皮肤黑色素瘤中MMRN2高表达促进肿瘤细胞的侵袭和迁移并与不良预后相关

Overexpression of multimerin-2 promotes cutaneous melanoma cell invasion and migration and is associated with poor prognosis

摘要

目的 采用生物信息学探讨多聚蛋白-2（MMRN2）抑制皮肤黑色素瘤（SKCM）生长和转移的影响。 方法 从GEO数据库获得SKCM患者的临床信息，比较正常组织和黑色素瘤中MMRN2的表达差异；通过STRING数据库获得和MMRN2互相作用蛋白，构建蛋白网络，利用GEPIA2.0数据库下载SKCM中MMRN2相关性基因，对交集基因进行GO/KEGG功能富集分析；利用“timeROC”包处理数据，使用“stats”包和“car”包，分析MMRN2和SKCM的临床相关性；使用survival包进行比例风险假设检验并进行Cox回归分析筛选独立预后因素并构建临床列线图；利用GSCA数据库和ssGSEA算法分析MMRN2与免疫细胞浸润的相关性；利用Spearman分析研究MMRN2和血管生成相关基因的相关性；集落克隆、transwell、划痕实验检测SKCM细胞的增殖和转移能力；采用HE染色观察病理学变化；Kaplan-Meier曲线观察生存时间；ELISA实验检测黑色素瘤细胞上清中GM-CSF、CXCL9、TGF-β1的表达水平。 结果 MMRN2在SKCM转移瘤中的水平升高（P<0.001）；在STRING数据库中获得30个互作分子构建蛋白互作网络，和GEPIA2.0数据库中获得的基因取交集得到15个共同基因，进行GO/KEGG分析主要是是endothelium development、cell-cell junction等。在SKCM患者中MMRN2高表达的患者预后更差，MMRN2的水平在pathologic T satge、breslow depth、melanoma ulceration中差异具有统计学意义（P<0.05），免疫浸润结果显示，MMRN2和24中免疫细胞丰度呈正相关（P<0.001），并与肿瘤成纤维细胞和内皮细胞具有较强的正相关性（P<0.001），MMRN2的表达水平和大多数血管生产基因的表达水平呈正相关，和KCNJ8、SLCO2A1、NRP1、COL3A1的表达相关性较强（P<0.001）；敲低MMRN2后，SKCM细胞B16F10的增殖（P<0.01）、侵袭和迁移能力减弱（P<0.01），重塑免疫微环境（P<0.001），进而抑制黑色素瘤的转移。 结论 多聚蛋白-2可能成为治疗SKCM的新靶点，为SKCM的诊断和治疗提供新的策略与思路。

Abstract

Objective To investigate the inhibitory effect of multimerin-2 (MMRN2) overexpression on growth and metastasis of cutaneous melanoma cells. Methods Clinical data of patients with cutaneous melanoma were obtained from the GEO database to compare MMRN2 expressions between normal and tumor tissues. A protein-protein interaction network was constructed using the STRING database, and the intersecting genes from GEPIA2.0 were subjected to GO and KEGG enrichment analysis. The prognostic relevance of MMRN2 expression level was assessed using Cox regression and "timeROC". The correlations of MMRN2 expression level with immune infiltration and angiogenesis-related genes were analyzed using GSCA database and the ssGSEA algorithm. Colony-forming assay, Transwell assay, and wound healing assay were used to examine the changes in proliferation and migration of cultured cutaneous melanoma cells following MMRN2 knockdown. In a mouse model bearing cutaneous melanoma xenograft, the effect of MMRN2 knockdown on vital organ pathologies, survival of the mice and GM-CSF, CXCL9, and TGF‑β1 protein expressions were analyzed. Results MMRN2 was significantly upregulated in metastatic cutaneous melanoma (P<0.001). Protein interaction network analysis identified 15 intersecting genes, which were enriched in endothelium development and cell-cell junctions. In patients with cutaneous melanoma, a high MMRN2 expression was correlated with a poor prognosis, an advanced T stage, a greater Breslow depth, and ulceration (P<0.05). MMRN2 expression level was strongly correlated with 24 immune cell types (P<0.001), fibroblasts, endothelial cells, and expressions of the pro-angiogenic genes (KCNJ8, SLCO2A1, NRP1, and COL3A1; P<0.001). In cultured B16F10 cells, MMRN2 knockdown significantly suppressed cell proliferation, migration and invasion and caused remo-deling of the immunosuppressive microenvironment. Conclusion MMRN2 overexpression drives progression of cutaneous melanoma by enhancing tumor metastasis, angiogenesis and immune evasion, highlighting its potential as a therapeutic target for melanomas.

