桂枝茯苓丸活性成分常春藤皂苷元通过抑制JAK2/STAT3通路抑制宫颈癌细胞的生长

Therapeutic mechanism of hederagenin, an active component in Guizhi Fuling Pellets, against cervical cancer in nude mice

摘要

目的 基于网络药理学分析桂枝茯苓丸有效成分治疗宫颈癌的潜在作用机制，进一步通过实验手段对其抗肿瘤作用进行验证。 方法 利用TCMSP、Genecards、OMIM、TTD、Swiss Target Prediction等数据库，获得桂枝茯苓丸的作用靶点和宫颈癌发病相关的靶点。构建靶点蛋白质相互作用网络，进行GO生物学过程与KEGG通路富集分析，使用Cytoscape v10.0.0构建桂枝茯苓丸治疗宫颈癌的“中药-有效成分-靶点-通路”网络。利用CB-Dock2软件对药物和潜在作用靶点进行分子对接，预测桂枝茯苓丸有效成分的具体作用靶点。在实验验证部分，采用CCK-8、Western blotting实验体外验证桂枝茯苓丸有效成分的抗肿瘤活性。动物实验中，使用12只雌性BALB/c裸鼠构建裸鼠皮下种植瘤模型并将其分为2组（DMSO组及用药组，6只/组），用于评估药物体内抗肿瘤活性，并行组织切片苏木精-伊红与免疫组织化学染色进一步评估药物体内使用安全性与有效性。 结果 分析显示，桂枝茯苓丸共有338个活性成分，涉及247个作用靶点。宫颈癌发病相关的靶点共10127个，通过取交集获得桂枝茯苓丸有效成分治疗宫颈癌的潜在作用靶点195个。基于节点度分析筛选出关键靶点为GABRA1、PTK2、JAK2、HTR3A、GSR和IL-17，并将它们与桂枝茯苓丸的关键前10名活性成分进行后续的分子对接。分子对接结果显示常春藤皂苷元，菜油甾醇，豆甾醇等成分与关键靶点具有较低的结合能。基因本体富集分析显示，桂枝茯苓丸有效成分在治疗宫颈癌主要集中在对类固醇激素，氧化应激，脂多糖等生物学过程。常春藤皂苷元在体外和体内都能够表现出抗肿瘤活性，细胞生长受到抑制（P<0.05），同时STAT3磷酸化水平降低（P<0.05）。动物实验提示，裸鼠皮下瘤体积生长速度更慢（P<0.05），且常春藤皂苷元的体内使用具有一定的安全性。 结论 桂枝茯苓丸中的多种有效活性成分可通过多个途径抑制宫颈癌细胞的生长，从而发挥抗肿瘤作用。其中，常春藤皂苷元可能通过与JAK2蛋白紧密结合，抑制STAT3磷酸化，进而显著发挥其抗肿瘤活性。

Abstract

Objective To explore the therapeutic mechanism of Guizhi Fuling (GZFL) Pellets against cervical cancer. Methods Publicly available databases were used to identify the targets of GZFL Pellets and cervical cancer to construct the protein-protein interaction (PPI) network, followed by GO biological process and KEGG pathway enrichment analysis of the hub genes. The "Traditional Chinese Medicine-Active Ingredients-Targets-Pathways" network for GZFL Pellets in cervical cancer treatment was generated using Cytoscape v10.0.0, and molecular docking of the drug and potential targets was performed to predict the specific targets of active components in Guizhi Fuling Pellets. The inhibitory effects of hederagenin, an active ingredient in GZFL Pellets, was tested in cultured cervical cancer cells and in nude mice bearing cervical cancer xenografts. Results GZFL Pellets contain 338 active components targeting 247 action sites. A total of 10127 cervical cancer-related targets were obtained, and among them 195 were identified as potential therapeutic targets of GZFL Pellets for cervical cancer treatment, including the key targets of GABRA1, PTK2, JAK2, HTR3A, GSR, and IL-17. Molecular docking study showed low binding energies of the active components such as hederagenin, campesterol, and stigmasterol for protein-molecule interaction. GO enrichment analysis suggested that GZFL Pellets inhibited cervical cancer primarily by regulating responses to steroid hormones, oxidative stress, and lipopolysaccharides. Among the active components of GZFL Pellets, hederagenin was found to inhibit cervical cancer cells in vitro and significantly reduced STAT3 phosphorylation level in the cancer cells. In nude mice bearing cervical cancer xenografts, hederagenin effectively inhibited tumor growth rate without causing obvious adverse effects. Conclusion GZFL Pellets inhibit cervical cancer cell growth through its multiple active components that target different pathways. Among these components, hederagenin inhibits tumor cell growth possibly by directly binding to JAK2 protein to inhibit STAT3 phosphorylation.

