雷氏大疣蛛多肽毒素组分通过激活促凋亡通路和协同作用抑制癌细胞增殖

The peptide toxin components and nucleotide metabolites in Macrothele raveni venom synergistically inhibit cancer cell proliferation by activating the pro-apoptotic pathways

摘要

目的 研究雷氏大疣蛛毒素对癌细胞增殖抑制的选择性和有效组分。 方法 采用CCK-8法检测共培养48 h后雷氏大疣蛛毒素对癌细胞增殖的影响；应用流式细胞术检测癌细胞凋亡率；采用caspase试剂盒检测癌细胞内caspase-8和9的表达水平；通过凝胶过滤层析和高效液相色谱（HPLC）将雷氏大疣蛛粗毒分为蛋白质组分、多肽组分、小分子化合物组分3个部分；通过蛋白质组学对蛋白质和多肽组分进行鉴定；采用核磁共振、质谱结合HPLC解析小分子化合物组分中各物质的结构。 结果 雷氏大疣蛛粗毒对乳腺癌MCF7和鼻咽癌（SUNE1、HONE1）细胞表现出很强的浓度依赖性增殖抑制作用，半抑制浓度（IC₅₀）分别为2.14 ±0.29、1.57±0.14、2.85±0.15 µg/mL；对多种胃癌和肠癌细胞系表现出较强的增殖抑制作用，对胃癌HGC27细胞的IC₅₀为3.02±0.27 µg/mL，对肠癌SW620细胞的IC₅₀为3.02±0.28 µg/mL。选用MCF7细胞来研究增殖抑制机制和筛选有效组分，发现粗毒可能通过激活caspase-8介导的信号通路诱导MCF7细胞凋亡。粗毒中蛋白质组分对MCF7细胞的增殖抑制作用很弱，10 µg/mL浓度仅抑制12.1%±1.9%。多肽组分抑制作用较强，IC₅₀为6.41±0.31 µg/mL。多肽组分相对分子质量集中在10 000左右，主要为与巨型上户蛛毒素同源的多肽；小分子组分未表现出增殖抑制作用，主要为核苷酸代谢物。多肽组分和小分子组分质量比4∶1混合抑制作用明显增强。 结论 雷氏大疣蛛毒素对不同癌细胞的抑制活性有很大差异，发挥对癌细胞增殖抑制作用的组分为多肽组分，可能与核苷酸代谢物存在协同作用。

Abstract

Objective To evaluate the inhibitory effect of Macrothele raveni crude venom against proliferation of different cancer cells and identify the active components in the venom. Methods Different cancer cell lines were treated with different concentrations of Macrothele raveni venom for 48 h, and cell proliferation and the half-maximal inhibitory concentrations (IC₅₀) of the venom were assessed with CCK-8 assay. The apoptosis rate of breast cancer MCF7 cells following the treatment was analyzed with flow cytometry, and the changes in cellular caspase-8 and caspase-9 expressions were detected. The crude venom was separated into protein, peptide, and small-molecule compound fractions using gel filtration chromatography and high-performance liquid chromatography (HPLC). The protein and peptide components were identified using proteomics analysis, and small-molecule compounds were structurally characterized using nuclear magnetic resonance (NMR), mass spectrometry (MS), and HPLC. Results The crude venom exhibited strong concentration-dependent inhibitory effects on proliferation of MCF7 cells and nasopharyngeal carcinoma SUNE1 and HONE1 cells (IC₅₀ of 2.14±0.29, 1.57±0.14, and 2.85±0.15 µg/mL, respectively), with less potent inhibitory effects in gastric cancer HGC27 cells and colorectal cancer SW620 cells (IC₅₀ of 3.02±0.27 and 3.02±0.28 µg/mL, respectively). The crude venom significantly promoted MCF7 cell apoptosis likely via the caspase 8 signaling pathway. The protein fraction from the crude venom showed a weak inhibitory effect in MCF7 cells, whereas the peptide fraction exhibited a much stronger inhibitory effect (IC₅₀ of 6.41±0.31 µg/mL). The peptides in the peptide fraction, with relative molecular mass around 10 000, were homologous to those found in Macrothele gigas venom. The small-molecule fraction consisted mainly of nucleotide metabolites without obvious inhibitory effects in MCF7 cells, but its combination with the peptide fraction showed significantly enhanced inhibitory activity. Conclusion The inhibitory effects of Macrothele raveni venom, which vary significantly across different cancer cell lines, are attributed primarily to its peptide components, which may act synergistically with the nucleotide metabolites.