Graphical abstract

关键词

多聚蛋白-2 / 黑色素瘤 / 预后 / 生物信息学 / 免疫浸润

Key words

MMRN2 / melanoma / prognosis / bioinfo-rmatics / immune infiltration

皮肤黑色素瘤（SKCM）是一种恶性程度极高的皮肤癌，其发病率和死亡率逐年上升，已成为全球公共卫生领域的重大威胁^［1］。目前，皮肤黑色素瘤的治疗手段包括手术切除、化疗和免疫疗法等^［2］，然而，这些方法在早期诊断及治疗效果方面存在明显局限。因此，探索新的诊治策略显得尤为重要。尽管已有多项研究探讨了与黑色素瘤相关的生物标志物和治疗靶点，但仍然存在许多研究空白。现有的治疗手段常常无法满足患者的需求，早期诊断的困难以及对靶向治疗的依赖使得研究新的生物标志物和靶点变得更加迫切^［3］。

多聚蛋白-2（MMRN2）是一种结构性蛋白，与细胞外基质的稳定性和信号传导相关^［4］。近年来，MMRN2在多种肿瘤的研究中逐渐引起关注， MMRN2通过调控细胞的黏附、迁移以及血管生成，对肿瘤微环境产生显著影响，进而影响肿瘤的侵袭性和转移^{［5， 6］}。已有研究表明，MMRN2与多种肿瘤的发生发展密切相关，其异常表达可能影响SKCM的侵袭性和患者预后，提示其在SKCM中的重要作用^{［7， 8］}，可能成为新的生物标志物或治疗靶点。目前针对黑色素瘤转移靶点选择的局限性，MMRN2是否调控黑色素瘤转移尚无相关报道，靶向MMRN2的治疗策略仍处于理论阶段，缺乏实验支持其可行性。

本研究旨在探讨MMRN2在黑色素瘤中的低表达是否抑制黑色素瘤细胞的增殖、侵袭、转移并重塑免疫微环境。利用生物信息学分析了MMRN2在SKCM中的表达、免疫浸润和患者预后的关系，作为SKCM患者的预后标志物，并通过实验验证了MMRN2在SKCM中的功能。MMRN2可能成为治疗SKCM的新靶点，为SKCM的精准诊断与靶向治疗提供了新的思路。

1 材料和方法

1.1 数据来源

从TCGA数据库（https：//portal.gdc.cancer.gov，The Cancer Genome Atlas）下载并整理SKCM中STAR流程的RNAseq数据，提取TPM格式，去除重复和无临床信息的样本，获得肿瘤组织516例，癌旁59例。使用R包“DESeq2［1.36.0］”、“edgeR［3.38.2］”对数据进行标准化处理，以“|LogFC|>1”且P<0.05为阈值，获取差异基因（Differentially expressed genes，DEGs）。

1.2 材料与方法

1.2.1 实验材料

皮肤黑色素瘤细胞株B16-F10-Luc（中乔新舟），DMEM完全培养基（中乔新舟），胰酶消化液（Biosharp），Transwell小室（Corning），Materigel基质胶（MCE），MMRN2（Abmart），GAPDH（Proteintech），小鼠GM-CSF双抗夹心ELISA检测试剂盒（Proteintech），小鼠CXCL9/MIG双抗夹心ELISA检测试剂盒（Proteintech），小鼠TGF-β1双抗夹心ELISA检测试剂盒（Proteintech），恒温二氧化碳培养箱（Thermo Fisher），SDS凝胶电泳仪（Bio-Rad），无菌超净操作台（Thermo Fisher）。

1.2.2 细胞培养

将冻存细胞从-80 ℃冰箱中取出，在37 ℃水浴锅中解冻，冻存液完全融化后，加入新鲜培养基转移至离心管中，离心后弃上清，细胞沉淀重悬后转移至培养瓶内，置于恒温37 ℃、5 % CO₂培养箱中培养。

1.2.3 动物

SPF级C57BL/6J小鼠，雄性，18~22 g，5周龄，由杭州子源实验动物科技有限公司提供，合格证号：20240902Abzz0105000786，适应性饲养1周，自由摄取食物与水源，在温度为20~25 ℃下维持光照和黑暗各12 h，相对湿度为（50±5）%。本研究经蚌埠医科大学实验动物中心和伦理委员会批准（伦理批号：伦动科批字［2022］第177号）。

