针康结合促进C57/BL6J小鼠脑缺血后星形胶质细胞转分化为神经元

Electroacupuncture combined with rehabilitation training improves neurological function of mice with cerebral ischemia by promoting astrocyte transdifferentiation

摘要

目的 探讨针康结合对脑缺血后星形胶质细胞转分化为神经元的作用。 方法 将C57/BL6J雄性小鼠注射含有GFAP启动子的腺相关病毒后，采用电凝法制备右侧大脑中动脉缺血（dMCAO）模型。造模后小鼠随机分为模型组（14 d和21 d组）和干预组（14 d和21 d组），6只/组，模型组小鼠不做任何干预，干预组在造模后24 h（1dps）给予电针百会穴及左侧合谷、内关、足三里、阳陵泉穴位，随后置于有跑轮的鼠笼中单笼饲养，每隔24 h记录活动情况。各组小鼠分别于造模后1、14、21 d进行神经功能评分，免疫荧光双重染色观察目标脑区星形胶质细胞的转分化情况。 结果 与模型组相比，针康结合干预后14 d、21 d均可明显改善dMCAO小鼠的神经功能缺损症状（P<0.05）。2/5型腺相关病毒GFAP启动子可特异性标记局部的星形胶质细胞，与14 d模型组相比，针康结合干预14 d后腺相关病毒与神经元标志物DCX的共标阳性细胞数量增加（P<0.05），与21 d模型组相比，针康结合干预21 d后腺相关病毒与神经元标志物NeuN的共标阳性细胞数量增加（P<0.05）。 结论 针康结合可促进脑缺血局部的星形胶质细胞转分化为神经元，且转分化效率与MCAO小鼠运动功能改善情况呈正相关。

Abstract

Objective To explore the effects of acupuncture combined with rehabilitation training for promoting transdifferentiation of astrocytes into neurons in mice after cerebral ischemia. Methods Male C57/BL6J mice were subjected to intracerebral microinjection of an adeno-associated virus carrying the GFAP promoter for NeuroD1 and Ngn2 overexpression in the astrocytes, followed 3 or 12 days later by electrocoagulation of the distal middle cerebral artery. After modeling, the mice were randomly divided into model group without interventions and intervention group treated with electroacupuncture at the acupoints Baihui (GV20), left Hegu (LI4), Neiguan (PC6), Zusanli (ST36), and Yanglingquan (GB34) 24 h after surgery. The mice in the intervention group were housed individually in cages with running wheels, and their activity was recorded every 24 h. Neurological function scores of the mice were assessed on the 1st, 14th, and 21st days after modeling. Transdifferentiation of astrocytes in the target brain regions was observed using double immunofluorescence staining. Results Compared with those in the model group, the mice receiving eletroacupuncture and rehabilitation training showed significant improvement of neurological deficits at 14 and 21 days after modeling. The GFAP promoter of the AAV2/5 vector specifically labeled the local astrocytes, and compared with that that in the model group, the number of AAV-positive cells colabeled with the neuronal marker DCX significantly increased after 14 days of electroacupuncture and rehabilitation intervention, and the number of AAV-positive cells colabeled with the neuronal marker NeuN significantly increased after 21 days of intervention. Conclusion In mice with cerebral ischemia, electroacupuncture and rehabilitation training can promote transdifferentiation of astrocytes into neurons in the ischemic brain region, and the efficiency of transdifferentiation is positively correlated with the improvement of motor function.

Graphical abstract

关键词

星形胶质细胞 / 脑缺血 / 转分化 / 针康结合

Key words

astrocytes / cerebral ischemia / transdifferentiation / electroacupuncture combined with rehabilitation training

星形胶质细胞是中枢神经系统占比最多的细胞之一，占中枢神经系统细胞总数的20%~50%，与神经元来源于同一类祖细胞，且遗传谱系接近^［1］，能够维持发育、正常生理和衰老过程中的中枢神经系统稳态^［2］。卒中等中枢神经系统损伤类疾病会使星形胶质细胞活化，反应性星形胶质细胞增生、肥大^［3］，形成神经胶质瘢痕，以阻止急性期病变，防止炎症和损伤的扩散。然而，神经胶质瘢痕会限制轴突的再生，阻碍神经功能的恢复^［4］。研究发现，通过抑制星形胶质细胞特征性信号传导和激活神经表型信号传导可以促进星形胶质细胞直接转分化为神经元^［5］，也有研究显示，单个转录因子可以在生理条件下诱导星形胶质细胞到神经元的转化^［6］。星形胶质细胞的转分化可限制神经胶质瘢痕的形成、促进损伤后的神经连接，这可能有助于在卒中急性损伤期后的功能恢复治疗^［7］。