Graphical abstract

关键词

网络药理学 / 桂枝茯苓丸 / 宫颈癌 / 人乳头瘤病毒感染 / 常春藤皂苷元

Key words

network pharmacology / Guizhi Fuling Pellets / cervical cancer / HPV infection / hederagenin

宫颈癌是全球女性常见的妇科恶性肿瘤，2020年全球新发病例约60万，死亡34万，位居女性癌症死亡率第4位^［1］，其主要病理类型为宫颈鳞状细胞癌（占比85%）和宫颈腺癌（占比10%~12%）^［2］。人乳头瘤病毒（HPV）感染是宫颈癌的主要病因，但我国疫苗接种率低^［3］。现有治疗宫颈癌方法效果有限，亟需探索更精准有效的治疗手段。

2000多年前，《黄帝内经》就有关于宫颈癌的记载，唐代孙思邈在《千金方》中描述的症状与现代宫颈癌晚期相似。中医将宫颈癌归为“症瘕”“五色带”“阴疮”“虚损”等范畴，初期多为实证，如湿热蕴毒、肝郁气滞等。《诸病源候论》中“积聚”与现代医学中HPV感染及免疫失衡的发病机制呼应。东汉张仲景的《金匮要略》记载的桂枝茯苓丸（Guizhi Fuling Wan， GZFLW），由桂枝（Cinnamomi Ramulus）、茯苓（Poria Cocos）、桃仁（Persicae Semen）、白芍（Paeoniae Radix Alba）、牡丹皮（Cortex Moutan）组成，具有活血化瘀、温阳散寒、利水消肿的功效，可能对宫颈癌有治疗作用^{［4， 5］}。然而，目前关于GZFLW治疗宫颈癌的有效成分、作用靶点及分子机制的研究仍较少，仅停留于生物信息学预测阶段，缺乏深入的实验验证结果^［6］，因此亟待进一步探究。

分子对接技术和网络药理学为中医药多组分药物研究提供了新途径^［7］，有助于深入理解中药作用机制和相互作用。网络药理学结合中草药靶点与疾病网络^［8］，能够为中药研究带来新发现，推动中医药现代化，也为宫颈癌患者提供新的治疗策略。

本研究结合网络药理学和实验验证，解析GZFLW治疗宫颈癌的机制。通过分子对接分析其有效成分及靶点，明确GZFLW有效成分常春藤皂苷元的潜在靶蛋白，并开展体内外实验验证，旨在为治疗宫颈癌提供科学依据，为精准治疗开辟新方向。

1 材料和方法

1.1 桂枝茯苓丸成分和筛选靶点预测

在Traditional Chinese Medicine Systems Pharm-acology Database（TCMSP）数据库（https：//tcmsp-e.com/）和中国知网中检索5种中药的相应组成信息。以口服生物利用度、药物相似度作为筛选标准。设置口服生物利用度≥30%、药物相似度≥0.18，筛选出5种中药的活性成分。活性成分靶基因在Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）和TCMSP中获取。

1.2 宫颈癌靶点预测

通过Genecards （https：//www.drugbank.ca/）、在线孟德尔遗传人类遗传数据库（OMIM）（https：//omim.org）和治疗靶点数据库（TTD）（http：//db.idrblab.net/ttd/）数据库，筛选宫颈癌靶点基因。搜索范围限定于人类，入选标准为Genecards的基因功能预测评分大于1，并在合并数据后剔除重复基因。。

1.3 收集交集靶点

选取已筛选的桂枝茯苓丸的靶点和宫颈癌相关的靶点导入微生信网站（http：//www.bioinformatics.com.cn），绘制靶点维恩图，得出交集靶点进行后续分析。