Graphical abstract

关键词

雷氏大疣蛛 / 多肽毒素 / 癌细胞 / 抗增殖作用

Key words

Macrothele raveni / peptide toxins / cancer cells / anti-proliferation

目前从天然来源筛选出的抗肿瘤药物主要以小分子化合物为主，这类化合物因其结构多样性、良好的生物利用度，在肿瘤治疗中占据重要地位。但同时也存在特异性不高、副作用大的缺点。动物多肽毒素因其靶向性强、副作用相对小的优点越来越受到广泛关注。目前已有文献报道在蛇毒、蜂毒和蝎毒等动物毒液中发现了一些具有抗肿瘤作用的多肽和蛋白质，主要包括来自蛇毒的酶类蛋白^{［1， 2］}、抗血管生成多肽^{［3， 4］}，以及来自蝎毒和蜂毒的离子通道调节多肽、免疫调节多肽、细胞毒性多肽等^{［5， 6］}。蜘蛛毒素的抗肿瘤作用目前研究相对较少，主要报道的有：穴居狼蛛多肽毒素Lycosin-I通过膜裂解、促进细胞凋亡、铁死亡等机制在白血病治疗方面展现出卓越的潜力^［7］。智利玫瑰狼蛛毒素多肽GsMTx-4能选择性抑制机械敏感性离子通道，从而抑制骨肉瘤细胞迁移^［8］。蜘蛛毒液中主要成分为多肽和蛋白质，另外含有少量的无机盐和有机小分子化合物，具有高度的分子多样性和特异性，是丰富的天然药物资源库，在开发抗肿瘤药物方面具有很大的潜力。

雷氏大疣蛛是一种属于六疣蛛科的大型穴居蜘蛛，主要分布于中国南方及东南亚地区。其毒液具有较强的癌细胞增殖抑制能力。已有研究报道雷氏大疣蛛毒素可调控肺癌^［9］、肝癌^［10］、白血病^［11］等癌细胞的增殖或凋亡，从而发挥抗肿瘤作用。但雷氏大疣蛛毒素对大部分癌细胞的作用和机制仍不清楚，且主要是应用粗毒开展研究。本文将全面研究雷氏大疣蛛毒素对各种癌细胞的增殖抑制作用，并挖掘其中发挥抗肿瘤作用的组分进行分析和鉴定，为更好研究该毒液的抗肿瘤作用及机制提供重要依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

C57BL/6J雄性6~8周龄小鼠，购买于南方医科大学实验动物中心。饲养温度18~25 ℃，湿度40%~50%，光照周期为每12 h进行明暗交替，自由饮水进食。实验动物处理遵守南方医科大学实验动物伦理福利制定与实施（伦理批号：L2016138）。

1.2.2 药物和试剂

本研究中涉及的所有细胞系均购于中科院上海细胞所，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基进行培养，细胞生长至对数期后生长状态良好时进行实验。RPMI 1640培养液、胎牛血清（Gibco）；CCK-8试剂盒（Dojindo）；交联葡聚糖G-75（Waters）；YMC-Pack-ODS-A色谱柱（YMC）；蛋白marker（ThermoFisher）；细胞凋亡检测试剂盒和caspase活性检测试剂盒（武汉伊莱瑞特生物公司）；雷氏大疣蛛毒素（南方蜘蛛养殖研究所）。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8法检测细胞增殖

取对数生长期细胞，以（5~8）×10³/孔细胞接种于96孔板，置于37 ℃、5% CO₂细胞培养箱中培养24 h。雷氏大疣蛛粗毒、5 min蛋白质组分、10 min多肽组分用双蒸水配成高浓度储液，实验设空白对照组和溶剂对照组及不同浓度药物组，每一浓度设3个复孔。加入上述药物后细胞置于培养箱中继续培养，分别于培养48 h后取出96孔板，移除培养液，加入用培养基配制的10% CCK-8溶液继续孵育30 min~4 h，时间以所测细胞密度而定，密度越大，所需时间越短。将96孔板从细胞培养箱中取出，用锡纸包好避光，酶标仪测定吸收度（A_{450 nm}）。计算相对于阴性对照的生长抑制率，并绘制细胞的生长曲线，求出细胞生长抑制50%时的药物浓度（IC₅₀）。