针康结合是以传统中医理论作为理论指导，将传统针刺治疗与现代康复技术相结合的联合疗法，是神经康复领域新的治疗策略之一。大量临床研究结果显示，针康结合的治疗手段能够有效改善脑卒中患者的运动功能^［8-12］、认知功能^{［13， 14］}等，其机制可能与促进神经再生有关，针康结合能否促进转分化并进一步改善功能障碍，仍有待深入研究。我们的前期研究已证实，在对大脑中动脉闭塞（MCAO）小鼠给予电针联合康复训练治疗后，小鼠的肢体运动功能明显改善，Western blotting结果显示，随着干预时间的延长缺血侧星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）逐渐减少，同时新生神经元的标记物双肾上腺皮质激素（DCX）表达水平显著升高^［15］，这表明针康结合能够有效恢复肢体运动功能障碍、增强神经保护，并提示新生神经元可能来源于星形胶质细胞的转分化。因此，本研究通过病毒注射特异性感染缺血局部的星形胶质细胞，以明确针康结合干预后新生神经元的来源，为针康结合的临床应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂及仪器

腺相关病毒：AAV2/5型rAAV-GFAP-mCherry-WPRE-hGH polyA（批次5-1198-K230425，武汉枢密脑科学技术有限公司），实际滴度≥2e+12 vg/mL。

免疫荧光实验抗体：DCX（Cell Signaling Technology）、神经元核（NeuN）、GFAP、山羊抗兔IgG H&L （Alexa Fluor® 488） （abcam）。

美洛昔康注射液（齐鲁动物保健品有限公司）、碘伏消毒液（利尔康消毒科技有限公司）、硫酸庆大霉素注射液（新乡市常乐制药有限责任公司）。

立体手术显微镜（ OLYMPUS-SZX7）、颅骨钻（W.P.I.）、单极微手术电凝器（F.S.T）、TK-218I恒温摊片烤片机、包埋机（Leica）、华佗牌针灸针（苏州医疗用品厂有限公司）；华佗牌SDZ-V多功能电针治疗仪（江苏省苏州华佗医疗器械有限公司）。

1.2 实验动物

SPF级C57/BL6J雄性小鼠20只，6~8周，体质量18~25 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供（动物生产许可证号：SCXK（京）2021-0006）。小鼠适应性喂养1周，水和食物自由获得，手术前禁食12 h。动物房12 h明暗周期循环（7∶00~19∶00开始光照），室温控制为22±2 ℃，湿度为60%左右。本研究动物实验在天津中医药大学实验针灸学研究中心进行，经天津中医药大学实验动物伦理委员会批准（伦理批号：TCM-LAEC2022165）。

1.3 实验方法

1.3.1 病毒注射

用1.25%阿佛丁（0.18 mL/10 g）腹腔注射麻醉小鼠，使用脑立体定位仪固定小鼠头部，用酒精棉球消毒小鼠头皮，消毒后的手术器械进行后续操作。用手术剪沿中轴纵向剪开1~2 cm的切口。用棉签蘸取少量过氧化氢溶液，去除骨膜，暴露前囟及后囟方便调平及定位。依据前囟作为三维坐标系的坐标原点，参考小鼠成年鼠脑图谱^［16］，找到目标位置坐标。在初级运动皮层（M1）［前后（AP）：1.94 mm；内外侧（ML）：-1.5 mm；腹侧（DV）：-2.5 mm］及第一躯体感觉皮质（S1）（AP：0.54 mm；ML：-3.0 mm；DV：-2.5 mm）处标记，用直径为0.8 mm的颅骨钻头在标记处钻孔，钻孔直径 1 mm×1 mm，暴露硬脑膜。钻孔后再次调平颅骨，使用接有玻璃电极的微量注射器吸取腺相关病毒溶液，固定注射器于立体定位仪上，移动注射器于目标位置上方，缓慢下针至相应深度（对应DV值），使用微量注射泵缓慢匀速注射病毒，每个点位以0.1 μL/min的速度注射0.3 μL病毒，待注射完毕后，停针10 min后缓慢匀速出针，注射完毕后缝合皮肤，碘伏和庆大霉素对伤口进行消毒抑炎，各组小鼠在病毒感染满3周且干预周期结束后进行取材。

1.3.2 电凝法建立小鼠MCAO模型

将注射GFAP空载病毒的小鼠随机分为4组，分别为14 d模型组、14 d干预组、21 d模型组、21 d干预组（n=5）。为保证病毒感染效果，21 d组的小鼠在注射病毒后3 d（3 dpi）进行MCAO模型造模、14 d组的小鼠在12 dpi进行造模。

造模时预先使用麻醉汽化器和3%异氟烷-20%氧气混合物麻醉小鼠约3 min，并用2%（V/V）异氟烷维持术中麻醉水平，通过在右侧嗅束与大脑中动脉（MCA）的交界区至嗅束内侧2 mm用低功率电凝器将MCA阻断，手术显微镜下寻找并确认血管断端，等待10 s，检查是否有因自发性再通而引起的血流，确保成功阻断MCA血流。用可吸收性明胶海绵覆盖手术局部，缝合皮肤后皮下注射美洛昔康（0.05 mg/kg）。待小鼠麻醉苏醒后进行Longa评分初步估计神经功能缺损情况及造模成功情况，术后24 h内密切监测小鼠生命体征。在术后1 d（1dps）对小鼠进行缺血性脑卒中模型评估［Longa评分、平衡木行走实验、改良神经功能缺损（mNSS）评分］。

