枯草杆菌二联活菌肠溶胶囊调节2型糖尿病合并昼夜节律紊乱小鼠糖脂代谢的作用机制

Live combined Bacillus subtilis and Enterococcus faecium improves glucose and lipid metabolism in type 2 diabetic mice with circadian rhythm disruption via the SCFAs/GPR43/GLP-1 pathway

摘要

目的 分析枯草杆菌二联活菌肠溶胶囊（LCBE）对2型糖尿病合并昼夜节律紊乱糖脂代谢的影响以及作用机制。 方法 将KM小鼠随机分为3组，正常组8只，给予正常饲料喂养，高脂组8只，给予高脂饲料喂养，节律干预组16只，给予节律干预和高脂喂养，8 周后给予链脲佐菌素100 mg/kg腹腔注射，将节律干预糖尿病造模成功的小鼠随机分为2组，灌胃干预的2型糖尿病合并昼夜节律紊乱组（n=8）和2型糖尿病合并昼夜节律紊乱对照组（n=8），给予灌胃干预组225 mg/kg的LCBE灌胃干预，其余3组给予等体积的生理盐水，持续8 周。使用鱼跃血糖仪测小鼠血糖，ELISA法检测Bmal 1、PER 2、胰岛素、C肽和血脂水平，HE染色观察小鼠结肠变化，油红O染色观察对肝脏脂代谢的影响，液相色谱-质谱法检测粪便短链脂肪酸的水平，qPCR和Western blotting法检测小鼠GPR43和GLP-1基因及蛋白表达情况。 结果 与CRD-DM组比较，LCBE-CRD-DM组体质量、周期节律调节因子2（PER2）、胰岛素、C肽、T-CHO、TC和LDL-C水平明显下降（P<0.001），Bmal 1和HDL-C水平明显升高（P<0.001）；灌胃干预后，LCBE-CRD-DM组短链脂肪酸、GPR43和GLP-1基因和蛋白表达水平明显高于CRD-DM组（P<0.001）。 结论 LCBE能够降低节律紊乱2型糖尿病的体质量，改善小鼠的血脂水平，LCBE对节律紊乱2型糖尿病小鼠糖脂代谢的影响可能与SCFAs/GPR43/GLP-1通路有关。

Abstract

Objective To investigate the effects of live combined Bacillus subtilis and Enterococcus faecium (LCBE) on glucose and lipid metabolism in mice with type 2 diabetes mellitus (T2DM) and circadian rhythm disorder (CRD) and explore the possible mechanisms. Methods KM mice were randomized into normal diet (ND) group (n=8), high-fat diet (HFD) group (n=8), and rhythm-intervention with HFD group (n=16). After 8 weeks of feeding, the mice were given an intraperitoneal injection of streptozotocin (100 mg/kg) to induce T2DM. The mice in CRD-T2DM group were further randomized into two equal groups for treatment with LCBE (225 mg/kg) or saline by gavage; the mice in ND and HFD groups also received saline gavage for 8 weeks. Blood glucose level of the mice was measured using a glucometer, and serum levels of Bmal1, PER2, insulin, C-peptide and lipids were determined with ELISA. Colon morphology and hepatic lipid metabolism of the mice were examined using HE staining and Oil Red O staining, respectively, and fecal short-chain fatty acids (SCFAs) was detected using LC-MS; GPR43 and GLP-1 expression levels were analyzed using RT-qPCR and Western blotting. Results Compared with those in CRD-T2DM group, the LCBE-treated mice exhibited significant body weight loss, lowered levels of PER2, insulin, C-peptide, total cholesterol (TC) and LDL-C, and increased levels of Bmal1 and HDL-C levels. LCBE treatment significantly increased SCFAs, upregulated GPR43 and GLP-1 expressions at both the mRNA and protein levels, and improved hepatic steatosis and colon histology. Conclusion LCBE ameliorates lipid metabolism disorder in CRD-T2DM mice by reducing body weight and improving lipid profiles and circadian regulators possibly via the SCFAs/GPR43/GLP-1 pathway.