1.2.4 小鼠造模及分组

取生长状况良好的细胞胰蛋白酶消化后重悬，2×10⁵/孔细胞铺6孔板（每组设3个复孔），细胞贴壁后在每孔中5 μmol/L感染增强剂 Polybrene，Polybrene与收集的病毒颗粒-MMRN2-shRNA慢病毒感染为实验组，空载质粒病毒液感染为对照组。感染3 d后，更换新鲜的DMEM完全培养基；然后，加入预实验中摸索的最适浓度的嘌呤霉素进行筛选。及时观察荧光强度的变化以及细胞的状态，筛选4 d后，采用Western blotting实验进行敲低效率的检验。将小鼠随机分为对照组（B16F10组）和MMRN2敲低组（shMMRN2），6只/组。各组尾静脉注射100 μL。

1.2.5 ELISA检测

依据ELISA试剂盒说明书检测细胞上清中相关免疫因子GM-CSF、CXCL-9、TGF-β1的水平。

1.2.6 HE染色

采用福尔马林固定肝脏和肾脏组织， 制成3μm厚的石蜡切片， 进行HE染色， 光学显微镜观察组织学变化。

1.2.7 MMRN2在SKCM和正常组织中的表达差异和基因突变情况

从GEO数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）获得SKCM患者的临床信息，比较正常组织和黑色素瘤中MMRN2的表达差异。

1.2.8 MMRN2相关性基因的蛋白互作网络构建和GO/KEGG富集分析

通过STRING数据库（https：//cn.string-db.org）获得和MMRN2互相作用蛋白，构建蛋白网络，并导入到Cytoscape（3.10.1）进行优化。利用GEPIA2.0数据库（http：//gepia2.cancer-pku.cn/#index），下载SKCM中MMRN2相关性前100的基因列表，使用R包“clusterProfiler［4.4.4］”对两个数据库获得的交集基因，进行GO/KEGG功能富集分析，用ggplot2包对富集分析结果进行可视化。

1.2.9 MMRN2和SKCM临床相关性分析

进一步研究MMRN2和患者生存期的关系及其临床意义，基于TCGA数据库的SKCM患者信息，绘制K-M生存曲线，利用“timeROC”包处理数据，使用“stats”包（［4.2.1］）和“car”包（［3.1-0］），运用整体检验（Kruskal-Wallis Test）和多重假设检验（Dunn’s test）统计方法，根据患者的病理分级、TNM分期等进行分组，分析MMRN2的表达水平在这些分组的差别，ggplot2包进行可视化。

1.2.10 列线图的构建与校准

使用survival包（［3.3.1］）进行比例风险假设检验并进行Cox回归分析，单因素和多因素Cox分析筛选独立预后因素，纳入符合条件（P<0.05）的变量构建列线图，使用rms包（［6.3-0］）构建nomogram相关模型并进行可视化^［9］，绘制校正曲线评估列线图的预测准确性。

1.2.11 免疫细胞浸润分析

从GSCA数据库（https：//guolab.wchscu.cn/GSCA/#/）中获取SKCM中MMRN2与免疫细胞浸润的关系，通过Spearman相关性分析计算MMRN2与免疫细胞浸润的相关性。根据1.2.5中的黑色素瘤患者的临床数据，对MMRN2进行表达水平高低分组后，基于R包-GSVA［1.46.0］，Hänzelmann发表的文章提供的ssGSEA算法，利用Immunity中一篇文章提供的24种免疫细胞的markers来计算对应云端数据的免疫浸润情况^［10］，使用t检验进行统计分析（stats包以及car包），用ggplot2包对数据进行可视化。

1.2.12 血管生成基因相关性分析

从已经发表的文章中^［11］获得36个血管生成相关基因，利用Spearman分析，研究MMRN2和血管生成相关基因的关系，分析结果用ggplot2包进行棒棒糖图和散点图可视化。

1.2.13 慢病毒感染技术

用构建的慢病毒载体和包装质粒共转染慢病毒包装细胞，转染，将状态良好的细胞传代到10 cm培养皿中，当细胞长到80%~90%时准备转染，转染前1~2 h更换新鲜的培养基。转染后混匀，室温放置15~20 min后，均匀滴加到培养皿中，置于培养箱中培养。转染12 h后，均匀滴加100×Enhancing buffer促进转染，转染后换液。用完全培养基稀释细胞至3~5×10⁴ /mL，接种于6孔板中，用慢病毒进行序列（南京斑马鱼生物）感染，感染后继续培养，蛋白印迹检测感染效率，进行后续实验。