1.3.3 干预方法

造模前所有小鼠均实施捆绑固定，固定时间为20 min，1次/d，连续3 d。鼠笼内连续3 d放入跑轮让小鼠自由探索。

模型组：与干预组小鼠在相同时间进行捆绑固定，但不针刺。每日定时给予新鲜饮用水和食物，密切观察小鼠生命体征，不做其他任何干预。

干预组：电针方法：选取小鼠百会穴及左侧合谷、内关、足三里、阳陵泉穴位进行电针治疗，电针强度1 mA、频率2 Hz、持续时间20 min，1次/d，每次间隔24 h，动物穴位参照团体标准T/CAAM 0002-2020《实验动物常用穴位名称与定位 第3部分：小鼠》^［17］。康复训练方法：小鼠单笼饲养，1 dps电针干预结束后放回笼中，鼠笼内放入接有计数器的跑轮，每间隔24 h记录计数器读数并清零，记录小鼠每日活动情况。14 d干预组在15 dps记录跑轮圈数后灌流取材，21 d干预组在22 dps记录跑轮圈数后灌流取材。

1.3.4 神经功能缺损体征评估

行为学评分基于每组5只小鼠的数据进行评测，每项测试重复3次以确保数据的可靠性和重复性。于干预前、干预14 d、干预21 d评测，采用双盲法对小鼠进行神经功能缺损评分，包括Longa评分、mNSS评分、平衡木行走实验。具体如下：

双盲法：通过第三方（如实验协调员）将小鼠随机分配到模型组和干预组，确保每组的动物数量和特征相似，并在小鼠尾标注数字编号，3名实验人员在不明确分组，仅通过编号来识别动物的情况下进行行为学评分及数据分析，数据处理完成后由第三方揭示编号与动物组别的对应关系。

Longa 评分：参考 Zea Longa 评分标准进行神经功能评估^［18］。

mNSS评分：主要评估小鼠的运动、感觉、平衡和反射能力。小鼠的任务分值统计反映了神经功能缺损的程度，满分为18分，分数越高表示缺损愈严重^［19］。

平衡木行走实验：用以评价动物的四肢协调运动功能。所用的仪器由一方形横木（长122 cm，宽1 cm）及一个黑箱（25 cm×25 cm×20.5 cm）组成，横木与黑箱相连。在起点上方放置一束强光促使小鼠爬过横木。评分标准如下：鼠不能在横木上停留，得0分；鼠不动，但可以在横木上停留，得1分；鼠试图穿过横木，但失败，得2分；鼠爬过横木，病灶对侧后肢滑下横木次数超过50%，得3分；鼠爬过横木，病灶对侧后肢滑下横木次数大于1次小于50%，得4分；鼠爬过横木，病灶对侧后肢滑下横木1次，得5分；鼠正常通过横木过横木，得6分^［20］。

1.3.5 免疫荧光染色

小鼠用1.25%阿佛丁腹腔注射麻醉（0.18 mL/10 g），经心灌注4 ℃预冷的生理盐水后断头取脑，将其大脑固定在4%组织细胞固定液中，4 ℃冰箱保存24 h，分别经20%、30%蔗糖溶液梯度脱水至样本沉底后使用OCT包埋。围绕大脑皮质区（AP：0.5 mm及AP：1.9 mm）左右的冠状面切片（20 µm厚度）。切片经37 ℃烤箱烘干及无水甲醇固定后使用10%山羊血清溶液封闭切片30 min，然后使用一抗试剂在4 ℃下孵育20 h。14 d组一抗为DCX抗体（1∶800，每张脑片滴加40 µL），21 d组一抗为NeuN抗体（1∶200，每张脑片滴加40 µL）。室温复温30min后使用山羊抗兔IgG二抗（Alexa Fluor® 488） （1∶400，每张脑片滴加60 µL）孵育50 min，洗清二抗后DAPI试剂染色后封片，待玻片晾干后使用徕卡TCS SP5 X共聚焦显微镜拍照，观察EGFP488波长及mcherry587波长观察双标情况。每张切片随机取3个不重叠视野，每组选择3张不同小鼠大脑组织切片，采用 ImageJ软件定量分析腺相关病毒与免疫荧光抗体共标记阳性细胞数，取被检各切片之均值进行统计学分析。

1.4 统计学分析

计量资料去除极端值后以均数±标准差表示，采用SPSS 21.0软件和Grphpad 9.0软件进行绘图分析，两组之间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MCAO模型的建立及评价

与造模前相比，造模成功的小鼠一般情况表现为精神萎靡，食欲下降，饮水量下降，呼吸增加，毛发竖立。行为学表现中，1 dps小鼠的Longa评分表现为爬行时患侧肢体无力，明显向左倾斜，重者向左侧转圈。平衡木行走实验表现为左侧后肢滑下横木次数>50%，甚者不能通过横木。mNSS评分中，运动实验表现为身体向左侧偏转弯曲，不能完全伸展左侧前肢和后肢（提尾实验），感觉实验表现为左侧前肢主动伸爪动作延迟以及被动缩爪动作减慢，平衡木试验表现为左侧后肢垂落横木，甚者在平衡木上旋转；较少出现耳廓、角膜、惊恐反射丧失以及癫痫、肌阵挛的现象。统计学结果显示，与造模前相比，1 dps时Longa评分与mNSS评分均有明显升高，平衡木行走实验评分明显降低，各项指标差异有统计学意义（Longa评分：0.00±0.00 vs 1.83±0.41，P<0.05；平衡木行走实验：6.00±0.00 vs 2.17±0.41，P<0.05；mNSS评分：0.00±0.00 vs 9.67±0.52，P<0.05），说明模型具有明显的神经功能缺损症状及运动缺陷，符合MCAO模型标准（图1）。