Graphical abstract

关键词

2型糖尿病 / 昼夜节律 / 枯草杆菌二联活菌肠溶胶囊 / 短链脂肪酸 / 糖脂代谢

Key words

type 2 diabetes mellitus / circadian rhythm / live combined Bacillus subtilis and Enterococcus faecium / short-chain fatty acids / glucolipid metabolism

2型糖尿病是一种常见的慢性代谢性疾病^［1］，全球范围内患病率持续上升，预计到2030年糖尿病患者人数将增至6.43亿^［2］。糖尿病及其并发症给患者带来了沉重的心理和经济负担，因此其治疗和管理成为研究热点^［3-5］。

昼夜节律和肠道菌群在2型糖尿病（T2DM）的发病机制中发挥着重要作用^［6-8］。昼夜节律通过调控代谢相关基因的表达，影响胰岛素敏感性和葡萄糖代谢；而肠道菌群则通过产生短链脂肪酸（SCFAs）等代谢产物，调节宿主的胰岛素敏感性和能量代谢^［9-13］。研究表明，昼夜节律紊乱可导致糖耐量异常和胰岛素分泌节律的改变^［14-18］，而肠道菌群失调则与2型糖尿病的发生和发展密切相关^{［9-11， 19］}。流行病学调查进一步支持了这一关联，发现轮班工作与2型糖尿病的发病率显著相关。与未经历轮班工作的人群相比，轮班工作者患2型糖尿病的风险增加约9%^［20-23］。此外，倒班工作还与2型糖尿病患者的血糖控制恶化显著相关，倒班工作者的糖化血红蛋白（HbA1c）水平较日间工作者平均升高0.2%~0.3%^{［24， 25］}。然而，尽管已有研究揭示了昼夜节律和肠道菌群在2型糖尿病中的独立作用，关于昼夜节律-肠道菌群-代谢紊乱三者之间的相互作用机制尚未完全阐明^［26-30］，目前缺乏系统性研究验证益生菌干预对2型糖尿病合并昼夜节律紊乱的治疗效果，这为未来的研究方向提供了重要启示。

本研究首次将昼夜节律紊乱作为中介变量，结合益生菌干预，探索肠道菌群调节昼夜节律紊乱的新机制，并通过动物实验验证LCBE对2型糖尿病合并昼夜节律紊乱的治疗效果。研究旨在探讨LCBE对2型糖尿病合并昼夜节律紊乱小鼠糖脂代谢的影响，并分析其可能的作用机制，为肠道益生菌对2型糖尿病合并昼夜节律紊乱的治疗提供新的理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

4周龄SPF级KM小鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司），许可证号SYXK（冀）2023-001。饲养于河北工程大学附属医院中心实验室SPF级动物饲养中心。本研究经河北工程大学附属医院医学伦理委员会审核批准（伦理批号：IACUC-Hebeu-2023-0033）。

1.1.2 药物与试剂

LCBE（枯草杆菌二联活菌肠溶胶囊，北京韩美有限责任公司）。普通饲料与高脂饲料（北京华阜康生物科技股份有限公司）；链脲佐菌素（STZ，邯郸市西丹贸易有限公司）；小鼠胰岛素ELISA试剂盒、小鼠C肽ELISA试剂盒、小鼠芳香烃受体核转位因子样蛋白ELISA试剂盒和小鼠昼夜节律蛋白2 ELISA试剂盒（上海茁彩生物科技有限公司）；小鼠总胆固醇测定试剂盒、三甘油三酯测定试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒和高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；qPCR相关试剂（上海圣尔科技有限公司）；BCA蛋白定量试剂盒（碧云天）；GPR43抗体（Affinity Biosciences，1∶2000）。

1.1.3 实验仪器

血糖仪（鱼跃）；分析天平（梅特勒-托利多）；离心机（西格玛）；酶标仪（伯腾）；冷冻切片机（徕卡）；岛津高效液相色谱仪（LC-2050C 3D）；色谱柱：资生堂（CAPCELL PAK C18 MGII 250×4.6 mm，5 μm）；电泳仪（伯乐）。