1.4 构建核心靶点PPI网络

将收集到的交集靶点导入STRING： functional protein association networks数据库（https：//cn.string-db.org/），并将物种设置为人类（Tomo智人）。在构建相互作用网络时，置信度阈值设定为>0.4（中等置信度），同时隐藏不连续节点。随后，利用该网络数据构建了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络图。为优化网络的可视化效果并进行拓扑分析，我们将网络数据导入Cytoscape v3.10.0软件中进一步处理。最终，定义优势目标为那些得分大于50的目标。

1.5 GO和KEGG富集分析

将采集到的交集靶点导入微生信网站（https：//www.bioinformatics.com.cn/），进行基因本体（Gene Ontology， GO）富集与京都基因和基因组百科全书通路（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG）富集分析。选择物种为“人类”，通路入选标准为P<0.05。

1.6 构建“药物-活性成分-核心靶点”网络模型

在Cytoscape3.10.0 软件中构建“桂枝茯苓丸-活性成分-核心靶点”网络模型，以中药、活性成分、核心靶点、疾病为节点，以它们之间的相互作用为边，然后进行拓扑分析。对活性成分和靶点按照度值进行排序，度值越大的结果，成为潜在活性成分和靶点的可能性越大。

1.7 分子对接

从Pubchem （https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取活性成分的化学结构，从RCSB Protein Data Bank（PDB）（http：//www.pdb.org/） 获取靶蛋白的三维结构，然后上传到CB-Dock2（https：//cadd.labshare.cn/cb-dock2/php/blinddock.php）上，计算结合亲和能（kcal/mol），越低的结合能提示越强的蛋白和分子之间相互作用。结合能小于-4.25 kcal/mol表示良好的对接亲和力，结合能小于-7 kcal/mol表示优秀的对接亲和力。

1.8 细胞系与培养方法

鼠源宫颈癌细胞系U14细胞购自中国科学院上海细胞研究所。培养基使用杜氏改良 Eagle 培养基（DMEM），在37 ℃、5%二氧化碳恒温培养箱中培养，每3 d按照1∶3的比例传代培养。使用90% FBS与10% 二甲基亚砜（DMSO）混合体系冻存细胞，放于程序降温盒内，-80 ℃降温1 d后转移至液氮保存。复苏时，将细胞冻存管于37 ℃水浴迅速融化，用2 mL完全培养基稀释后离心，再使用1 mL完全培养基重悬细胞沉淀，培养于60 mm培养皿中。铺板时，将U14细胞消化收集重悬后计数，按实验设计的分组铺于96孔板或6孔板中。其中96孔板的铺板密度为3000/孔，6孔板为10万/孔。96孔板的培养体积为100 μL，6孔板为2 mL。

1.9 CCK-8实验

将U14细胞铺于96孔板中。对于测定IC₅₀的实验，分为0、25、50、75、100、200 μmol/L 6组，每组3个生物学重复，共18孔；对于时间梯度实验，分0、24、48、72、96 h 5组，每组3个生物学重复，同时在100、200 μmol/L下重复，共30孔。按照方案给予不同浓度或时间的常春藤皂苷元处理，测定时，按照每孔100 μL空白培养基+10 μL CCK-8试剂的比例配置体系，然后按每孔100 μL的体积替换旧培养基，并设置空白孔。37 ℃培养2.5 h后测定吸光度A_{450 nm}。

1.10 Western blotting

根据文献报道^［9-11］，Janus Kinase/Signal Transducer and Activator of Transcription 3（JAK/STAT3）信号通路在多种肿瘤（包括宫颈癌）的发生发展过程中具有关键作用，其异常激活通常与不良的临床预后密切相关。p-STAT3（Y705）、总STAT3、β-actin抗体与对应的二抗均购自武汉三鹰生物技术有限公司。首先，使用10%浓度的分离胶与5%浓度的浓缩胶进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，缓冲体系为Tris-甘氨酸。电泳参数为90 V，30 min浓缩，150 V，60 min分离。转膜参数为220 mA，120 min湿转。封闭使用无蛋白封闭液（苏州新赛美生物科技有限公司）以避免牛奶中酪蛋白的影响。洗膜缓冲液为Tris Buffered Saline with Tween（TBST），封闭、孵育一抗与二抗后均需洗膜5×3 min。p-STAT3（Y705）与总STAT3的稀释使用比例为1∶2000，β-actin抗体的稀释使用比例为1∶20 000。二抗稀释比例为1∶5000。孵育一抗的条件为4 ℃过夜，二抗为常温1 h。抗体孵育完成后即可发光拍照，ECL超敏型化学发光液（A+B，苏州新赛美生物科技有限公司）。