2.2 针康结合改善dMCAO小鼠肢体运动功能情况

与模型组相比，无论是14 d还是21 d，干预组的Longa评分与mNSS评分均降低（P<0.05），平衡木行走实验评分升高（P<0.05，图2A~C）。模型组间比较发现，模型组14 d与21 d的各项行为学评分结果仅有运动功能改善的趋势而无统计学意义（P>0.05）。干预组间比较发现，延长干预时间至21 d，仅能维持已有效益，并未带来额外的显著改善。

跑轮实验结果显示，第3周治疗结束后跑轮周平均读数增加（P<0.05，图2D），干预时间与小鼠每日活动度呈正相关（R²=0.22，P<0.05，图2E）。

2.3 腺相关病毒特异性标记星形胶质细胞的情况

免疫荧光实验显示，病毒注射位点附近有大量由携带红色荧光的腺相关病毒及携带绿色荧光的GFAP抗体共染的细胞，且共染细胞呈星形或多角形、具有多个突起，符合星形胶质细胞的形态表现（图3），未观察到被腺病毒单独标记的其他细胞，表明GFAP启动子具有良好的特异性，可供后续实验继续选用。

2.4 星形胶质细胞转分化为神经元的情况

dMCAO-14 d后，与模型组相比，干预组的共染细胞数量增加（P<0.05，图4B），并且被腺病毒标记的细胞中表达DCX的比例为54.44%，共染细胞的胞体较小、细胞大小和形态不均，未见星形胶质细胞的多角形突起，偶尔可见少量延伸的轴突分支，符合新生神经元的形态表现（图4A）。

dMCAO-21 d后，与模型组相比，干预组的共染细胞数量增加（P<0.05，图4B），并且被腺病毒标记的细胞中表达NeuN的比例为26.69%，阳性细胞可见明显的橙黄色胞浆，细胞间存在绿色的轴突连接及少量树突分支，符合成熟神经元的形态表现（图4A）。与14 d干预组相比，21 d干预组的共染细胞数量增加（P<0.05）。与14 d相比，共染率有所降低。

星形胶质细胞转分化效率与干预时间的相关性分析结果显示，模型组的转分化效率与时间未见明显相关性（R²=0.088，P>0.05），而干预组的转分化效率与治疗时间呈正相关（R²=0.3895，P<0.01，图4C）。星形胶质细胞转分化效率与运动功能改善的相关性分析结果显示，转分化效率与mNSS评分（R²=0.4735，P<0.05）、Longa评分（R²=0.4874，P<0.05）及平衡木行走实验评分（R²=0.6873，P<0.05）均呈正相关（图5）。

3 讨论

3.1 病毒注射部位的选择

前期研究的TTC染色结果显示，电凝法制备的小鼠大脑中动脉缺血模型梗死半暗带区域可累及M1及S1脑区在内的大脑皮层背外侧部^［15］。M1区域直接参与生成和调节肢体的自主运动，包括运动的启动、导向和力度，研究表明，脑缺血造成的局部脑组织破坏会导致损伤远隔部位运动相关神经网络功能连接中断，患侧运动脑区之间（如前运动皮质和M1、SMA和M1）的相互连接减弱，进而造成广泛的皮质功能受累，最终引起运动障碍^［21］。S1区域是小鼠感知皮肤接触、纹理、压力和振动等触觉刺激的关键脑区，丰富的触感能够增强皮层突触可塑性，进一步促进小鼠空间记忆、缓解焦虑样行为^［22］，临床研究同样显示，躯体感觉功能障碍的恢复是运动功能完全恢复的先决条件，影响着患者整体功能恢复、日常生活活动的参与和独立性等^［23］。结合我们的前期研究结果同样可以证明^［15］，M1及S1脑区的梗死体积与模型小鼠的运动及感觉功能密切相关，在针康结合干预后，模型小鼠运动及感觉功能障碍均有明显改善，且关键脑区梗死体积显著减小。因此，后续实验内容我们选择重点观察M1及S1脑区。

接下来我们将脑立体定位图谱^［16］与TTC染色结果^［15］结合，比较模型小鼠梗死半暗带区域范围，选取了M1及S1脑区两处点位作为病毒注射位点，通过注射携带星形胶质细胞特异性标记物GFAP的腺相关病毒，充分标记小鼠M1及S1脑区的星形胶质细胞，观察针康结合干预对星形胶质细胞转分化过程的影响。

3.2 病毒注射方法

小鼠大脑皮层组织较薄，进针深度浅，钻孔时应注意暴露完整的硬脑膜，进针前可使用一次性针灸针轻轻戳破硬脑膜，防止玻璃微电极进针时针尖折断，玻璃电极较为精细，针尖直径为10~20 μm，能够更精准、损伤更小的注射病毒，但针尖容易堵住，每次注射前可先少量推注病毒，观察针尖是否通畅。