1.2.14 集落克隆实验

将处于对数生长期的细胞以1×10³/孔种植于6孔板中，细胞贴壁后，培养到14 d或大多数单克隆细胞数大于50为止，吸出原培养基，用PBS清洗后用4%多聚甲醛固定20 min，加入结晶紫染液染色30 min，PBS清洗2~3次，风干后拍照。

1.2.15 划痕实验

在6孔板背面用记号笔划横线定位，收集细胞后离心混悬，按5×10⁵/孔接种于6孔板中，放入培养箱中培养，待细胞密度达到90%后，用200 µL的移液器吸头垂直均匀划线，PBS冲洗2~3次，加入无血清培养液，分别在0 h和24 h用光学显微镜下拍照，并使用ImageJ软件分析结果。

1.2.16 细胞侵袭实验

将Matrigel胶与无血清的培养基以1∶8的比例混匀，取50 μL加入到小室上室中，置于培养箱中约2 h，取出小室用棉签擦去残留基质胶，消化离心后收集细胞，用无血清培养基重悬混匀计数，调整细胞密度为1×10⁵ /mL，向每个小室中加入100 µL细胞悬液，下室加入700 µL含血清培养基，培养24 h，取出Transwell小室，PBS清洗3次后，4%多聚甲醛固定20 min，结晶紫染色30 min，棉签擦去上室细胞，PBS冲洗后，室温下倒置，过夜风干，显微镜下拍照，ImageJ统计穿过膜的细胞数。

1.2.17 细胞迁移实验

无需在上室内加入基质胶，其余同1.11。

1.2.18 Western blotting

检测相关蛋白表达 将细胞接种于100 mm培养皿中，待生长至70%~80%时，收集细胞，冰上裂解、离心，蛋白定量，95 ℃煮沸5 min，蛋白上样，电泳、转膜，5%脱脂奶粉封闭，一抗4 ℃孵育过夜，二抗于室温孵育1.5 h，TBST洗膜10 min，清洗3次，ECL化学发光试剂盒浸润PVDF膜，显影曝光，凝胶成像系统显影曝光，使用ImageJ软件进行灰度值分析，实验重复3次。实验中使用的抗体和稀释比例如下：一抗：MMRN2（1∶1000）、GAPDH（1∶50000），二抗：兔抗（1∶1000）、鼠抗（1∶1000）。

1.2.19 Kaplan-Meier生存曲线

使用survival包进行比例风险假设检验，并进行拟合生存回归，结果用survminer包以及ggplot2包进行可视化。如果选用了最佳分组方法（best），则对应使用survminer包中surv_cutpoint函数进行最佳分组cut-off筛选。

1.3 统计学分析

计量资料均以均数±标准差表示，采用R（4.2.1）软件进行统计分析，两两比较采用独立样本t检验，当P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MMRN2在正常组织和SKCM中的表达情况

从GEO数据库的3个数据集（GSE46517、GSE83583、GSE4587）中获得SKCM患者的临床信息，对比肿瘤组织和正常组织的差异基因，MMRN2在正常组织中的表达高于肿瘤组织（P<0.05，图1A）。在SKCM中，转移瘤中的MMRN2水平升高（P<0.001，图1B）。

2.2 基因相关性分析和构建蛋白互作网络

通过STRING数据库筛选出30个与MMRN2相互作用的蛋白分子，并构建蛋白互作网络（图2B）；进一步与GEPIA2.0数据库中SKCM相关基因取交集，获得15个共有基因（图2A）。对上述基因进行GO/KEGG功能富集分析（图2C），结果显示：生物学过程主要富集于内皮发育、内皮屏障形成、内皮细胞分化；细胞组分显著富集于细胞间连接、双细胞紧密连接、紧密连接；分子功能主要涉及细胞间黏附介导活性、细胞黏附介导活性、腺苷酸环化酶活性；KEGG通路主要富集于白细胞跨内皮迁移、细胞黏附分子、内分泌抵抗。

2.3 MMRN2在SKCM中临床相关性分析的结果

在SKCM患者中，MMRN2的表达水平和患者生存期相关，高表达的患者预后更差（图3A），MMRN2的水平在pathologic T satge（T3，T4）、breslow depth、melanoma ulceration中差异具有统计学意义（图3B）。