1.11 动物实验

实验所用雌性BALB/c裸鼠购自广东至远晴乐生物医药科技有限公司。本研究实验方案经过瑞业模型动物中心实验动物伦理委员会的批准（伦理批号：RYEth-20241201654）。首先，按每只鼠1×10⁶ U14细胞的比例在裸鼠左前肢腋下乳头处皮下种植肿瘤（6只/组，共2组）。当肿瘤生长至100 mm³时，开始对实验组裸鼠进行给药处理。每2 d按50 mg/kg、100 μL的参数灌胃给药1次，并测量裸鼠体质量与肿瘤体积。常春藤皂苷元粉末需先用DMSO配置储备液，然后按20%储备液+40% PEG300+5% Tween 80+35%生理盐水的比例配置工作液。以第1次给药时间作为day 0，在day 2、day 4再次给药，在day 6对照组肿瘤大于1000 mm³时处死所有裸鼠，取材肝、脾、肾，用4%多聚甲醛浸泡固定24 h。

1.12 苏木素-伊红（HE）染色

固定后的肝脏、脾脏、肾脏与肿瘤切片均由武汉赛维尔生物科技有限公司制作。将切片脱蜡水化后，滴加苏木素染液染色5 min，冲洗沾干多余水分后用伊红染液染色5 min，冲洗沾干多余水分后，脱水、用盐酸酒精溶液分化3 s、用中性树胶封片即可观察。

1.13 免疫组化

免疫组化试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司，Ki-67抗体与二抗购自武汉三鹰生物技术有限公司。切片经脱蜡水化后，浸泡于1×的柠檬酸钠抗原修复液中，在高压锅内煮沸20 min修复抗原。冷却至室温后，滴加内源性过氧化物酶去除试剂处理20 min。滴加5%牛血清白蛋白（BSA）浸没组织，常温湿盒内封闭1 h。将Ki-67抗体1∶100稀释后，滴加浸没组织，4 ℃湿盒孵育过夜。在室温湿盒中按照1∶100的比例孵育二抗1 h。滴加1×3，3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）显色液显色10 min。用苏木素染核5 min。最后与HE染色一样进行脱水、分化与封片，即可观察。

1.14 统计学分析

采用GraphPad Prism 9.0中进行统计学分析。对于两组间比较，使用Student's t检验；对于多组间比较使用单因素方差分析，其中实验组与对照组两两比较，使用Dunnett's t检验；对于肿瘤生长曲线与裸鼠体质量曲线，使用双因素方差分析，其中两两比较使用Sidak检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 桂枝茯苓丸的成分筛选和靶点预测

在TCMSP数据库和Swiss Target Prediction数据库中，获取了桂枝茯苓丸5个中药的活性成分，一共有338个相关活性成分和247个相关靶点，在此基础上做进一步分析。

2.2 宫颈癌的潜在靶点筛选

从Genecards、OMIM、TTD数据库分别得到9744个、495个、12个靶点后，经过删除重复项处理，得到10127个宫颈癌发病的潜在相关靶点，再利用微生信在线网站对桂枝茯苓丸相关靶点和疾病靶点进行交集，一共得到195个交集靶点，即与药物和疾病都相关的靶点（图1A）。

2.3 构建“中药-活性成分-靶点”网络和识别核心成分

利用Cytoscape v10.0.0 软件，构建了“中药-活性成分-靶点”组成的复杂网络（图1B），对桂枝茯苓丸的组成药物、活性成分和靶点的相互作用进行可视化。网络中共有5种药材、218种化合物、86个相关靶点。粉色菱形代表中药，它们是桂枝、茯苓、桃仁、白芍和牡丹皮，橙色圆形代表活性成分，而粉色图形代表5种中药的潜在靶点。在网络中边缘颜色从浅到深反映了中介值的从低到高的变化。该网络共包括277个节点和3005连接线。