1.2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡率

用12孔板培养MCF7细胞，达到80%汇合度后，加入雷氏大疣蛛毒素培养箱孵育24 h。小心吸取细胞培养液保存备用。细胞用PBS洗涤后，加入适量不含EDTA的胰酶消化液消化细胞。加入前面收集的培养液，轻轻吹打细胞，制成单细胞悬液，1000 g离心5 min，弃去上清。加入1 mL预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀，1000 g离心5 min，弃去上清，将细胞沉淀重悬于Binding Buffer中，调整细胞浓度至1×10⁶/mL。每次实验需要设置空白组（不加染料）、单染Annexin V-APC组、单染DAPI组作为对照，实验组采用Annexin V-APC和DAPI双染。取500 µL细胞悬液，分别加入5 μL Annexin APC和5 μL DAPI，混匀，室温避光孵育15 min。随即使用流式细胞仪进行检测。

1.2.3 Caspase活性检测

培养的MCF7细胞加入雷氏大疣蛛毒素处理24 h。收集细胞，4 ℃、600 g离心5 min，小心吸除上清，用PBS洗涤1次。同前吸尽上清后，按照每100万细胞加入100 μL裂解液的比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解30 min。然后将裂解后的溶液在4 ℃、11 000 g离心15 min，将上清转移到冰浴预冷的离心管中，用Bradford法测定蛋白浓度。随后按照caspase活性检测试剂盒说明书测定caspase酶活性。

1.2.4 凝胶过滤层析和HPLC纯化

将毒素冻干粉末溶于双蒸水中，浓度为10 mg/mL，14 000 r/min离心10 min，取上清液用0.45 μm滤膜过滤。通过中压制备色谱仪（BUCHI）进行分离，选用交联葡聚糖凝胶G-75柱，用双蒸水洗脱，收集洗脱峰浓缩冻干。样品溶液经电泳上样缓冲液稀释后，通过12.5% SDS-PAGE结合考马氏亮蓝染色进行相对分子质量测定。通过安捷伦HPLC1200高效液相色谱仪对蜘蛛毒素小分子组分进行分离纯化，选取YMC-Pack-ODS-A（250×4.6 mm，S-5 µm，12 nm）色谱柱。分离小分子化合物的梯度为乙腈浓度在10 min内从5%递增到10%。

1.2.5 蛋白质组学分析

取100 µg上述蛋白和多肽洗脱峰组分，用50 mmol/L碳酸氢铵将各组分补充体积至150 µL，加入浓度为5 mmol/L的二硫苏糖醇溶液，56 ℃反应30 min进行蛋白质还原，冷却至室温后再加入浓度为10 mmol/L的碘乙酰胺溶液，室温避光反应30 min进行蛋白质烷基化。经还原烷基化后的蛋白质样品加入2.5 µg胰蛋白酶，封口膜封口，37 ℃孵育4~6 h后补加2.5 µg胰蛋白酶，封口膜封口，37 ℃消化过夜。酶解后的肽段样品加入0.1%甲酸使溶液酸化，终止酶解，室温16 000 g离心5 min，取上清，上样至C18除盐柱，用0.1%甲酸洗脱除盐后，再用70%乙腈（含0.1%甲酸）洗脱，收集洗脱液，经浓缩干燥后上样至液相色谱-串联质谱进行分析。物种数据库选择亲缘关系比较接近的节肢动物门。

1.2.6 小分子化合物结构解析

称取5 mg纯度大于95%的样品，加入0.6 mL重水溶解，离心后取上清0.5 mL转移至核磁管，经600 M超导核磁共振波谱仪采集一维核磁共振谱图¹H NMR、¹³C NMR和³¹P NMR，¹³C NMR数据输入微谱数据库进行检索，检索到的化合物经600 M超导核磁共振波谱仪采集一维核磁共振谱图¹H NMR和¹³C NMR，与样品的一维核磁共振谱图进行比对验证。小分子化合物的相对分子质量通过三重四极杆液质联用仪进行测定，采用正离子和负离子两种模式。

1.2.7 动物急性毒性实验

参照寇氏krber法，6~8周龄小鼠10只/组，体质量20~25 g，按每10 g体质量给药0.1 mL进行腹腔注射雷氏大疣蛛粗毒，对照组注射生理盐水。组间剂量比值为1∶0.8。观察1周并记录小鼠中毒表现和死亡情况。