2.4 列线图的构建

综合考虑多个临床变量，通过单因素和多因素Cox分析筛选独立预后因素（图4A），Pathologic T stage（T3、T4）、Pathologic N stage（N3）、MMRN2是SKCM患者的独立预后因素，将这些变量纳入到临床列线图的构建（图4B），预测SKCM患者1、3、5年的生存率，C-index为0.680（0.658-0.702），同时生成校准曲线（图4C）。结果显示：1年生存率：预测值与实际值的平均绝对误差（MAE）为0.05，校准曲线紧贴45度参考线，表明模型在短期预后预测中具有较高准确性。3年生存率：预测值与实际值高度吻合（MAE=0.03），曲线几乎与参考线重合，提示模型在中长期预后评估中可靠性最佳。5年生存率：预测值略低于实际值（MAE=0.07），但仍处于可接受范围，反映模型对远期预后的稳健性。此外，列线图的区分度通过一致性指数（C-index）评估，其值为0.680（95% CI：0.658-0.702），表明模型能够有效区分不同风险层级的患者。综合校准曲线与C-index结果，该列线图为SKCM患者的个体化预后评估提供了可靠的量化工具。

2.5 免疫浸润分析结果

免疫浸润结果显示，MMRN2和24种免疫细胞丰度呈正相关（图5A），其中和iDC相关性最强（R=0.548，P<0.001，图5B），MMRN2可能通过分泌趋化因子或调控iDC表面分子的表达，抑制其成熟为活化DC，从而削弱抗肿瘤免疫应答。在TIMER数据库中，我们研究了黑色素瘤中MMRN2和多种免疫细胞（B cell、CD8⁺ T cell、CD4⁺ T cell、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞）的相关性，转移瘤相比于原位瘤具有更强的相关性（图5C）。同时在转移瘤中，MMRN2的表达与肿瘤成纤维细胞（图5D、E）和内皮细胞（图5F）表现出更强的正相关性。

此外，在GSCA数据库（https：//guolab.wchscu.cn/GSCA/#/）中以热图形式展示SKCM中免疫细胞浸润与MMRN2的GSVA富集评分的联系，并通过Spearman相关性分析计算相关性（图6A），MMRN2和MAIT、CD4⁺ T、Tfh等呈正相关，和Effector memory、nTreg、中性粒细胞等呈负相关。按照MMRN2高低表达水平分为两组，MMRN2高表达水平组具有更高的免疫浸润水平（P<0.05，图6B）。

2.6 MMRN2和血管生成基因相关性的分析结果

MMRN2的表达水平和大多数血管生成基因的表达水平呈正相关（图7A），其中，MMRN2和KCNJ8（r= 0.622，P<0.001）、SLCO2A1（r=0.635，P<0.001）、NRP1（r=0.637，P<0.001）、COL3A1（r=0.670，P<0.001）的表达相关性较强（图7B）。

2.7 敲低MMRN2抑制SKCM细胞的增殖、侵袭和迁移

集落克隆、transwell、创面愈合实验结果显示，敲低MMRN2后，SKCM细胞B16的增殖、侵袭和迁移能力减弱（P<0.01，图8）。

2.8 敲低MMRN2后提高小鼠的生存率

HE染色显示经敲低MMRN2后，肝脏转移灶数量减少且面积较小；与对照组相比，敲低MMRN2后，降低了黑色素瘤侵袭肺脏的病灶面积，改善了模型小鼠的肺脏状态（图9A）。Kaplan-Meier曲线结果显示，与对照组相比，敲低MMRN2能延长黑色素瘤小鼠的生存时间（P=0.004，图9B）。ELISA结果显示，与对照组相比，敲低MMRN2能够通过逆转肿瘤免疫抑制微环境，有效抑制B16F10细胞的转移（P<0.01，图9C）。

3 讨论

黑色素瘤是一种黑色素细胞恶性肿瘤，通常起源于皮肤。它是高度恶性的，容易转移和复发，占皮肤癌相关死亡率的75%^［12］。晚期或转移性黑色素瘤的治疗特别具有挑战性，患者极有可能复发并对当前的治疗药物产生耐药性^［13］，因此，研究黑色素瘤转移的作用机制及治疗策略至关重要。