1.2 实验方法

1.2.1 模型建立

雄性KM小鼠，适应性喂养1周后，按体质量随机分为节律干预组、高脂组和空白组。空白组和高脂组整个试验间在正常光照条件（光照：8∶00~20∶00，黑暗：20∶00~8∶00）下饲喂；节律干预组小鼠采用轮回颠倒的光照周期暴露，即在造模第1~3天的光照条件为（黑暗：8∶00~20∶00，光照：20∶00~8∶00），在第4~6天调整光照条件为（光照：8∶00~20∶00，黑暗：20∶00~8∶00），同时在光照时间进行小鼠睡眠剥夺仪进行睡眠剥夺，6 d为一轮回。空白组给予普通饲料连续喂养8 周后。节律干预组和高脂组给予高脂饲料持续喂养8 周，按照100 mg/kg腹腔注射STZ柠檬酸钠缓冲液（pH=4.5），连续3次空腹血糖≥16.9 mmol/L，表明造模成功。

1.2.2 分组与给药

将造模成功的节律干预的糖尿病小鼠随机分为2组，CRD-DM：2型糖尿病组合并昼夜节律紊乱组和LCBE-CRD-DM：LCBE灌胃2型糖尿病组合并昼夜节律紊乱组；继续给予节律干预。LCBE-CRD-DM组（n=8）给予LCBE 225 mg/kg^［31］，溶于生理盐水中，空白对照组（NC）（n=8）、糖尿病对照组（DM）（n=8）和2型糖尿病组合并昼夜节律紊乱组（CRD-DM）（n=8）给予等体积的生理盐水灌胃。连续灌胃8 周。

1.2.3 糖耐量测定

小鼠灌胃8周后，进行葡萄糖耐量实验。将小鼠禁食过夜（12 h），自由饮水。按照2 g/kg的剂量给小鼠灌胃葡萄糖溶液。检测灌胃后的0、15、30、60、120 min小鼠血糖水平，并绘制血糖变化曲线。

1.2.4 小鼠血清生化指标测定

末次给药后，所有小鼠禁食不禁水12 h，麻醉后，小鼠心脏取血，4 ℃沉降过夜，3000 r/min离心10 min，取上清。按照ELISA试剂盒说明测定各组小鼠的血脂生化指标TC、TG、LDL-C、HDL-C水平，同时检测小鼠INS、C肽和脑与肌肉芳基碳氢受体核转位蛋白样1（Bmal-1）、周期节律调节因子2（PER2）水平。

1.2.5 结肠HE染色

处死小鼠后，快速收集各组小鼠结肠组织，剪去多余的脂肪组织，用PBS冲洗结肠，滤纸擦干后放入10%中性固定液中固定。将固定好的结肠组织进行预处理、苏木素染色、伊红染色、脱水封片等步骤，最后用光学显微镜和图像采集分析结果，观察病理改变。

1.2.6 肝脏油红O染色

处死小鼠后，快速收集小鼠肝脏组织，修剪肝脏组织，肝脏油红O染色，取小鼠肝脏组织，需10%中性固定液中固定24 h。经切片染色等处理后，电镜下观察油红O染色结果。

1.2.7 短链脂肪酸含量检测

取50 mg粪便样本，解冻后加入溶解液及提取液，涡旋混匀后置于40 ℃反应1 h，待反应完成后，离心15 min，取上清进行液相色谱-质谱检测。

1.2.8 qPCR测定小鼠结肠GPR43和GLP-1基因表达水平

所选基因引物由生工合成，表1为用于qPCR分析选定的引物序列。使用RNA提取试剂盒进行总RNA提取，测定RNA浓度后使用反转录试剂盒进行反转录，从RNA合成cDNA。qPCR扩增采用三步法，采用2^-ΔΔCT方法计算相对表达量。整个实验设置3个生物重复和3个技术重复。

