Formula / chronic obstructive pulmonary disease / serum-absorbed components / network pharmacology / inflammation

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是以持续性、进行性发展的呼吸道症状和气流受限为特征的疾病，通常因长期暴露在有毒颗粒或气体中引起的气道和/或肺泡异常所致^［1］。COPD在中医学中属于“哮病”、“喘证”、“肺胀”等^［2］病证范畴，其稳定期以虚证为主，兼有血瘀、痰湿，主要证型包括肺气虚证、肺脾气虚证、肺肾气虚证、肺肾气阴两虚证^［3］。李建生教授根据多年临床研究，针对COPD稳定期的不同证候，总结出调补肺肾三方，经多中心临床研究，调补肺肾系列方治疗COPD稳定期具有较好疗效^［4］。益气滋肾方（院内制剂号Z20120009）是系列方中的其中一方，具有补肺益肾、益气养阴功效，用于治疗COPD稳定期肺肾气阴两虚证。前期研究发现益气滋肾方可参与调控JAK/STAT信号转导，调节炎症因子表达^{［5， 6］}；通过抑制NF-κB、MAPK、STAT3和PPAR通路来减轻LPS和香烟烟雾提取物诱导的肺上皮细胞炎症反应、蛋白酶-抗蛋白酶失衡和氧化应激^［7］；通过调节NF-κB通路抑制香烟烟雾和TNF-α诱导的肺泡上皮炎症^［8］；通过抑制ERK1/2信号通路改善COPD大鼠气道黏液高分泌^［9］，但益气滋肾方改善COPD的药效物质基础尚未明确，以及可能的作用机制尚待发现。

本研究整合血清药物化学和网络药理学研究方法，通过超高效液相色谱串联四极杆轨道离子阱质谱（UHPLC-Q-Extractive-Orbitrap MS）对益气滋肾方的化学成分和入血成分进行鉴定，并基于入血成分构建益气滋肾方“成分-靶点”网络，在动物水平验证益气滋肾方的抗炎药效与富集到相关通路的关键蛋白表达情况^［10］，为益气滋肾方在COPD治疗中的临床应用提供理论依据和实验支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

12只SPF级6~8周龄SD雄性大鼠用于含药血清分析，体质量200±20 g，购自北京维通利华实验动物技术公司［许可证号SCXK（京）2021-0011］；50只SPF级6~8周龄C57BL/6J雄性小鼠用于YZF药效及机制研究，体质量20±2 g，购自北京斯贝福实验动物技术有限公司［许可证号：SCXK（京）2019-0010］。所有实验动物购入后饲养于河南中医药大学动物中心［许可证号SYXK（豫）2020-0004］，饲养条件为12 h光暗交替，室温25±2 ℃，相对湿度（55±5）%。所有实验方案经河南中医药大学伦理委员会批准（ 伦理批号DWLLGZR202202029；IACUC-202403031）。实验动物样本量通过资源方程法确定^［11］。

1.1.2 药物

益气滋肾方：益气滋肾方由人参、黄精、麦冬、五味子、百部、陈皮等13味中药组成，所有中药饮片（郑州瑞龙制药股份有限公司）经河南中医药大学药学院付钰副教授鉴定符合《中华人民共和国药典》^［12］相关规定，由河南中医药大学药学院药物分析实验室根据中药饮片特性，经水提、醇提后制备成流浸膏，冷冻干燥机浓缩冻干为益气滋肾方冻干粉，收集并密封在4 ℃冰箱保存。每克提取物（冻干粉）含2.81 g原生药材。N-乙酰半胱氨酸（赞邦制药，进口注册号：H20140449，规格：600 mg/片）。

1.1.3 香烟

红旗渠过滤嘴香烟（河南中烟工业有限责任公司），烤烟型，焦油量10 mg，烟气烟碱量0.8 mg，烟气CO量11 mg。

1.1.4 试剂与仪器

甲醇（HPLC级）、乙腈（LC-MS级）、甲酸（LC-MS级）、小鼠白介素-1β（IL-1β） ELISA试剂盒（赛默飞世尔科技有限公司）；乙醇（迈瑞达科技有限公司）；小鼠白介素6 ELISA试剂盒、小鼠TNF-α ELISA试剂盒（BD Bioscience）；兔IgG-免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒（博士德生物工程有限公司）；PI3K抗体（稀释比1∶200）、p-p65抗体（稀释比1∶400，湖南艾方生物科技有限公司）；Akt抗体（稀释比1∶200，杭州联科生物技术有限公司）；p-Akt抗体（稀释比1∶200，Affinity），p65抗体（稀释比1∶200，沈阳万类生物科技有限公司）；超纯水由实验室milliq系统（Merck Millipore）生产；所有标准品（上海源叶科技有限公司）。