依据节点度≥24，我们最终筛选出11个核心成分，包括quercetin、beta-sitosterol、kaempferol、（+）-catechin、hederagenin、Stigmasterol、sitosterol、luteolin、Baicalein、campesterol、GA54。有关这些化合物的拓扑参数的详细信息如表1所示。

2.4 PPI 网络构建

使用STRING 数据库构建靶蛋白的PPI网络，在Cytoscape软件中进行可视化。PPI网络包括309个节点，3373条连接线（图2A）。使用Cytoscape的 MCODE 插件对PPI网络进行模块分析，选择节点状态为seed的关键靶点，按degree大小排序获得桂枝茯苓丸和宫颈癌共同潜在相关的蛋白如下：γ-氨基丁酸A型受体α1亚基（GABRA1）、蛋白酪氨酸激酶2（PTK2）、Janus激酶2 （JAK2）、5-羟色胺受体3A（HTR3A）、谷胱甘肽还原酶（GSR）、白细胞介素-17（IL-17）。

2.5 交集靶点的GO和KEGG富集分析

通过韦恩图的交集靶点，对潜在靶点进行GO和KEGG富集分析，GO分析包括了3类：2390个生物学过程（BP）、135个细胞成分（CC）和245个分子功能（MF）。根据P值筛选出了基因计数排名前10 位的GO条目（图2B）与KEGG通路，包括：脂质和动脉粥样硬化、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、化学癌变-受体激活、lL-17信号通路、乙型肝炎、人巨细胞病毒感染、化学癌变-活性氧、弓形虫病、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染（图2C）。

2.6 桂枝茯苓丸核心成分治疗宫颈癌的分子对接

从Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）和Protein Data Bank （PDB）（http：//www.rcsb.org/）数据库获取桂枝茯苓丸核心成分的三维结构和靶点的三维结构。基于PPI网络和KEGG结果，选择6个关键靶点（GABRA1、PTK2、JAK2、HTR3A、GSR、IL-17）与10个关键化合物进行分子对接，使用CB-Dock2，初步验证核心网络药理成分与特征靶点的相互作用，得到了不同靶点和相应化合物之间的结合能（kcal/mol）（图3A，表2）。

选出3种结合能较低的化合物：常春藤皂苷元、菜油甾醇、β-谷甾醇。分子对接的结果表明，常春藤皂苷元可以与JAK2结合（图3B），参与两者结合的活性口袋的氨基酸包括JAK2的A链中的LYS607 、HIS608等，B链的ASP768、ARG769等（表2）。同时，菜油甾醇被预测可以与GSR结合（图3C），A链包括LYS67、TRP70等（表2）。而β-谷甾醇则被预测与HTR3A结合（图3D），分别是A链的PHE244、VAL247等和B链的LEU281、SER285等（表3）。

2.7 常春藤皂苷元在体外抑制宫颈癌细胞的生长，并抑制STAT3的蛋白磷酸化

对常春藤皂苷元的抑癌活性进行了体外实验的初步验证，首先测定了常春藤皂苷元对U14细胞的半数抑制浓度（IC₅₀）为170.9 μmol/L（图4A）。两种不同浓度下常春藤皂苷元抑制U14细胞活力的时间梯度实验（图4B、C），在高浓度（200 μmol/L）与低浓度（100 μmol/L）下，常春藤皂苷元处理96 h后，肿瘤细胞生长的能力受到显著抑制（P<0.001）。高浓度的抑瘤效果显现得更早，在处理仅24 h后，即可将U14细胞的活力抑制至接近对照组的50%。然而，低浓度与高浓度组的最大肿瘤细胞生长抑制能力差别不大，均能够将U14细胞活力抑制为原来的40%左右。检测常春藤皂苷元处理U14细胞后的STAT3磷酸化蛋白水平，结果显示（图4D、E），U14细胞内的STAT3磷酸化水平降低（P<0.05）。