Multimerin-2（MMRN2）是一种独特的内皮特异性细胞外基质蛋白，与血管生成和肿瘤进展有关^［5］。通过对MMRN2基因的突变分析，有研究发现某些突变可能影响其与其他蛋白的相互作用，进而影响肿瘤微环境中的血管生成^［14］。在SKCM细胞系中MMRN2的表达在肿瘤血管生成过程中，MMRN2通过调节VEGFA/VEGFR2信号通路，促进肿瘤血管的形成和稳定性^［15］。据报道，MMRN2还通过调节肿瘤相关巨噬细胞和内皮细胞的功能，影响肿瘤的血管生成^［16］。MMRN2在多种组织中表达，与多种癌症的发生和发展相关。MMRN2与整合素α1的结合能够激活PI3K/AKT信号通路，从而增强细胞的增殖能力^［17］，MMRN2还可以通过影响Bcl-2家族蛋白的平衡，促进细胞存活，抑制凋亡信号通路的激活^［18］。在一项针对甲状腺微小乳头状癌（PTMC）的研究中，MMRN2的表达水平与淋巴结转移（LNM）呈正相关，提示其可能作为LNM的潜在生物标志物^［19］。此外，MMRN2在肾透明细胞癌（KIRC）中的研究也显示，其表达与肿瘤的血管生成密切相关，可能影响患者的生存预后^［20］。在低级别胶质瘤的研究中，尽管MMRN2的表达未能直接与患者的无病生存期相关联，但其他EMILIN/Multimerin家族成员的高表达则对患者预后不利^［21］。抑制MMRN2的功能或表达，或针对MMRN2的免疫干预可能增强治疗的效果。最近的研究表明，确定 COL3A1和 KCNJ8 作为骨关节炎中关键的血管生成相关生物标志物^［22］。本研究发现，MMRN2的表达水平和血管生成相关基因KCNJ8、COL3A1的表达有较强的相关性，提示我们靶向血管生成相关基因KCNJ8、COL3A1可能抑制黑色素瘤的发展。

肿瘤微环境在黑色素瘤进展中的作用及其对治疗的耐药性是最近研究的主要焦点^［23］。即T和B淋巴细胞、巨噬细胞、树突状和自然杀伤细胞以及中性粒细胞，利用多种机制支持黑色素瘤细胞的生长和侵袭性，包括促炎分子的分泌、抑制性受体表达的诱导或必需营养素的消耗。研究还表明，未成熟的树突状细胞可能具有免疫抑制活性，而成熟的树突状细胞可以刺激 T 细胞免疫反应^［24］。此外，黑色素瘤细胞通过TGF-β的分泌损害 DC的募集和成熟，从而阻碍T细胞靶向癌细胞^{［25， 26］}。癌症相关成纤维细胞在黑色素瘤进展过程中表现免疫抑制作用，其细胞分泌的TGF-β可以抑制树突状细胞的迁移、成熟和抗原呈递，增加肿瘤微环境中Treg的数量^{［27， 28］}。研究还证明，MMRN2的表观遗传调控还与肿瘤微环境的变化密切相关，肿瘤相关的炎症因子和生长因子能够通过改变MMRN2的表观遗传状态，进一步促进黑色素瘤的进展^［20］。本研究发现，MMRN2可能通过逆转肿瘤患者外周血中TGF-β1对NK细胞的免疫抑制作用，抑制肿瘤的发展。敲低MMRN2能够有效重塑肿瘤免疫抑制微环境，其通过抑制肿瘤组织 GM-CSF 相关刺激因子，减少肿瘤微环境中MDSCs的浸润，恢复CD8+T细胞等免疫细胞的活性，从而抑制黑色素瘤的转移。CXCL9 高表达与免疫浸润丰富相关，提示更好的免疫治疗响应。因此，TGF-β1抑制T细胞功能，GM-CSF 招募 MDSCs，CXCL9缺失可能导致效应T细胞浸润不足，共同形成免疫抑制性微环境。

此外，MMRN2在SKCM中的表达受到多种表观遗传机制的调控，包括DNA甲基化、组蛋白修饰以及非编码RNA的调控。此外，某些miRNA能够直接靶向MMRN2的3'非翻译区，抑制其表达，从而影响肿瘤细胞的增殖和迁移能力^［29］。MMRN2不仅在多种肿瘤中被发现表达异常，还可能通过调节细胞增殖、迁移及凋亡等过程影响肿瘤的生物学行为^{［14， 30］}。MMRN2的转录调控机制涉及多种转录因子和信号通路的相互作用。研究发现，CD93作为MMRN2的重要配体，在黑色素瘤细胞中通过PI3K/AKT信号通路调节MMRN2的表达，同时影响内皮细胞的行为和血管生成过程^［14］。CD93与MMRN2的结合能够激活下游信号通路，促进细胞增殖和迁移，从而增强黑色素瘤细胞的生物学功能^［17］。本研究发现，MMRN2在黑色素瘤细胞B16F10中高表达，敲低MMRN2后可抑制B16F10细胞的增殖、迁移和侵袭，表明MMRN2可促进黑色素瘤细胞恶性表型。以MMRN2在黑色素瘤组织中高表达，MMRN2高表达组的生存期显著低于低表达组。MMRN2高表达可能是黑色素瘤患者预后的不良指标。