1.2.8 统计学分析

采用SPSS20.0统计软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，每组数据都是独立重复3次，两组间差异比较采用t检验，多组间差异比较采用单因素方差分析，方差齐性采用LSD法进行组间的多重比较。非参数分布的数据两组间比较采用Mann-Whitney U检验，多组间比较则采用Welth法，并用Dunnett's T₃法进行组间多重比较，以P<0.05为差异有统计学有意义。药物对肿瘤细胞增殖抑制的IC₅₀通过Hill方程拟合浓效曲线计算得出，Hill方程：y=1-（1-f_max）/｛1+［（x） /IC₅₀］^nH｝，式中x是药物浓度，nH是Hill系数（斜率参数）。

2 结果

2.1 雷氏大疣蛛粗毒对癌细胞增殖抑制作用的量效关系

雷氏大疣蛛粗毒对检测的30种癌细胞都表现出不同程度的浓度依赖性增殖抑制作用（图1），其中对乳腺癌MCF7和鼻咽癌细胞（SUNE1、HONE1）表现出很强的增殖抑制作用，IC₅₀分别为2.14±0.29、1.57±0.14、2.85±0.15 µg/mL；对多种胃癌和肠癌细胞表现出较强的增殖抑制作用，对胃癌HGC27细胞的IC₅₀为3.02±0.27 µg/mL，对肠癌SW620细胞的IC₅₀为3.02±0.28 µg/mL；对肺癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、人黑色素瘤、子宫内膜癌、神经胶质瘤细胞敏感性较低，对宫颈癌174T细胞、肝癌7402细胞、神经胶质瘤U87细胞、人口腔表皮样癌KB细胞的IC₅₀分别为25.07±0.95、19.15±0.46、19.02±0.19、19.05±0.34 µg/mL（图2）。

2.2 雷氏大疣蛛粗毒诱导MCF7细胞凋亡及激活caspase 8

雷氏大疣蛛粗毒以浓度依赖性方式显著增加MCF7细胞凋亡的百分比，5和10 µg/mL粗毒作用MCF7细胞24 h后，早期凋亡细胞百分比从40.32%增加到48.39%，晚期凋亡细胞百分比从11.32%增加到29.45%，总凋亡细胞比例分别升高至51.64%和77.84%，而溶剂对照组仅显示6.03%的凋亡细胞（图3A）。

雷氏大疣蛛粗毒作用24 h显著激活了MCF7细胞中的caspase-8，而caspase-9活性未受影响。MCF7细胞经5 µg/mL和10 µg/mL粗毒作用24 h后，caspase-8活性分别增加2.8倍和2.5倍（P<0.001，图3B）。

2.3 雷氏大疣蛛毒素的纯化

通过凝胶过滤层析对雷氏大疣蛛粗毒进行分离，得到2个主要洗脱峰，分别为保留时间5 min和10 min的洗脱峰（图4A）。用SDS-PAGE进行相对分子质量测定，加样孔1对应的是粗毒样品，2对应的是5 min组分，3、4、5对应的是不同批次的10 min组分。5 min组分主要为相对分子质量集中在40 000~100 000的蛋白质，10 min组分主要为相对分子质量集中在10 000左右的多肽，不同批次之间的10 min组分差异很小，主要是第3、4对应的批次中70 000蛋白质的含量相对第5对应的批次稍有增高（图4B）。通过HPLC对雷氏大疣蛛粗毒进行分离，得到保留时间10 min前出峰的为小分子化合物组分，标记a和b的为2个主峰（图4C）。

2.4 雷氏大疣蛛毒素各组分对MCF7细胞的增殖抑制作用

检测上述组分对MCF7细胞的增殖抑制作用，发现蛋白质组分抑制作用很弱，10 µg/mL浓度仅抑制12.1%±1.9%；多肽组分抑制作用较强，半抑制浓度为6.41±0.31 µg/mL；未发现小分子化合物组分对MCF7细胞存在增殖抑制作用（图5A）。不同批次之间的10 min组分对MCF7细胞的增殖抑制作用差异无统计学意义（P>0.05，图5B），半抑制浓度为6.25~6.78 µg/mL。10 min组分对HEK-293细胞的增殖抑制作用较弱，半抑制浓度为35.9±1.78 µg/mL（图5C）。将HEK-293细胞定义为正常细胞，可得出10 min组分对MCF7细胞的选择性指数为5.6。多肽组分对MCF7细胞的增殖抑制作用低于粗毒。将多肽组分与蛋白质或小分子化合物分别混合检测其对癌细胞的增殖抑制作用，结果显示，多肽组分和蛋白质组分4∶1质量比混合后在10和20 µg/mL浓度下抑制作用明显降低（P<0.05），但多肽组分和小分子化合物组分4∶1质量比混合在5 µg/mL浓度下增殖抑制作用明显增强（P<0.01，图5D）。