2.8 常春藤皂苷元在体内抑制宫颈癌细胞的生长，且具备生物安全性

体内实验结果显示，虽然2组小鼠的肿瘤体积都有增大的趋势（图5A），但给药组的肿瘤体积显著小于对照组。图5B展示了给药期间肿瘤体积的变化曲线，给药组的肿瘤生长速度慢于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），给药组的肿瘤质量低于对照组（P<0.05，图5D）。进一步，HE染色和免疫组化分析结果（图5C）表明，给药组的Ki-67水平低于对照组。另外，在给药期间，两组裸鼠的体质量均未出现明显变化，给药组与对照组相比体质量差异无统计学意义（P>0.05，图5E）。评估小鼠的重要脏器的组织学结构。H＆E染色结果显示，给药组的小鼠肝脏实质形态正常，无变性或损伤，肝门静脉结构清晰；脾脏生发中心结构清晰、层次分明，无变性或损伤；肾脏肾单位结构完整，肾小球无变性或沉积，出入球小动脉及肾小管、集合管结构均正常（图6）。

3 讨论

宫颈癌是全球中较高发的女性恶性肿瘤^［12］，虽然已有一些治疗策略在临床上表现出较好的效果，但是仍存在治疗费用高，副作用大等缺点。本文基于中医药研究，探索桂枝茯苓丸治疗宫颈癌的机制，目的是延长宫颈癌患者的生存期和提高其生活质量。

早在2000多年前，《黄帝内经》中就有关于宫颈癌的记载，如“任脉为病，女子带下瘰聚”。唐代孙思邈在《千金方》中亦可见晚期宫颈癌症状的描述。临床表现中，中医将宫颈癌归为“症瘕”、“五色带”、“阴疮”、“虚损”等范畴。宫颈癌的临床表现初期多为实证，如湿热蕴毒、流注下焦，或由七情所伤、肝郁气滞、冲任损伤所致。中医治疗宫颈癌注重整体观念和辨证论治，治疗方法包括口服中药汤剂、针灸、中药敷贴等，通过调节机体内部环境，增强机体免疫力，以达到抑制肿瘤生长、防止病情恶化的目的^［13］。

桂枝茯苓丸的组成同样强调整体治疗，其治疗宫颈癌的潜在机制涉及多成分、多靶点、多途径的相互作用^［14］。上述结果提及，桂枝茯苓丸治疗宫颈癌的潜在通路可能包括：脂质代谢、AGEs-RAGE信号通路、化学癌变-受体激活通路、IL-17信号通路以及化学癌变-活性氧通路。

研究表明脂质代谢在宫颈癌的发生发展中起着重要作用^［15］。癌细胞可以利用脂质代谢的激活和相应的信号通路来加速恶性进展^［16］。晚期糖基化终产物AGEs及其受体RAGE的相互作用可能导致炎症和氧化应激^［17］，活性氧的累积则可以引起DNA损伤，促进细胞增殖和转化，从而参与宫颈癌的发展^［18］。化学致癌物可以通过激活细胞表面的受体，如芳香烃受体，影响细胞信号传导，进而促进癌变过程^［19］。在宫颈癌中，HPV病毒蛋白如E6和E7可以激活多种信号通路，促进细胞增殖和抑制凋亡，与化学致癌物的效应类似^［20］。IL-17在宫颈癌组织中的表达与宫颈癌的发展、浸润、转移相关，对宫颈癌临床诊断及预后评估有重要意义^［21］。IL-17通过促进炎症反应和免疫细胞的招募，可能促进宫颈癌的发展^［22］。因此，我们考虑，桂枝茯苓丸可能可以作用于以上通路，发挥抗宫颈癌生长的作用。