1.2.9 Western blotting法测小鼠结肠GPR43和GLP-1蛋白表达水平

取结肠组织样品20 mg，加入组织裂解液200 μL，提取蛋白。BCA法测定样本蛋白浓度。制胶并电泳、转膜、封闭、孵育一抗，（GPR43、GLP-1稀释比例为1∶3500，β-actin稀释比例1∶30 000，4℃孵育过夜），洗膜，孵育二抗（1∶2000），洗膜后滴加显影液（1∶1）并置于化学发光仪中显影成像。以β-actin为内参，使用ImageJ分析并计算各蛋白灰度值。

1.3 统计学分析

采用GraphPad Prism 8.0.2软件对实验数据进行处理分析，数据以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析；P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 昼夜节律紊乱模型验证

经过小鼠睡眠剥夺干预后，高脂饮食+昼夜节律干预组小鼠的Bmal 1水平低于空白组和高脂饮食组（P<0.05），而PER 2水平高于空白组和高脂饮食组（P<0.05）。

2.2 各组小鼠体质量及糖耐量比较

经过灌胃干预，LCBE-CRD-DM组小鼠体质量呈下降趋势，与DM组相比差异具有统计学意义（P<0.001，图2）。此外，LCBE-CRD-DM组小鼠体质量低于CRD-DM组小鼠。灌胃干预8周后，LCBE-CRD-DM组在0、15、30、60和120 min的血糖水平均低于CRD-DM组（P<0.001）和DM组（P<0.001），高于NC组（P<0.001，图3）。

2.3 各组小鼠血液生化结果比较

2.3.1 各组小鼠节律因子比较

与NC组相比，DM组、CRD-DM组和LCBE-CRD-DM组Bmal-1水平明降低（P<0.001），且LCBE-CRD-DM组的Bmal-1水平高于DM组和CRD-DM组（P<0.001）。此外，相较于NC组，DM组、CRD-DM组和LCBE-CRD-DM组PER 2水平升高（P<0.001），且LCBE-CRD-DM组PER 2水平低于DM组（P=0.021）和CRD-DM组（P<0.001）。DM组Bmal-1、PER 2水平与NC组有差异（P<0.001，图4）。

2.3.2 各组小鼠胰岛素和C肽水平比较

经过灌胃干预，相较于NC组，DM组和CRD-DM组胰岛素和C肽水平升高（P<0.001），而LCBE-CRD-DM组胰岛素和C肽的水平与NC组差异无统计学意义（P=0.998，图5）

2.3.3 各组小鼠血脂水平比较

经过灌胃干预，与NC组比较，DM组、CRD-DM组和LCBE-CRD-DM组总胆固醇（T-CHO）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平均升高（P<0.001），高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平降低（P<0.001）。此外，与DM组和CRD-DM组比较，LCBE-CRD-DM组的T-CHO、TG和LDL-C均下降（P<0.001），而LCBE-CRD-DM组的HDL-C水平相对于DM组（P=0.001）和CRD-DM组（P<0.001，图6）升高。

2.4 各组小鼠结肠HE染色结果比较

经过灌胃干预后，在NC组小鼠结肠组织中，腺体结构完整，排列整齐，形态规则，且上皮组织完整，隐窝深度较深。相比之下，DM组由于长期的高脂干预，表现出杯状细胞减少，腺体排列轻度紊乱，肠道黏膜由少量炎症细胞浸润。CRD-DM组在长期的高脂及节律干预的环境下，肠道黏膜炎症细胞浸润显著增加，腺体结构紊乱加重，杯状细胞减少，隐窝深度明显变浅。与之相比，LCBE-CRD-DM组结肠隐窝深度及杯状细胞数目显著增多，上皮较为完整，腺体排列胶CRD-DM组相比更为整齐（图7）。

2.5 各组小鼠肝脏油红O染色结果比较

在NC组中，脂类沉积相对较少，图中红色染色斑点（脂滴）数量较少，且呈现较为分散的分布形式，表明正常条件下脂类堆积较少，脂质代谢较为平衡。相比之下，DM组脂质沉积增加，红色脂滴的面积和数量均明显高于NC组。CRD-DM组的脂质沉积依然显著，红色脂滴数量较多且分布广泛；LCBE-CRD-DM组的脂质沉积状况有所改善，红色脂滴数量相比CRD-DM组有所减少，提示其对脂质沉积的干预效果（图8）。