2.5 小分子化合物促进多肽诱导的MCF7细胞凋亡

7.5 µg/mL毒素样品处理MCF7细胞24 h后，多肽组细胞凋亡的百分比为29.61%，多肽与小分子组合组细胞凋亡的百分比升高为43.53%（图6A）。检测毒素样品处理后MCF7细胞中caspase活性，结果显示，在总浓度均为7.5和15 µg/mL的浓度下，多肽处理组caspase-8活性明显增强（P<0.001）， caspase-9活性未见明显变化。在7.5 µg/mL的浓度下，与多肽组比较，小分子化合物与多肽组合使caspase-8和9的活性分别增强1.27和1.58倍（P<0.001，图6B）。

2.6 蛋白质组学分析

蛋白质组学分析结果显示，保留时间为5 min的蛋白质组分主要为相对分子质量大的血蓝蛋白（表1）；保留时间为10 min的多肽组分主要为巨型上户蜘蛛毒素多肽（表2）。丰度相关的#PSMs值最高为多肽U4-theraphotoxin-Hs1a（HWTX-IX），后续几种丰度和可信度高的均为巨型上户蜘蛛毒素多肽。RTX-VII和Raventoxin-1为雷氏大疣蛛多肽毒素。丰度较低的theraphotoxin为虎纹捕鸟蛛毒素多肽。

2.7 小分子化合物组分鉴定

HPLC图谱中a和b两个主峰经质谱鉴定相对分子质量为322.98、348.3（图7C），核磁谱解析结合微谱数据库检索为单磷酸尿苷和单磷酸腺苷（图7A、B，表3），磷谱解析确定a和b两个主峰都含有P原子（图7A、B）。小分子化合物HPLC图谱中还存在少量小的洗脱峰，质谱鉴定得到正离子模式下质谱峰相对分子质量为104.12、137.07，负离子模式下质谱峰分子量为244.01、267.02、347.01、362.02、367.22（图7C）。荧光检测器检测发现小分子组分中存在与标准品GABA出峰时间完全一致的物质。根据质谱结果结合HPLC洗脱保留时间分析推测雷氏大疣蛛粗毒中还存在GABA、次黄嘌呤、肌苷、单磷酸肌苷、单磷酸鸟苷等物质（表4）。

2.8 动物急性毒性实验

雷氏大疣蛛粗毒注射到小鼠腹腔后，2 mg/kg及以下剂量组给药后基本未见毒性反应；2~4 mg/kg剂量组在给药后1 h内出现缩成一团和轻微抽搐症状，症状随后逐渐缓解并恢复正常；4 mg/kg以上剂量组有部分鼠出现明显中毒反应，表现为站立僵住、瘫软等症状，并出现中毒死亡现象，表现为四肢抽搐频率先慢后快，呼吸逐渐急促伴随胸腹部剧烈抽搐，最后心跳停止。较低剂量组小鼠死亡时间在给药2 h以后，较高剂量组小鼠死亡多发生在给药后1 h内。雷氏大疣蛛粗毒经腹腔注射对小鼠的半致死量为5.63 mg/kg。

3 讨论

本研究发现，雷氏大疣蛛毒液对癌细胞表现出较强的增殖抑制作用，且对各种癌细胞的敏感性不同。药物对不同癌细胞选择性差异的影响因素非常复杂，包括癌细胞本身的异质性和药物作用机制的复杂性等^{［12，13］}。癌细胞膜上表达受体的类型、靶标表达水平和活性的差异等是药物对癌细胞选择性差异的核心因素^［14］。本研究发现雷氏大疣蛛毒素对乳腺癌、鼻咽癌、胃癌等肿瘤类型具有高敏感性，为拓展蜘蛛毒素的抗肿瘤应用提供了新依据。此外，抗肿瘤药物研发过程中一个需要考虑的因素是药物对癌细胞和正常细胞的选择性。进一步比较发现，雷氏大疣蛛毒素对非癌HEK-293细胞的增殖抑制作用较低，与以往研究中其对白血病细胞的抑制作用显著高于正常淋巴细胞相符^［11］，显示出良好的癌细胞选择性。这一选择性可能与癌细胞特有的膜结构特征（如电荷分布、膜流动性及表面积）密切相关^［15-17］。根据药物的敏感性研究雷氏大疣蛛毒素对高敏感性肿瘤类型的作用及机制，可为将来开发高效低毒的抗癌药物提供可能。