本研究证实了MMRN2在黑色素瘤中高表达，系统阐明了MMRN2在黑色素瘤中通过免疫调控与血管生成双重途径驱动肿瘤进展的机制。靶向MMRN2可能通过逆转免疫抑制微环境，如增强DC成熟、抑制Tregs募集和阻断血管生成实现协同抗肿瘤效应，这为MMRN2作为潜在的黑色素瘤治疗靶点提供了依据。

参考文献

[1] Gosman LM, \u 021 aăpoi DA, Costache M. Cutaneous melanoma: a review of multifactorial pathogenesis, immunohistochemistry, and emerging biomarkers for early detection and management[J]. Int J Mol Sci, 2023, 24(21): 15881. doi：10.3390/ijms242115881

[2] Leonardi GC, Falzone L, Salemi R, et al. Cutaneous melanoma: from pathogenesis to therapy (review)[J]. Int J Oncol, 2018, 52(4): 1071-80.

[3] Davis LE, Shalin SC, Tackett AJ. Current state of melanoma diagnosis and treatment[J]. Cancer Biol Ther, 2019, 20(11): 1366-79. doi：10.1080/15384047.2019.1640032

[4] Andreuzzi E, Colladel R, Pellicani R, et al. The angiostatic molecule Multimerin 2 is processed by MMP-9 to allow sprouting angiogenesis[J]. Matrix Biol, 2017, 64: 40-53. doi：10.1016/j.matbio.2017.04.002

[5] Khan KA, Naylor AJ, Khan A, et al. Multimerin-2 is a ligand for group 14 family C-type lectins CLEC14A, CD93 and CD248 spanning the endothelial pericyte interface[J]. Oncogene, 2017, 36(44): 6097-108. doi：10.1038/onc.2017.214

[6] Lorenzon E, Colladel R, Andreuzzi E, et al. MULTIMERIN2 impairs tumor angiogenesis and growth by interfering with VEGF-A/VEGFR2 pathway[J]. Oncogene, 2012, 31(26): 3136-47. doi：10.1038/onc.2011.487

[7] Galvagni F, Nardi F, Spiga O, et al. Dissecting the CD93-Multimerin 2 interaction involved in cell adhesion and migration of the activated endothelium[J]. Matrix Biol, 2017, 64: 112-27. doi：10.1016/j.matbio.2017.08.003

[8] Chen CJ, Kajita H, Aramaki-Hattori N, et al. Screening of autophagy-related prognostic genes in metastatic skin melanoma[J]. Dis Markers, 2022, 2022: 8556593. doi：10.1155/2022/8556593

[9] Liu JF, Lichtenberg T, Hoadley KA, et al. An integrated TCGA pan-cancer clinical data resource to drive high-quality survival outcome analytics[J]. Cell, 2018, 173(2): 400-16.e11.

[10] Bindea G, Mlecnik B, Tosolini M, et al. Spatiotemporal dynamics of intratumoral immune cells reveal the immune landscape in human cancer[J]. Immunity, 2013, 39(4): 782-95. doi：10.1016/j.immuni.2013.10.003

[11] Qing X, Xu WJ, Liu SL, et al. Molecular characteristics, clinical significance, and cancer immune interactions of angiogenesis-associated genes in gastric cancer[J]. Front Immunol, 2022, 13: 843077. doi：10.3389/fimmu.2022.843077

[12] Yin QL, Shi XM, Lan SJ, et al. Effect of melanoma stem cells on melanoma metastasis[J]. Oncol Lett, 2021, 22(1): 566. doi：10.3892/ol.2021.12827

[13] Holderfield M, Deuker MM, McCormick F, et al. Targeting RAF kinases for cancer therapy: BRAF-mutated melanoma and beyond[J]. Nat Rev Cancer, 2014, 14(7): 455-67. doi：10.1038/nrc3760

[14] Cicaloni V, Karmakar M, Frusciante L, et al. Bioinformatics approaches to predict mutation effects in the binding site of the proangiogenic molecule CD93[J]. Front Bioinform, 2022, 2: 891553. doi：10.3389/fbinf.2022.891553