本研究中所使用的主要仪器包括Dionex UltiMate 3000型超高效液相色谱仪、Q Exactive四级杆轨道离子阱质谱（Thermo Fisher Scientific）；Synergi Polar-RP（2 mm×150 mm，4 μm）色谱柱（Phenomenex）、电子天平（梅特勒托利多仪器有限公司）、高速台式冷冻离心机和离心浓缩仪（Thermo Fisher Scientific）；手动香烟染毒系统（上海玉研科学仪器有限公司），动物肺功能检测系统（BUXCO），全波长酶标仪（Thermo）、自动切片机（Leica），生物组织摊烤片机（湖北省孝感市亚光医用电子技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 供试品溶液准备

精密称取0.2 mg益气滋肾方提取物，用20 mL 70%甲醇溶液超声提取30 min，在13 000 r/min，4 ℃条件下离心10 min，取上清，经0.22 μm微孔滤膜过滤，保存在-20 ℃。

1.2.2 对照品溶液准备

分别精密称取“1.1.4”项下标准品适量，用甲醇在0.5 ~5 mg/mL浓度范围内制备标准品原液。所有标准品最终浓度定为20 μg/mL。

1.2.3 含药血清样本制备

将大鼠随机分为对照组和益气滋肾方组， 6只/组。益气滋肾方组大鼠灌胃2次/d制备提取物的水溶液，灌胃剂量为44.2 g/（kg·d），连续灌胃7 d；空白组大鼠灌胃等量生理盐水，连续灌胃7 d，采血前禁食1 d。于末次灌胃后10 min、30 min、1 h、2 h、4 h眼眶静脉丛采血，4 ℃、3000 r/min条件下离心10 min，分离血清，-80℃保存备用。定性分析时混合各组在给药后不同时间采集的5份血清样品（每份样品20 μL，共100 μL）。用蛋白沉淀法提取益气滋肾方的成分，在100 μL的血清中加入300 μL乙腈，涡旋混匀后再在4 ℃、13 000 r/min条件下离心10 min，抽取300 μL上清液转移至新离心管中，于离心浓缩仪中蒸发至干燥，-80℃保存待测。检测样本时用50 μL乙腈/水（v∶v，50∶50）溶液进行复溶，取35 μL进样。

1.2.4 色谱与质谱条件

使用Dionex Ultimate 3000 UPLC系统和Q-Exactive Orbitrap质谱仪对益气滋肾方提取物和含药血清进行质谱分析。色谱柱为Synergi Polar-RP （2×150 mm，4 μm）；流动相A为0.1%甲酸水，流动相B为0.1%甲酸乙腈，流速为0.3 mL/min，梯度洗脱条件：0% B （0~5 min）；从0~5% B的线性梯度（5~7 min）；5%~20% B （7~10 min）；20%~25% B （10~20 min）；25%~50% B （20~23 min）；50%~100% B （23~40 min）；100% B（40~43 min）；0% B（43~45 min）；0% B（45~50 min）。柱温40 ℃，进样量为5 μL。

质谱仪配备加热电喷雾电离源（HESI），在正、负离子模式下扫描，正离子模式电压3500 V，负离子模式电压2800 V；鞘气（N₂）流速为40 Arb，辅助气（N₂）流速为10 Arb；毛细管温度设定为325 ℃，辅助气体加热器温度设定为300 ℃。采用全扫描方式，扫描范围m/z 100~1500，分辨率为70 K，自动增益控制为3×10⁶，最大注入时间为200 ms。碎片鉴定采用靶向MS2（tMS2）扫描，分辨率为17.5 K。通过四极杆分离前体离子，在Orbitrap中进行快速扫描高能碰撞解离MS2分析，分离窗为4.0 Da，归一化碰撞能量为10、30、50，自动增益控制为2×10⁵，最大注入时间为100 ms。