细胞凋亡主要有两条途径：一是膜受体通路，蛋白酶caspase-8作为经典的外源凋亡信号启动子，通过死亡受体与其同源配体的连接来启动细胞凋亡。另一条是线粒体凋亡通路，线粒体释放的细胞色素与凋亡相关因子1（Apaf-1）结合，形成多聚体，激活启动型caspase-9，再激活下游的效应型caspase，从而诱导细胞凋亡^{［18， 19］}。本研究发现雷氏大疣蛛粗毒通过激活caspase-8，而非caspase-9，诱导乳腺癌MCF7细胞凋亡，表明粗毒主要通过膜受体介导的外源性通路来诱导细胞凋亡，其机制可能与以往研究报道的某些蛋白通过激活Fas、DR4/DR5、TNFR1等死亡受体诱导外源性凋亡途径类似^［20］，但雷氏大疣蛛毒素是否作用于特定死亡受体仍需进一步研究。此外，Kv1通道，尤其是Kv1.3亚型，在肿瘤细胞凋亡中扮演着复杂且重要的角色^［21］。目前已有多个Kv1.3特异性抑制剂在临床前研究中显示出良好的抗肿瘤效果^［22］。以往研究发现雷氏大疣蛛多肽毒素MrⅧ通过门控调制的方式作用于Kv1通道^［23］。雷氏大疣蛛多肽毒素是否通过靶向Kv1.3通道诱导肿瘤细胞凋亡值得在后续研究中予以探究。

本研究发现，雷氏大疣蛛粗毒中发挥抗肿瘤作用的为多肽组分。丰度最高的HWTX-IX，是一种富含甘氨酸、结构新颖的多肽类型^［24］。转录组学测序发现雷氏大疣蛛与巨型上户蜘蛛中的毒素多肽具有一定的同源性^［25］。巨型上户蜘蛛性情凶猛，其毒素功能研究较少，目前报道的主要为一些具有昆虫活性和神经活性的毒素多肽，尚无抗肿瘤方面的报道^［26］，其中鉴定的多肽结构为富含半胱氨酸的新的结构类型^［27］。蜘蛛毒素中报道的抗肿瘤多肽Lycosin-I为线性多肽，α-螺旋结构；GsMTx-4为具有疏水斑块的胱氨酸结模体^［28］。雷氏大疣蛛粗毒中具有抗肿瘤作用的多肽组分可能为一类具有新的结构特征的多肽分子，其研究将为抗肿瘤药物的研发提供全新的可能。

药物协同作用在抗肿瘤药物研究中广受关注，在增强疗效、减少副作用和延缓耐药性等方面有重要意义^{［29， 30］}。本研究发现雷氏大疣蛛粗毒中的小分子化合物（AMP、UMP等核苷酸代谢物）与多肽组分存在协同作用。雷氏大疣蛛粗毒中的核苷酸代谢物本身不具有抗肿瘤活性，但与多肽组合后在较低浓度下可显著增强其对MCF7细胞的增殖抑制作用，并在较低浓度下增强caspase-9的活性，即两者组合激活了内源性的线粒体凋亡通路。已有研究表明，一些核苷酸类似物，如5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、吉西他滨、6-巯基嘌呤等，可通过干扰DNA合成或细胞周期阻滞发挥抗肿瘤作用^{［31， 32］}。本研究中分离的的小分子化合物虽然结构上与上述药物类似，但其功能更可能体现在经多肽的协助进入胞内，与Bcl-2蛋白结合，解除其对线粒体膜通透性的抑制，激活内源性凋亡通路。上述发现为抗肿瘤药物研发提供了新思路：与传统的单靶点药物相比，天然毒素中多组分协同作用可能提供更高效、更特异的抗肿瘤策略。未来研究将着重解析多肽与小分子协同作用的机制，并评估其在动物模型中的治疗效果。

综上所述，本研究全面探讨了雷氏大疣蛛粗毒对多种癌细胞的增殖抑制作用，发现了高敏感的癌细胞类型。发现粗毒中发挥抗肿瘤作用的主要活性成分为多肽类物质，其与粗毒中的核苷酸代谢物存在协同作用。这些发现可能为抗肿瘤药物研发提供新的思路，为发现新的抗肿瘤药物和新的机制提供可能。