[15] Pellicani R, Poletto E, Andreuzzi E, et al. Multimerin-2 maintains vascular stability and permeability[J]. Matrix Biol, 2020, 87: 11-25. doi：10.1016/j.matbio.2019.08.002

[16] Wang DY, Xing CY, Liang Y, et al. Ultrasound imaging of tumor vascular CD93 with MMRN2 modified microbubbles for immune microenvironment prediction[J]. Adv Mater, 2024, 36(18): e2310421. doi：10.1002/adma.202470134

[17] Liu H, Zhang JH, Zhao YJ, et al. CD93 regulates breast cancer growth and vasculogenic mimicry through the PI3K/AKT/SP2 signaling pathway activated by integrin β1[J]. J Biochem Mol Toxicol, 2024, 38(4): e23688. doi：10.1002/jbt.23688

[18] Li Y, Fu L, Wu BK, et al. Angiogenesis modulated by CD93 and its natural ligands IGFBP7 and MMRN2: a new target to facilitate solid tumor therapy by vasculature normalization[J]. Cancer Cell Int, 2023, 23(1): 189. doi：10.1186/s12935-023-03044-z

[19] Cao Z, Zhang ZJ, Tang XY, et al. Comprehensive analysis of tissue proteomics in patients with papillary thyroid microcarcinoma uncovers the underlying mechanism of lymph node metastasis and its significant sex disparities[J]. Front Oncol, 2022, 12: 887977. doi：10.3389/fonc.2022.887977

[20] Zheng WZ, Zhang SQ, Guo H, et al. Multi-omics analysis of tumor angiogenesis characteristics and potential epigenetic regulation mechanisms in renal clear cell carcinoma[J]. Cell Commun Signal, 2021, 19(1): 39. doi：10.1186/s12964-021-00728-9

[21] Zhao YH, Zhang X, Yao JC, et al. Expression patterns and the prognostic value of the EMILIN/Multimerin family members in low-grade glioma[J]. PeerJ, 2020, 8: e8696. doi：10.7717/peerj.8696

[22] Zheng Y, Fang MJ, Sanan S, et al. Investigating angiogenesis-related biomarkers in osteoarthritis patients through transcriptomic profiling[J]. J Inflamm Res, 2024, 17: 10681-97. doi：10.2147/jir.s493889

[23] Simiczyjew A, Dratkiewicz E, Mazurkiewicz J, et al. The influence of tumor microenvironment on immune escape of melanoma[J]. Int J Mol Sci, 2020, 21(21): 8359. doi：10.3390/ijms21218359

[24] Tordesillas L, Berin MC. Mechanisms of oral tolerance[J]. Clin Rev Allergy Immunol, 2018, 55(2): 107-17. doi：10.1007/s12016-018-8680-5

[25] Marzagalli M, Ebelt ND, Manuel ER. Unraveling the crosstalk between melanoma and immune cells in the tumor microenvironment[J]. Semin Cancer Biol, 2019, 59: 236-50. doi：10.1016/j.semcancer.2019.08.002

[26] Ellis LM, Hicklin DJ. VEGF-targeted therapy: mechanisms of anti-tumour activity[J]. Nat Rev Cancer, 2008, 8(8): 579-91. doi：10.1038/nrc2403

[27] Thomas DA, Massagué J. TGF-beta directly targets cytotoxic T cell functions during tumor evasion of immune surveillance[J]. Cancer Cell, 2005, 8(5): 369-80. doi：10.1016/j.ccr.2005.10.012

[28] Seeger P, Musso T, Sozzani S. The TGF-β superfamily in dendritic cell biology[J]. Cytokine Growth Factor Rev, 2015, 26(6): 647-57. doi：10.1016/j.cytogfr.2015.06.002

[29] Wang X, Cui ZD, Chen X, et al. The CXCR4/miR-1910-5p/MMRN2 axis is involved in corneal neovascularization by affecting vascular permeability[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2023, 64(4): 10. doi：10.1167/iovs.64.4.10

[30] Janka EA, Ványai B, Dajnoki Z, et al. Regional variability of melanoma incidence and prevalence in Hungary. Epidemiological impact of ambient UV radiation and socioeconomic factors[J]. Eur J Cancer Prev, 2022, 31(4): 377-84. doi：10.1097/cej.0000000000000716

基金资助

安徽省重点研究与开发计划资助项目(202104g01020017)

安徽省高校科研项目(2024AH051219)

安徽省高校科研项目(2024AH051249)

RIGHTS & PERMISSIONS

版权所有©《南方医科大学学报》编辑部2021