免疫荧光实验过程中发现，病毒的感染效率与注射时间相关，更有文献报道携带荧光蛋白的腺病毒感染细胞1 d后即可见荧光表达，3 d后能够感染约90%以上的细胞^{［24， 25］}，因此本实验设计21 d模型组及干预组均在造模前3 d注射腺相关病毒，保证病毒感染效率。腺相关病毒体内感染后表达高峰在注射后3~4周^［26］，为确保病毒表达强度，本研究中14 d模型组及干预组在造模前7 d注射病毒。

3.3 抗体标记物的选择

DCX是神经前体细胞和新生神经元的一个标志物，在神经发育早期的迁移和定位过程中发挥重要作用。神经特异性核糖核酸酶（NeuN）是一种常用于标记神经细胞核的抗体，是成熟神经元的标记物。有研究显示，14 dps时能够观察到DCX向NeuN的转变^［27］，且课题组前期研究发现，在连续干预1、3、7、14 d的4个治疗周期中，14 dps时小鼠的运动功能改善最为明显^［15］，而本研究进一步延长干预时间至21 d并未带来显著的额外效益，因此我们推测，在14 dps时，针康结合干预的潜在效益已经完全发挥，此时星形胶质细胞转分化为新生神经元的效率最高，并在继续干预下可维持已有效益，可能在21 dps时观察到新生神经元进一步发育为成熟神经元的现象。因此，本研究采用DCX作为14 d模型组和干预组的神经元标志物，采用NeuN作为21 d模型组和干预组的神经元标志物。

3.4 MCAO小鼠干预方式的选择

3.4.1 针刺方法

针刺疗法是中医传统治疗卒中的方法，对脑卒中患者运动功能改善的疗效确切^［28］，其中，电针刺激具有刺激参数量化、工作效率高和治疗效果稳定的特点，并且疗效优于手针^{［29， 30］}。依据中医学理论，脑卒中形成的病机在于阳化风动、血随气逆、上扰清窍、窍闭神匿、神不导气、脉终瘀阻^［31］。督脉为脑之脉，与脑有直接相关性，脑卒中后偏瘫治疗则以“治痿独取阳明”为理论指导，常循阳明多气多血之经取穴，临床取穴多以手足阳明经为主。本研究针刺处方选用督脉经穴百会以益气升阳、醒脑开窍，辅以偏瘫侧肢体的内关、合谷、足三里、阳陵泉以疏通经络、调和气血。

影响电针效应的参数主要有3个：频率、刺激量 （电流或电压）、波型^［32］。针对电针不同参数在脑缺血损伤中的作用效果，就频率选择而言，采用最多的是2Hz的疏密波，研究表明2Hz电针能明显促进损伤神经的再生和修复，促进损伤神经电生理功能的恢复，且刺激量大的效果更明显^［33］。就刺激强度而言，大量的实验中以刺激对象局部“轻度抖动”为度，小鼠的刺激量一般为1~3 mA范围^［34］。基于本课题组之前的实验基础，本实验以频率2Hz、电流强度1mA、疏密波作为电针治疗小鼠缺血性脑卒中后肢体功能障碍的参数选择。结果发现，与模型组相比，在相同的干预时间内，针康结合组小鼠具有显著的运动功能和感觉功能改善情况。

3.4.2 康复训练方法

啮齿动物的运动实验研究发现，自主跑轮运动和强迫跑台运动是对啮齿类动物运动干预的2种最佳选择^［35］，但强迫跑台运动会升高血清皮质酮，并出现对应激的负适应反应^［36］。而在对啮齿动物实施自主跑轮运动时，仅需在跑轮笼内单独饲养且动物可以自由活动，不干涉其正常夜-昼节律^［37］，不需要外部因素刺激（例如电击或触摸动物），比强迫跑步机运动更类似于自然跑步模式，更容易用于长期研究^［38］，相较于不同实验的跑步参数，小鼠接触轮子的时间更重要^［39］。本实验中，我们先将跑轮置于鼠笼内，小鼠连续适应3d^［39］后再进行造模，干预时仅在电针过程中离开跑轮。在每隔24h记录跑轮活动数据时，我们发现部分小鼠出现了极端值，为了降低极端值对量化数据的潜在影响，后续实验中可以在跑轮上设置制动器来控制这种情况^［40］。