1.2.5 鉴定数据分析

取对照品溶液、益气滋肾方供试品溶液、含药血清样品、空白血清样品，按“1.2.4”项下条件进行UHPLC-Q-Extractive-Orbitrap MS分析。通过文献查阅和数据库检索，构建益气滋肾方（YZF）中药材化学成分库，从全扫描原始数据中提取该库中各组分的准确前体m/z值。随后对匹配的特征碎片进行MS2扫描，并将所得MS2信息与对照品、数据库和文献进行比较，以确认其化学结构，鉴定益气滋肾方的化学成分及原型入血成分^［13］。

1.2.6 网络药理学分析

以原型入血成分作为益气滋肾方的候选活性成分，在TCMSP数据库（https：//tcmsp-e.com/index.php）和SwissTargetPrediction数据库 （http：//SwissTargetPrediction.ch）进行靶点预测；在GeneCards （https：//www.genecards.org/），DisGeNET （http：//www.disgenet.org/）和OMIM（https：//www.omim.org/） 数据库筛选COPD相关基因，选择在3个库中出现两次及两次以上的作为候选靶标；以两者的交集靶点作为益气滋肾方治疗COPD的潜在靶点。分别将成分靶点、COPD靶点和交集靶点导入String数据库（https：//string-db.org/）中，相互作用得分最低要求以中等置信度≥0.400为条件获取构建PPI的TSV数据表，导入Cytoscape 3.9.1中可视化。使用CytoNCA插件获得PPI网络的3个拓扑指标［节点度中心性（DC）、接近中心性（CC）和介数中心性（BC）］不小于均值进行二次筛选核心靶点。在Metascape数据库（http：//metascape.org/）进行京都基因组百科全书（KEGG）和基因本体（GO）富集分析，以P值大小筛选GO前10位和KEGG前20条结果，在微生信在线网站（http：//www.bioinformatics.com.cn/）进行可视化^［14］。

1.2.7 COPD小鼠模型建立与YZF作用机制研究

本实验采用香烟烟雾暴露法制备COPD小鼠模型。50只C57BL6/J雄鼠按随机数字表法分为对照组、模型组、益气滋肾方高、低剂量组、N-乙酰半胱氨酸（NAC）组，10只/组。除对照组外，其余组小鼠均在熏烟箱内以烟雾浓度（30±5）%进行烟雾熏吸，66 min/次，2次/d，6 d/周。以初次熏烟开始时间为第1周，持续16周^［15］。从第17周第1天起，对照组和模型组给予纯水灌胃（0.2 mL/10 g），其余组给予相应药物进行干预，YZF高剂量组灌胃YZF水溶液6.38 g/（kg·d）；YZF低剂量组灌胃YZF水溶液3.19 g/（kg·d）；NAC灌胃NAC水溶液78 mg/（kg·d），给药2次/d，连续给药8周。所有操作持续到第24周取材前1 d结束。

药物灌胃量采用等效剂量系数换算公式，公式为D_小鼠=D_人×（K_小鼠/K_人）×（W_小鼠/W_人）^2/3。D：剂量；K：体型系数；W：体质量；K=A/W^2/3，（A：体表面积）。

1.2.7.1　一般情况与肺功能检测

每天上午熏烟或灌胃前观察小鼠的饮食情况、精神状态和活动能力，每周称重。取材前1 d使用全身体积描记系统检测小鼠潮气量（TV）、每分钟呼气量（MV）、呼气中期流速（EF50）、呼气峰流速（PEF）。

1.2.7.2　肺组织病理

取全肺，PBS冲洗表面血液后拍照保留肺外观照片，并称量肺湿质量。取小鼠左肺，使用10%多聚甲醛灌注并固定。将组织制成切片进行常规HE染色后观察各组气道及肺泡的病理变化。在CaseViewer软件200倍视野下随机选取6个不同视野进行平均肺泡数（MAN）、肺泡平均线性截距（MLI）的量化并测量支气管壁厚度（BWT）。

1.2.7.3　肺泡灌洗液的IL-6、IL-1β、TNF-α含量

用小鼠BALF原液作为样本，根据ELISA试剂盒说明书操作，检测各组小鼠BALF中的IL-6、IL-1β、TNF-α含量。

1.2.7.4 　肺组织PI3K、Akt、p-Akt、p65、p-p65蛋白表达检测

采用免疫组化（IHC）法检测肺组织PI3K、Akt、p-Akt、p65、p-p65蛋白的表达。用CaseViewer软件在200倍视野下随机截取每张肺组织切片的气道和肺泡视野10个，使用Image-Pro Plus 6.0专业图像采集与分析系统计算图像积分光密度值（IOD）进行量化。