经过进一步分析，我们发现，桂枝茯苓丸的作用靶点与宫颈癌发病相关的共同靶共有195个，最后我们鉴定出关键靶点为GABRA1、PTK2、JAK2、HTR3A、GSR、IL-17。其中，PTK2为蛋白酪氨酸激酶2，可能参与细胞信号传导和细胞骨架的重组，影响细胞的增殖和迁移^［23］。在宫颈癌中，PTK2可能通过影响细胞周期和凋亡相关蛋白的表达，参与肿瘤的发展^［24］。JAK2在JAK-STAT信号通路中起着核心作用，该通路涉及细胞因子信号的传导，影响细胞的增殖、分化和凋亡^［25］。JAK2的激活与肿瘤的进展和预后不良相关，因此其高表达同样可能促进宫颈癌的发展^［26］。HTR3A是5-羟色胺受体的一种，它在调节细胞信号和神经传递中起作用^［27］。HTR3A可能通过影响细胞周期和凋亡相关蛋白的表达，参与肿瘤的发展。GSR在维持氧化还原平衡中起关键作用^［28］，其可能与癌细胞的存活维持过程相关。STAT3抑制剂Stattic能够抑制GSR的酶活性，在活性氧的作用下诱导宫颈癌细胞死亡^［29］。而IL-17可能通过抑制宫颈癌细胞凋亡及上调VEGF mRNA和蛋白水平的表达，促进肿瘤新生血管的形成，从而实现促进肿瘤生长的作用^［30］。这些基因和蛋白质通过参与不同的信号通路和生物过程，在宫颈癌的发展中扮演着重要角色，桂枝茯苓丸可能正是通过作用于上述靶蛋白来发挥的抗肿瘤机制。

分子对接结果进一步表明，桂枝茯苓丸中的3种重要的有效成分，常春藤皂苷元，菜油甾醇，豆甾醇能够与潜在的关键作用靶点紧密结合。其中，常春藤皂苷元可以与JAK2紧密结合，菜油甾醇可与GSR紧密结合，而β-谷甾醇则可与HTR3A紧密结合。桂枝茯苓丸中多种有效活性成分可以通过不同的途径发挥其抑制宫颈癌细胞的作用，从而抑制宫颈癌细胞的生长。这种多靶点的作用方式为桂枝茯苓丸在宫颈癌治疗中的应用提供了理论依据，值得注意的是，桂枝茯苓丸的有效成分常春藤皂苷元，可能可以通过直接紧密结合JAK2蛋白，从而抑制JAK2下游的信号通路来发挥其抗肿瘤效果。

我们初步证明了常春藤皂苷元在体内和体外都表现出了对鼠源宫颈癌细胞U14的抗肿瘤活性，表现为细胞活力降低，肿瘤生长减缓与Ki-67表达下调。同时，我们发现常春藤皂苷元可以抑制U14细胞中STAT3的磷酸化。STAT3作为JAK2蛋白下游信号通路的成员之一，其磷酸化减弱是对常春藤皂苷元紧密结合JAK2的一个有力佐证。此前的报道认为，常春藤皂苷元可以抑制核因子κB（NF-κB）信号通路，并抑制诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的释放，增加内皮一氧化氮合酶（eNOS）含量，从而发挥抗炎作用^［31］。在肿瘤治疗领域，常春藤皂苷元被证实可以通过损伤线粒体，上调ROS诱导人结肠癌细胞凋亡，伴随Bcl-2相关X蛋白（Bax）蛋白的上调与B细胞淋巴瘤2蛋白、Bcl-2样蛋白1和杆状病毒IAP重复序列蛋白5蛋白的下调^［32］。常春藤皂苷元抑制JAK/STAT3信号通路的作用与其抗宫颈癌活性此前均未见报道。同时，常春藤皂苷元表现出了良好的生物安全性。在用药期间，给药组的裸鼠体质量无明显变化，其肝脏、脾脏与肾脏也无明显的病理学改变。综上所述，常春藤皂苷元是一种有潜力的抗肿瘤药物，本研究为开发常春藤皂苷元抗肿瘤疗法提供了新的线索与见解。

本研究尚存一些局限。在水溶液中，常春藤皂苷元浓度大于200 μmol/L时会析出，影响了体外实验的分组设计与检测，以及体内实验的给药剂量与方式。因此，将来我们需要进一步分析常春藤皂苷元的化学结构，改良其侧链的同时保留其活性基团，在不损失药效的情况下增强其水溶性。其次U14为鼠源细胞，且呈半贴壁半悬浮生长，在低密度下会启动凋亡程序，难以进行平板克隆等实验，导致结果数据支撑较少。未来我们将使用多种人源宫颈癌细胞系模型，进行平板克隆、划痕修复与Transwell细胞迁移/侵袭实验等进一步评估常春藤皂苷元的抗肿瘤活性，同时进行细胞热迁移^［33］、小分子pull-down^［34］等实验，为常春藤皂苷元与JAK2蛋白的相互作用提供直接的数据支撑。

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