参考文献

[1] Tan KK, Bay BH, Gopalakrishnakone P. L-amino acid oxidase from snake venom and its anticancer potential[J]. Toxicon, 2018, 144: 7-13. doi：10.1016/j.toxicon.2018.01.015

[2] Ullah A. Structure-function studies and mechanism of action of snake venom L-amino acid oxidases[J]. Front Pharmacol, 2020, 11: 110. doi：10.3389/fphar.2020.00110

[3] Akhtar B, Muhammad F, Sharif A, et al. Mechanistic insights of snake venom disintegrins in cancer treatment[J]. Eur J Pharmacol, 2021, 899: 174022. doi：10.1016/j.ejphar.2021.174022

[4] Schönthal AH, Swenson SD, Chen TC, et al. Preclinical studies of a novel snake venom-derived recombinant disintegrin with antitumor activity: a review[J]. Biochem Pharmacol, 2020, 181: 114149. doi：10.1016/j.bcp.2020.114149

[5] Dardevet L, Rani D, Aziz TA, et al. Chlorotoxin: a helpful natural scorpion peptide to diagnose glioma and fight tumor invasion[J]. Toxins (Basel), 2015, 7(4): 1079-101. doi：10.3390/toxins7041079

[6] Duan XF, Zou HY, Yang JZ, et al. Melittin-incorporated nanomedicines for enhanced cancer immunotherapy[J]. J Control Release, 2024, 375: 285-99. doi：10.1016/j.jconrel.2024.08.047

[7] Zhang P, Luo W, Zhang ZX, et al. A lipid-sensitive spider peptide toxin exhibits selective anti-leukemia efficacy through multimodal mechanisms[J]. Adv Sci (Weinh), 2024, 11(32): e2404937. doi：10.1002/advs.202404937

[8] Buglione A, Alloisio G, Ciaccio C, et al. GsMTx-4 venom toxin antagonizes biophysical modulation of metastatic traits in human osteosarcoma cells[J]. Eur J Cell Biol, 2025, 104(1): 151469. doi：10.1016/j.ejcb.2024.151469

[9] 胡增祥, 杜昱蕾, 刘全喜, 等. 雷氏大疣蛛蜘蛛毒素对人肺癌细胞A549增殖的影响[J]. 中国肺癌杂志, 2010, 13(10): 933-6. doi：10.3779/j.issn.1009-3419.2010.10.02

[10] 高 莉, 沈金宝, 孙 捷, 等. 雷氏大疣蛛毒液对人肝癌HepG2细胞p21基因表达的影响[J]. 生理学报, 2007, 59(1): 58-62. doi：10.3321/j.issn:0371-0874.2007.01.010

[11] Liu ZH, Zhao Y, Li J, et al. The venom of the spider Macrothele raveni induces apoptosis in the myelogenous leukemia K562 cell line[J]. Leuk Res, 2012, 36(8): 1063-6. doi：10.1016/j.leukres.2012.02.025

[12] Gottlieb B, Trifiro M, Batist G. Why tumor genetic heterogeneity may require rethinking cancer genesis and treatment[J]. Trends Cancer, 2021, 7(5): 400-9. doi：10.1016/j.trecan.2020.10.013

[13] Fruman DA, Chiu H, Hopkins BD, et al. The PI3K pathway in human disease[J]. Cell, 2017, 170(4): 605-35. doi：10.1016/j.cell.2017.07.029

[14] Bi SY, Chen W, Fang YY, et al. Cancer cell-selective membrane receptor clustering driven by VEGF secretion for in vivo therapy[J]. J Am Chem Soc, 2023, 145(9): 5041-52. doi：10.1021/jacs.2c10428

[15] Dobrzyńska I, Szachowicz-Petelska B, Sulkowski S, et al. Changes in electric charge and phospholipids composition in human colorectal cancer cells[J]. Mol Cell Biochem, 2005, 276(1): 113-9. doi：10.1007/s11010-005-3557-3

[16] Chang Y, Chen JY, Yang J, et al. Targeting the Cell Membrane by Charge-Reversal Amphiphilic Pillar[5]arene for the Selective Killing of Cancer Cells[J]. ACS Appl Mater Interfaces, 2019, 11(42): 38497-502. doi：10.1021/acsami.9b13492