3.5 星形胶质细胞转分化与dMCAO小鼠功能恢复的相关性

星形胶质细胞具有表达神经干细胞或神经前体细胞标记物的能力，并具有神经源性分化的潜能^［41］，已有多项研究表明，在体外和体内实验中，均能利用多种转录因子及小分子化合物成功诱导星形胶质细胞直接转分化为不同类型的成熟神经元^{［42， 43］}，且有研究表明皮层星形胶质细胞参与细胞分裂的过程较多，且增殖能力较强^［44］。我们的研究聚焦于转录因子NeuroD1、Ngn2^{［45， 46］}，Ngn2是bHLH转录因子家族下参与神经元分化的重要因子，是早期的神经元分化信号，通过与DNA特定序列结合来调控基因表达，激活包括NeuroD1在内的一系列下游基因，推动前体细胞向神经元方向分化，在神经发育的早期阶段起主导作用，NeuroD1可进一步推动神经元的成熟和功能完善，在神经再生和修复中起重要作用^［47-50］。本研究的免疫荧光结果发现，对比模型组，针康结合干预能够显著提高转分化效率，并且针康结合组在连续干预的21 d内转分化效率持续升高，结合行为学检测结果发现，小鼠运动功能及感觉功能的改善情况与转分化效率具有中等强度的相关性，提示转分化来的神经元可能代替损伤丢失的神经元，改善神经功能缺损症状和运动功能障碍^［51］。结合最新研究成果，我们推测针康结合可能促使了星形胶质细胞的重编程，为其提供了向神经元发生转分化的环境，通过Ngn2-NeuroD1的信号通路，挽救模型小鼠大脑皮层梗死半暗带区域的神经细胞，从而实现了神经元的内源性再生，并且转分化而来的神经元具有一定的功能活性，可能与已有的神经网络之间建立联系。

本研究中14 d干预组对比21 d干预组检测结果发现，21 d干预组小鼠的运动功能及感觉功能略有改善，但无统计学意义，而免疫荧光结果显示，21 d干预组小鼠有更多的星形胶质细胞转分化为神经元，最新研究发现，星形胶质细胞的转分化在多种影响因素作用下会产生级联反应，大体上在两周左右的时间均能将星形胶质细胞转化为神经元^［42］，在我们的实验中，从14 d到21 d观察到的共染细胞数量增加的现象可能归因于所采用抗体的特异性差异。为了阐明这一点，下一步研究应该考虑在不同的时间点孵育相同的抗体，考虑到DCX仅在神经前体细胞和未成熟神经元中表达^［52］，而星形胶质细胞转录组转变为神经元的转录组的过程较为迅速^［42］，后续实验可增加短周期实验对照组，以更准确地评估转分化的效率。

神经干细胞增殖分化为新生神经元的过程对哺乳动物大脑的发育及功能连接至关重要，在研究过程中不仅要关注新生神经元的数量，了解新生神经元的功能活性对于开发治疗神经退行性疾病和脑损伤的新策略更为意义。因此，现有研究在观察星形胶质细胞转分化可增加神经元数量的同时，更重要的是研究新生神经元能否整合进现有的神经网络并发挥功能，因此，本团队后续将从星形胶质细胞转分化而来的神经元的功能活性展开研究。

参考文献

[1] Shimada IS, LeComte MD, Granger JC, et al. Self-renewal and differentiation of reactive astrocyte-derived neural stem/progenitor cells isolated from the cortical peri-infarct area after stroke[J]. J Neurosci, 2012, 32(23): 7926-40. doi：10.1523/jneurosci.4303-11.2012

[2] Hasel P, Liddelow SA. Astrocytes[J]. Curr Biol, 2021, 31(7): R326-7. doi：10.1016/j.cub.2021.01.056

[3] Filous AR, Silver J. "Targeting astrocytes in CNS injury and disease: a translational research approach"[J]. Prog Neurobiol, 2016, 144: 173-87. doi：10.1016/j.pneurobio.2016.03.009

[4] Okada S, Hara M, Kobayakawa K, et al. Astrocyte reactivity and astrogliosis after spinal cord injury[J]. Neurosci Res, 2018, 126: 39-43. doi：10.1016/j.neures.2017.10.004

[5] Magnusson JP, Göritz C, Tatarishvili J, et al. A latent neurogenic program in astrocytes regulated by Notch signaling in the mouse[J]. Science, 2014, 346(6206): 237-41. doi：10.1126/science.346.6206.237

[6] Gong SQ, Shao H, Cai XY, et al. Astrocyte-derived neuronal transdifferentiation as a therapy for ischemic stroke: advances and challenges[J]. Brain Sci, 2022, 12(9): 1175. doi：10.3390/brainsci12091175

[7] Guo ZY, Zhang L, Wu Z, et al. In vivo direct reprogramming of reactive glial cells into functional neurons after brain injury and in an Alzheimer's disease model[J]. Cell Stem Cell, 2014, 14(2): 188-202. doi：10.1016/j.stem.2013.12.001

[8] 谢小文. 电针治疗联合康复训练在缺血性脑卒中患者步行功能恢复中的应用研究[J]. 中国医学创新, 2024, 21(26): 123-7. doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2024.26.028

[9] Shen Y, Hu LP, Ge J, et al. Effect of electroacupuncture treatment combined with rehabilitation care on serum sirt3 level and motor function in elderly patients with stroke hemiparesis[J]. Medicine (Baltimore), 2023, 102(15): e33403. doi：10.1097/md.0000000000033403

[10] 张文彬, 陈媛丽. 本体感觉训练联合透刺电针疗法治疗脑卒中后偏身肢体麻木的效果及对平衡功能的影响[J]. 临床医学研究与实践, 2024, 9(25): 138-42.