2.6 LCBE对SCFAs/GPR43/GLP-1通路的影响

2.6.1 对小鼠粪便短链脂肪酸含量的影响

与NC组相比，LCBE-CRD-DM组的乙酸、丙酸、丁酸和正丁酸水平无差异无统计学意义（P>0.05）；然而，与CRD-DM组相比，LCBE-CRD-DM组的乙酸、丙酸、丁酸和正丁酸含量升高（P<0.001，图9）

2.6.2 对小鼠结肠GPR43/GLP-1基因表达的影响

与NC组相比，DM组和CRD-DM组的GPR43和GLP-1基因表达水平下降（P<0.001）。在LCBE-CRD-DM组中，GPR43基因的表达水平与NC组差异无统计学意义，而GLP-1的表达水平则明显低于NC组（P<0.001）。此外，与CRD-DM组相比，LCBE-CRD-DM组的GPR43和GLP-1（P<0.001）基因表达水平上调（P<0.001，图10）。

2.6.3 对小鼠结肠GPR43/GLP-1蛋白水平的影响

与NC组相比，DM组和CRD-DM组的GPR43和GLP-1蛋白的表达水平降低（P<0.001）；而LCBE-CRD-DM组中，GLP-1水平与NC组之间差异无统计学意义（P>0.05），GPR43水平则高于NC组（P=0.033）。此外，与CRD-DM组相比，LCBE-CRD-DM组中GPR43和GLP-1蛋白表达水平明显升高（P<0.001，图11）。

3 讨论

本研究从SCFAs对GPR43/GLP-1信号通路的角度，系统揭示了LCBE改善糖脂代谢紊乱的分子机制。尽管已有研究表明益生菌可通过调节肠道菌群改善代谢功能^［32］，但其具体作用机制，尤其是SCFAs受体介导的下游信号传导仍不明确。本研究发现LCBE显著提升乙酸、丙酸及丁酸水平，并通过激活GPR43受体的方式促进GLP-1的分泌，这与先前报道的SCFAs直接刺激L细胞分泌GLP-1的结论一致，但首次明确了益生菌-菌群-SCFAs-GPR43-GLP-1的级联作用链。这一发现填补了益生菌干预代谢性疾病分子机制的研究空白，为开发基于SCFAs通路的精准治疗策略提供了理论依据。

昼夜节律紊乱是代谢性疾病的重要诱因^［33］，但其与肠道菌群及SCFAs代谢的关联尚未阐明。本研究通过构建昼夜节律紊乱小鼠模型，发现LCBE可同步恢复节律因子Bmal 1和PER 2水平，且增加粪便SCFAs含量，提示菌群可能通过“菌群-宿主生物钟对话”改善代谢。这与Zarrinpar等^［34］提出的“菌群驱动生物钟同步化”假说相呼应，但首次在益生菌干预中证实该机制。这一发现为昼夜节律紊乱相关代谢疾病的干预提供了新靶点。

研究表明，LCBE 通过降低厚壁菌门与拟杆菌门的比率以及炎症相关细菌和产生 LPS 的细菌的比例来调节肠道菌群的组成，从而重新排列肠道菌群的结构^［35］。LCBE 可以通过改变肠道微生物群的组成来降低小鼠模型中的胆固醇水平，从而改善宿主健康^{［36，37］}。本研究发现，LCBE可以降低小鼠血脂水平，从而达到缓解糖脂代谢的效果。

本研究通过揭示LCBE调节SCFAs对GPR43/GLP-1通路改善糖脂代谢紊乱的分子机制，为益生菌干预代谢性疾病提供了新的理论支持。这一发现不仅深化了对肠道菌群与代谢性疾病关系的理解，也为未来基于肠道菌群的精准治疗方案设计奠定了基础。同时，本研究为益生菌制剂的开发和应用提供了科学依据，具有重要的理论意义和临床应用价值。

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基金资助

河北省医学科学研究课题(20241988)

河北省高等学校科学技术研究项目(BJK2024152)

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