1.2.8 统计学分析

采用SPSS 25.0进行统计学分析，Graphpad Prism 9.5作图，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，方差齐者采用LSD法，方差不齐者采用Dunnett's T₃法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 益气滋肾方的化学成分分析

对益气滋肾方质谱数据进行分析后，共鉴定出156种化合物，黄酮及黄酮苷类化合物（26种）、生物碱类化合物（27种）、皂苷类化合物（11种）、木脂素类化合物（15种）和氨基酸类（15种）是益气滋肾方的主要成分。其他结构包括10种脂肪酸、8种有机酸类、6种核苷、6种杂环、5种羧酸、5种萜类、4种苯丙素、3种糖苷、3种糖类、1种香豆素和11种其他化合物。在正离子模式已可以鉴定所有成分，因此只展示正离子模式下的总离子色谱图（图1A）。

2.2 主要化学成分的鉴定与结构解析

2.2.1 黄酮及黄酮苷类

益气滋肾方中总共鉴定出黄酮类成分26种，主要来源于陈皮等药材。对于黄酮苷元类，裂解方式主要是丢失CO₂、CO、H₂O、CH₃等中性分子以及逆狄尔斯-阿尔德（RDA）重排^［16］。对于黄酮苷类，主要有中性丢失葡萄糖（162 000）和鼠李糖（146 000）的碎片。以橙皮苷（Hesperidin）为例，其准分子离子峰［M+H］⁺质荷比为611.1965，推测其分子式为C₂₈H₃₄O₁₅，在二级质谱图（图1C）中可以看到脱葡萄糖中性丢失碎片在m/z 449.1426［M+H-glu］⁺； 继续脱鼠李糖碎片在m/z 303.0863［M+H-glu-rha］⁺，即其苷元橙皮素的碎片，其他碎片如369.0969、263.0549、153.0182等，裂解规律如图1C所示。

2.2.2 生物碱类

益气滋肾方中总共鉴定出生物碱类成分27种，主要来源于贝母等药材。浙贝母主要含有甾体生物碱。甾体生物碱的特征片段很少，只能发现H₂O的中性损失。因此，主要通过将保留时间与标准品进行比较，可以确认这些结构。以贝母素甲（peimine）为例，其［M+H］⁺在m/z 432.3465，推测其分子式为C₂₇H₄₅O₃N，如图1D所示，有响应较强的脱水碎片于m/z 414.3373.

2.2.3 皂苷类

益气滋肾方中总共鉴定出皂苷类成分11种，主要来源于人参等药材。鉴定的人参皂苷主要为丙二酰人参皂苷，又称酸性人参皂苷，具有连接在其6位的丙二酰基团。两种主要的人参皂苷是原人参皂苷-葡萄糖基C-3/或C-20上连接有糖部分的二醇型人参皂苷，及糖基结合在C-6和/或C-20处的原人参三醇型人参皂苷。以20（S）-人参皂苷Rg3（20（S）-Ginsenoside Rg3）为例，其准分子离子峰在m/z 785.5031，推测其分子式为C₄₂H₇₂O₁₃，如图1E所示，该准分子离子之后会由于2种葡萄糖基中性丢失产生皂苷元碎片于m/z 461.3989，之后会依次脱水生成人参皂苷特征的碎片于m/z 443.3883［M+H-2glu-H₂O］⁺，425.3775［M+H-2glu-2H₂O］⁺； 407.3687［M+H-2glu-3H₂O］⁺，经过与标准品质谱图比对鉴定为20（S）-Ginsenoside Rg3。