[11] 黄 茂, 唐雨涵, 刘青松. 电针阳明经联合康复训练治疗脑卒中中后期躯体功能障碍的临床观察[J]. 实用医院临床杂志, 2024, 21(2): 87-9. doi：10.3969/j.issn.1672-6170.2024.02.019

[12] Zhang JY, Zhu LW, Tang Q. Electroacupuncture with rehabilitation training for limb spasticity reduction in post-stroke patients: a systematic review and meta-analysis[J]. Top Stroke Rehabil, 2021, 28(5): 340-61. doi：10.1080/10749357.2020.1812938

[13] 刘 娇, 冯晓东. 电针百会、神庭穴配合康复训练治疗脑卒中后认知障碍临床研究[J]. 中医学报, 2013, 28(4): 608-10.

[14] 苏凯奇, 吕 转, 吴明莉, 等. 电针后留针联合认知训练治疗脑卒中后认知功能障碍: 多中心随机对照试验[J]. 中国针灸, 2023, 43(11): 1221-5.

[15] 康赟赟, 唐东宁, 张 健, 等. 电凝法制作C57/BL6J小鼠局灶性脑缺血模型的评价[J]. 南方医科大学学报, 2024, 44(1): 100-7. doi：10.12122/j.issn.1673-4254.2024.01.12

[16] Dong H W. Allen reference atlas: a digital color brain atlas of the C57Black/6J male mouse[M]. Hoboken, N.J: Wiley, 2008. doi：10.1354/vp.45-5-724-a

[17] 中国针灸学会. 实验动物常用穴位名称与定位第3部分: 小鼠[J]. 针刺研究, 2021, 46(5): 445-6.

[18] Bederson JB, Pitts LH, Tsuji M, et al. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination[J]. Stroke, 1986, 17(3): 472-6. doi：10.1161/01.STR.17.3.472

[19] Chen J, Sanberg PR, Li Y, et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats[J]. Stroke, 2001, 32(11): 2682-8. doi：10.1161/hs1101.098367

[20] Gharbawie OA, Gonzalez CLR, Whishaw IQ. Skilled reaching impairments from the lateral frontal cortex component of middle cerebral artery stroke: a qualitative and quantitative comparison to focal motor cortex lesions in rats[J]. Behav Brain Res, 2005, 156(1): 125-37. doi：10.1016/j.bbr.2004.05.015

[21] 孙妍玉, 吴 晋. 神经网络重塑促进脑卒中后功能修复的研究进展[J]. 南京医科大学学报: 自然科学版, 2023, 43(4): 577-81. doi：10.7655/NYDXBNS20230419

[22] Wang C, Liu H, Li K, et al. Tactile modulation of memory and anxiety requires dentate granule cells along the dorsoventral axis[J]. Nat Commun, 2020, 11(1): 6045. doi：10.1038/s41467-020-19874-8

[23] 林嘉滢, 涂舒婷, 林嘉莉, 等. 不同年龄脑卒中患者躯体感觉功能与运动功能相关性及全周期康复思考: 一项多中心横断面研究[J]. 中国全科医学, 2024, 27(23): 2838-45. doi：10.12114/j.issn.1007-9572.2023.0791

[24] 王东军, 郑 煜, 贺 民, 等. 腺病毒介导绿色荧光蛋白转染神经干细胞的实验研究[J]. 军医进修学院学报, 2007, 28(5): 330-2. doi：10.3969/j.issn.1005-1139.2007.05.004

[25] 付 勇, 龚树生, 刘英鹏, 等. 大鼠胚胎神经干细胞分离培养及基因感染研究[J]. 听力学及言语疾病杂志, 2007, 15(5): 379-82, 386, 425. doi：10.3969/j.issn.1006-7299.2007.05.016

[26] Aschauer DF, Kreuz S, Rumpel S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain[J]. PLoS One, 2013, 8(9): e76310. doi：10.1371/journal.pone.0076310

[27] Ceanga M, Keiner S, Grünewald B, et al. Stroke accelerates and uncouples intrinsic and synaptic excitability maturation of mouse hippocampal DCX⁺ adult-born granule cells[J]. J Neurosci, 2019, 39(9): 1755-66. doi：10.1523/JNEUROSCI.3303-17.2018

[28] 郑 薏, 柳维林, 上官豪, 等. 针灸治疗脑卒中患者肢体运动功能障碍疗效的Meta分析[J]. 中国康复医学杂志, 2016, 31(2): 217-21. doi：10.3969/j.issn.1001-1242.2016.02.020

[29] 岳增辉, 李 良, 常小荣, 等. 电针与手针治疗脑卒中痉挛性瘫痪效应差异研究[J]. 中国针灸, 2012, 32(7): 582-6.

[30] 田 亮, 杜小正, 王金海, 等. 手针与电针治疗急性缺血性脑卒中偏瘫的对比研究[J]. 中国针灸, 2016, 36(11): 1121-5. doi：10.13703/j.0255-2930.2016.11.001

[31] 石学敏. “醒脑开窍” 针刺法治疗脑卒中[J]. 中国临床康复, 2003, 7(7): 1057-8. doi：10.3321/j.issn:1673-8225.2003.07.001

[32] 朱 丹, 白洁静, 张晓庆, 等. 电针参数定量化的研究进展[J]. 中国针灸, 2015, 35(5): 525-8. doi：10.13703/j.0255-2930.2015.05.032

[33] 张 莺, 韩德雄, 刘 喆, 等. 基于数据挖掘的脑缺血机制研究中电针参数应用规律分析[J]. 中华中医药学刊, 2017, 35(3): 554-7.