[17] Li XL, Chen ZW, Li YM, et al. Optical tweezers study of membrane fluidity in small cell lung cancer cells[J]. Opt Express, 2021, 29(8): 11976. doi：10.1364/oe.420288

[18] Sahoo G, Samal D, Khandayataray P, et al. A review on caspases: key regulators of biological activities and apoptosis[J]. Mol Neurobiol, 2023, 60(10): 5805-37. doi：10.1007/s12035-023-03433-5

[19] Yuan JY, Ofengeim D. A guide to cell death pathways[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2024, 25(5): 379-95. doi：10.1038/s41580-023-00689-6

[20] Ramaswamy M, Efimova EV, Martinez O, et al. IG20 (MADD splice variant-5), a proapoptotic protein, interacts with DR4/DR5 and enhances TRAIL-induced apoptosis by increasing recruitment of FADD and caspase-8 to the DISC[J]. Oncogene, 2004, 23(36): 6083-94. doi：10.1038/sj.onc.1207804

[21] Capera J, Pérez-Verdaguer M, Peruzzo R, et al. A novel mitochondrial Kv1.3-caveolin axis controls cell survival and apoptosis[J]. eLife, 2021, 10: e69099. doi：10.7554/elife.69099

[22] Teisseyre A, Chmielarz M, Uryga A, et al. Co-application of statin and flavonoids as an effective strategy to reduce the activity of voltage-gated potassium channels Kv1.3 and induce apoptosis in human leukemic T cell line jurkat[J]. Molecules, 2022, 27(10): 3227. doi：10.3390/molecules27103227

[23] Xiao Z, You X, Chen MZ, et al. A novel spider toxin as a selective antagonist of the Kv1 subfamily of voltage-gated potassium channels through gating modulation[J]. J Biol Chem, 2025, 301(4): 108341. doi：10.1016/j.jbc.2025.108341

[24] Liang SP. An overview of peptide toxins from the venom of the Chinese bird spider Selenocosmia huwena Wang [=Ornithoctonus huwena (Wang)[J]. Toxicon, 2004, 43(5): 575-85. doi：10.1016/j.toxicon.2004.02.005

[25] Xiao X, Luo XQ, Huang CL, et al. Transcriptome analysis reveals the peptide toxins diversity of Macrothele palpator venom[J]. Int J Biol Macromol, 2023, 253(Pt 1): 126577. doi：10.1016/j.ijbiomac.2023.126577

[26] Corzo G, Gilles N, Satake H, et al. Distinct primary structures of the major peptide toxins from the venom of the spider Macrothele gigas that bind to sites 3 and 4 in the sodium channel[J]. FEBS Lett, 2003, 547(1/2/3): 43-50. doi：10.1016/s0014-5793(03)00666-5

[27] Titaux-Delgado G, Carrillo E, Mendoza A, et al. Successful refolding and NMR structure of rMagi3: a disulfide-rich insecticidal spider toxin[J]. Protein Sci, 2018, 27(3): 692-701. doi：10.1002/pro.3363

[28] Suchyna TM, Johnson JH, Hamer K, et al. Identification of a peptide toxin from Grammostola spatulata spider venom that blocks cation-selective stretch-activated channels[J]. J Gen Physiol, 2000, 115(5): 583-98. doi：10.1085/jgp.115.5.583

[29] Boța M, Vlaia L, Jîjie AR, et al. Exploring synergistic interactions between natural compounds and conventional chemotherapeutic drugs in preclinical models of lung cancer[J]. Pharmaceuticals (Basel), 2024, 17(5): 598. doi：10.3390/ph17050598

[30] He M, Liao QY, Liu D, et al. Dihydroergotamine mesylate enhances the anti-tumor effect of sorafenib in liver cancer cells[J]. Biochem Pharmacol, 2023, 211: 115538. doi：10.1016/j.bcp.2023.115538

[31] Kumar S, Arora A, Chaudhary R, et al. Recent advances in the synthesis of acyclic nucleosides and their therapeutic applications[J]. Top Curr Chem (Cham), 2024, 382(4): 34. doi：10.1007/s41061-024-00476-7

[32] Sigmond J, Peters GJ. Pyrimidine and purine analogues, effects on cell cycle regulation and the role of cell cycle inhibitors to enhance their cytotoxicity[J]. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 2005, 24(10/11/12): 1997-2022. doi：10.1080/15257770500269556

基金资助

RIGHTS & PERMISSIONS

版权所有©《南方医科大学学报》编辑部2021