2.2.4 木脂素类

益气滋肾方中总共鉴定出木脂素类成分15种，主要来源于五味子等药材，结构主要为联苯环辛二烯、螺苯并呋喃联苯环辛烯、4-芳基四氢萘、2，3-二甲基-1，4-二芳基丁烷和2，5-二芳基四氢呋喃类木脂素，其中联苯环辛二烯种类最多，生物活性最强。联苯环辛二烯包括Schisanterherin A、Gomisin L2和Schisandrin A、B。其二级质谱特征性的在于中性丢失2-甲基丁酰基（C₄H₆COOH），羟甲基（CH₃OH），羧基（CO₂），羰基（CO），甲基（CH₃）和水（H₂O）等基团产生的碎片。以五味子甲素（Schisandrin A）为例，在图1F中，五味子甲素在保留时间为30.09 min时，在m/z 417.2268处有一种带正电的准分子离子（［M+H］⁺），推测其分子式为C₂₄H₃₂O₆。之后通过甲基和甲氧基中性丢失，产生包括m/z 402.2031 （［M+H-CH₃］⁺），386.2083 （［M+H-CH₃-O］⁺）和371.1854 （［M+H-2CH₃-O］⁺）等特征碎片。

2.3 益气滋肾方原型入血成分分析

对含药血清质谱数据进行提取，扣除空白血清信号，得到入血成分84种，再去除41种内源性成分后最终得到益气滋肾方原型入血成分43种（表1，图1B）。

2.4 益气滋肾方的网络药理学结果

2.4.1 益气滋肾方原型入血成分靶点及分析

以表1中鉴定出的43种原型入血成分作为研究对象，合并7个同分异构体后，用剩余36个成分做网络药理学研究，获取了704个潜在靶点（图2A）。构建704个靶点的PPI网络并进行KEGG和GO富集分析，结果表明这些成分可能通过调控神经活性受体-配体相互作用、钙信号通路、cAMP信号通路、脂质与动脉粥样硬化、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路；参与蛋白磷酸化、正向调控磷酸化、调控MAPK级联等生物过程（图2D、E）来干预COPD。根据节点度值取前100、20个靶点进行可视化处理，包括AKT1、STAT3、TP53、EGFR、CASP3、BCL2、JUN、MTOR、SRC、CTNNB1等（图2B、C）。

2.4.2 COPD疾病靶点及分析

从DisGeNET、OMIM和GeneCards数据库中最终筛选出1199个COPD靶点，并进行富集分析（图3A、B、D）。排名前20位的信号通路包括癌症通路、脂质与动脉粥样硬化、PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路等。对选取的COPD疾病靶点进行PPI网络分析，根据度值选取并可视化前100个重要靶点（图3C），包括AKT1、TNF、IL-6、IL-1β、ACTB、IFNG、STAT3、TP53、EGFR、SRC等。

2.4.3 益气滋肾方与COPD交集靶点的分析

704个YZF原型入血成分靶点与1199个COPD靶点合并去重得到184个共同靶点（图4A），将此视为YZF治疗COPD的潜在靶点，构建“YZF有效成分-交集靶点”网络（图4B），共有216个节点和695条边。通过Cytoscape 3.9.1的CytoNCA插件对网络拓扑参数进行分析，提取度值大于30的10个核心成分（表2）。对交集靶点进行KEGG和GO富集分析（图4C、D），前20位通路主要包括脂质与动脉粥样硬化、癌症相关通路、PI3K-Akt、HIF-1信号通路等。GO分析表明，这些靶点主要参与细胞活化、炎症反应、正向调控炎症因子产生、蛋白质磷酸化、正向调控磷酸化等生物过程；具有蛋白激酶活性、磷酸酶活性、蛋白酪氨酸酶活性、丝氨酸/苏氨酸激酶活性等分子功能。PPI网络筛选并可视化前20个核心靶点，包括AKT1、TP53、STAT3、EGFR、SRC、MMP-9、CASP3、TLR4、HIF1A、MAPK3等（图4E、F）。

2.5 益气滋肾方可减轻COPD小鼠肺组织病变

本实验造模和干预共24周（图5A），实验周期结束后取材。从肺外观上看，空白组小鼠的肺大小、色泽正常。模型组小鼠的肺体积稍大，部分肺叶表面呈烟尘沉积的黑色，充血明显，给药组的肺外观好于模型组（图5B）。计算肺系数，与对照组比，模型组小鼠肺系数增加（P<0.001）；与模型组比，益气滋肾方高剂量组和NAC给药组的肺系数均降低（P<0.001），益气滋肾方低剂量组差异无统计学意义（P>0.05）。HE染色结果显示，对照组小鼠的肺组织未见明显病理损伤。模型组小鼠气管壁可见明显增厚，周围炎性细胞浸润；肺泡大小不一致，肺泡腔扩大，肺泡壁厚度增加，部分破裂融合，且肺泡腔内分布大量吞噬烟尘颗粒的巨噬细胞，益气滋肾方组和NAC组的小鼠肺病理损伤明显改善（图5B）。与对照组比较，模型组小鼠BWT和MLI升高（P<0.001），MAN降低（P<0.001）；与模型组比较，益气滋肾方给药组和NAC组BWT和MLI均降低，MAN均升高（P<0.001，图5C）。