[34] Chang QY, Lin YW, Hsieh CL. Acupuncture and neuroregeneration in ischemic stroke[J]. Neural Regen Res, 2018, 13(4): 573-83. doi：10.4103/1673-5374.230272

[35] Robison LS, Popescu DL, Anderson ME, et al. The effects of volume versus intensity of long-term voluntary exercise on physiology and behavior in C57/Bl6 mice[J]. Physiol Behav, 2018, 194: 218-32. doi：10.1016/j.physbeh.2018.06.002

[36] Yanagita S, Amemiya S, Suzuki S, et al. Effects of spontaneous and forced running on activation of hypothalamic corticotropin-releasing hormone neurons in rats[J]. Life Sci, 2007, 80(4): 356-63. doi：10.1016/j.lfs.2006.09.027

[37] Garland T Jr, Schutz H, Chappell MA, et al. The biological control of voluntary exercise, spontaneous physical activity and daily energy expenditure in relation to obesity: human and rodent perspectives[J]. J Exp Biol, 2011, 214(Pt 2): 206-29. doi：10.1242/jeb.048397

[38] Lee DH, Cao D, Moon Y, et al. Enhancement of motor functional recovery in thoracic spinal cord injury: voluntary wheel running versus forced treadmill exercise[J]. Neural Regen Res, 2025, 20(3): 836-44. doi：10.4103/nrr.nrr-d-23-01585

[39] Manzanares G, Brito-da-Silva G, Gandra PG. Voluntary wheel running: patterns and physiological effects in mice[J]. Braz J Med Biol Res, 2018, 52(1): e7830. doi：10.1590/1414-431x20187830

[40] Alamri FF, Al Shoyaib A, Syeara N, et al. Delayed atomoxetine or fluoxetine treatment coupled with limited voluntary running promotes motor recovery in mice after ischemic stroke[J]. Neural Regen Res, 2021, 16(7): 1244-51. doi：10.4103/1673-5374.301031

[41] Huajuan T, Xuemei C, Chenghui N, et al. Regulation of transcription factors in astrocyte-to-neuron transdifferentiation[J]. Chinese Journal of Neuromedicine, 2018, 17(10): 1059-1062.

[42] Xu L, Xiang Z Q, Guo Y W, et al. Enhancing NeuroD1 Expression to Convert Lineage-Traced Astrocytes into Neurons[A]. 2022.

[43] 铁金杉, 刘 垚, 陈绍春. 星形胶质细胞-神经元转化体内诱导研究进展[J]. 昆明医科大学学报, 2021, 42(3): 140-4. doi：10.12259/j.issn.2095-610X.S20210333

[44] 曾 鹏, 花秋红, 石昌杰, 等. 小鼠不同脑区星形胶质细胞小分子诱导转分化和基因表达差异的研究[J]. 中国细胞生物学学报, 2020, 42(9): 1551-9. doi：10.11844/cjcb.2020.09.0006

[45] Lu JF, Bradley RA, Zhang SC. Turning reactive Glia into functional neurons in the brain[J]. Cell Stem Cell, 2014, 14(2): 133-4. doi：10.1016/j.stem.2014.01.010

[46] Talifu Z, Zhang CJ, Xu X, et al. Neuronal repair after spinal cord injury by in vivo astrocyte reprogramming mediated by the overexpression of NeuroD1 and Neurogenin-2[J]. Biol Res, 2024, 57(1): 53. doi：10.1186/s40659-024-00534-w

[47] Tan ZJ, Qin SY, Yuan YM, et al. NOTCH1 signaling regulates the latent neurogenic program in adult reactive astrocytes after spinal cord injury[J]. Theranostics, 2022, 12(10): 4548-63. doi：10.7150/thno.71378

[48] Imayoshi I, Kageyama R. bHLH factors in self-renewal, multipotency, and fate choice of neural progenitor cells[J]. Neuron, 2014, 82(1): 9-23. doi：10.1016/j.neuron.2014.03.018

[49] Puls B, Ding Y, Zhang FY, et al. Regeneration of functional neurons after spinal cord injury via in situ NeuroD1-mediated astrocyte-to-neuron conversion[J]. Front Cell Dev Biol, 2020, 8: 591883. doi：10.3389/fcell.2020.591883

[50] Livingston JM, Lee TT, Enbar T, et al. Ectopic expression of Neurod1 is sufficient for functional recovery following a sensory-motor cortical stroke[J]. Biomedicines, 2024, 12(3): 663. doi：10.3390/biomedicines12030663

[51] Li YQ, Li PF, Tao Q, et al. Role and limitation of cell therapy in treating neurological diseases[J]. Ibrain, 2024, 10(1): 93-105. doi：10.1002/ibra.12152

[52] Li WL, Mandeville ET, Durán-Laforet V, et al. Endothelial cells regulate astrocyte to neural progenitor cell trans-differentiation in a mouse model of stroke[J]. Nat Commun, 2022, 13(1): 7812. doi：10.1038/s41467-022-35498-6

基金资助

RIGHTS & PERMISSIONS

版权所有©《南方医科大学学报》编辑部2021