2.6 益气滋肾方能改善COPD小鼠肺功能

与对照组相比，模型组小鼠肺功能降低，结果具有统计学意义（P<0.001）；与模型组相比，经药物干预后，各组小鼠肺功能均有所改善，差异具有统计学意义（P<0.05，图6B）。

2.7 益气滋肾方减少COPD小鼠BALF炎症因子表达

与对照组相比，模型组小鼠BALF中的TNF-α、IL-1β、IL-6含量明显升高（P<0.001）。与模型组相比，益气滋肾方组和NAC组的TNF-α、IL-1β、IL-6含量均下降（P<0.001，图6A）。

2.8 益气滋肾方抑制COPD小鼠肺组织PI3K/Akt/NF-κB通路相关蛋白的表达

与对照组比较，模型组小鼠肺组织PI3K、Akt、p-Akt、p65和p-p65表达升高（P<0.001），与模型组比较，益气滋肾方组、NAC组小鼠肺组织PI3K、Akt、p-Akt、p65和p-p65的表达均有所下调（P<0.05，图7）。进一步，从益气滋肾方“成分-靶点”网络中提取了作用于PI3K/Akt/NF-κB通路关键靶点的主要成分（图8）。

3 讨论

COPD稳定期作为在慢阻肺病程中患者的症状相对平稳的阶段，干预的核心在于预防急性发作、延缓疾病进展和提高患者的生存质量^［17］。益气滋肾方在临床上对COPD稳定期患者的治疗取得良好效果，能够减少急性加重的次数与持续时间，延缓肺功能衰退，增加患者运动耐量^［4］。本研究发现益气滋肾方可以改善COPD稳定期模型小鼠的一般状况，肺功能，减轻肺组织损伤，降低肺组织中的炎症因子。通过临床与动物实验结果的相互印证，说明了益气滋肾方的有效性。

中药方剂以君、臣、佐、使理念配伍相同或不同药性的中药，各药物之间或增效，或减毒，共同对疾病发挥治疗作用，这种整合作用源于中药多成分-多靶点的协同起效机制^［18］。网络药理学为系统解析中药复方的整合作用提供了有效工具，且其多靶点调控机制的深入分析与复方的药效物质密切相关。本研究通过UHPLC-Q-Extractive-Orbitrap MS共鉴定出益气滋肾方中156种化学成分、含药血清中43种原型入血成分，包括黄酮及黄酮苷类、生物碱类、皂苷类、木脂素类等主要活性成分。黄酮类化合物具有抗炎和抗氧化等活性^［19］，如橙皮苷能通过抑制NF-κB来减轻炎症，并通过ERK/Nrf2通路降低COPD小鼠体内的氧化应激水平^［20］；生物碱类如贝母辛（peimisine），可通过抑制ROS和Nrf2/Keap1和JNK/MAPK依赖性途径下调丙二醛（MDA）、4-羟基壬烯醛（4-HNE），从而延缓香烟烟雾引起的COPD病程进展^［21］，此外生物碱类化合物还具有类似广谱抗生素的特点，通过抑制细菌核酸和蛋白质合成、损伤细菌细胞膜、抑制细菌的代谢产生而抗感染作用^［22］；皂苷类化合物，如人参皂苷类，可以靶向NF-κB、Nrf2、MAPK和PI3K/Akt通路缓解炎症、氧化应激和细胞凋亡^［23］；木脂素类化合物，如五味子甲素（Schisandrin A）通过上调Nrf2刺激血红素加氧酶-1（HO-1）的表达，显著降低氧化应激和NLRP3/ASC/Caspase1炎性小体复合物的产生，以抑制IL-1β和IL-18引起的炎症反应并减轻COPD模型小鼠的肺损伤^［24］。益气滋肾方可能通过这些化合物之间对炎症或氧化应激的共同调控作用产生对COPD治疗的整合效应。

基于原型入血成分进行网络分析，GO分析表明，益气滋肾方干预COPD与炎症反应、细胞活化、正向调控磷酸化和细胞因子分泌等生物过程及蛋白激酶活性、磷酸酶活性、丝氨酸/苏氨酸激酶活性等分子功能相关；KEGG分析通路富集于脂质与动脉粥样硬化、癌症、PI3K-Akt、HIF-1以及NF-κB等通路。由于PI3K-Akt信号通路在成分靶点、疾病靶点和交集分析中均显著富集，且可以通过直接磷酸化或间接信号级联激活下游激酶，激活NF-κB通路，促进炎症^［25］，因此，我们重点关注这条通路，并验证益气滋肾方对PI3K/Akt/NF-κB信号通路以及对细胞因子分泌的影响。

在长期香烟烟雾暴露状态下，PI3K/Akt通路会被活性氧、细胞因子等激活，Akt的持续激活会增强肺泡巨噬细胞、中性粒细胞及T淋巴细胞的存活能力，并间接导致这些炎细胞在呼吸道、肺实质中募集^［26］。Akt作为联系PI3K/Akt和NF-κB通路的核心调控分子，一方面通过磷酸化IκB促进其降解，释放NF-κB（p50/p65），驱动TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎细胞因子表达^{［27， 28］}；另一方面，Akt可直接磷酸化NF-κB p65的转录激活域，增强NF-κB p65的DNA结合能力，进一步放大促炎信号^［29］。这种双重调控机制在香烟烟雾、体内氧化应激及TNF-α、IL-1β等炎症因子刺激下，形成正反馈循环，驱动COPD的慢性炎症并加剧组织损伤。本研究显示COPD小鼠的肺组织中，PI3K/Akt/NF-κB信号通路被激活，关键蛋白PI3K、Akt、p65及磷酸化蛋白表达增加，而益气滋肾方和NAC干预能显著抑制肺组织PI3K、Akt、p65及磷酸化蛋白表达。同时COPD模型组小鼠肺中细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α均显著升高，且肺组织有炎性浸润加剧、肺实质破坏和气道增厚的现象，这与PI3K/Akt/NF-κB通路的激活释放炎症因子和放大的炎症级联反应有关；益气滋肾方和NAC干预后均可显著降低这三种炎症因子，改善肺病理，对肺部起到保护作用。之后，我们结合前期网络药理学结果，讨论了益气滋肾方中作用在该通路及其上下游的药效成分，二氢辣椒素可减少TNF-α诱导的NF-κB激活及炎症因子、内皮细胞粘附分子的产生^［30］；五味子醇甲能通过调节NF-κB/IκBα抑制炎症反应^［31］；贝母素甲通过作用于EGFR/PI3K/Akt通路，抑制EGFR与配体结合形成的二聚体自磷酸化激活PI3K/Akt信号通路的过程，从而抑制下游NF-κB信号促进炎症的过程^［32］；五味子丙素通过调节NF-κB/Nrf-2向细胞核的易位，同时抑制MAPK途径，发挥抗炎和抗氧化作用^［33］；川陈皮素，通过抑制PI3K-Akt、MAPK、NF-κB等信号通路，下调炎症因子表达，下调趋化因子，同时激活Nrf2抗氧化通路增强SOD、HO-1酶活性，减少活性氮和活性氧，有效缓解COPD的炎症、氧化应激和气道重塑^［34］。表明益气滋肾方的主要成分通过直接抑制PI3K/Akt、NF-κB以及通过调控EGFR、MAPK、TNF等通路，多途径作用于PI3K/Akt/NF-κB通路来产生抗炎作用。

本研究通过整合血清药物化学和网络药理学，系统揭示了益气滋肾方包含的活性化合物以及通过PI3K/Akt/NF-κB信号通路改善COPD炎症反应这一潜在机制，其药效物质可能包括五味子醇甲、贝母素甲、五味子丙素和川陈皮素等。后续的研究可利用原型入血成分鉴定结果。开展体外细胞实验，先筛选益气滋肾方的最佳协同组分，再结合体内实验验证组分方的药效和作用机制，为益气滋肾方的临床应用和临床转化提供依据。

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