柴胡疏肝汤通过上调ASIC1蛋白调节NMDAR通道改善大鼠癫痫后的认知障碍

Chaihu Shugan Decoction improves cognitive impairment after epilepsy in rats by regulating hippocampal NMDAR subunits via upregulating ASIC1

摘要

目的 探讨柴胡疏肝汤对氯化锂-匹罗卡品诱导癫痫后认知障碍大鼠认知功能损害的改善作用。 方法 SPF级雄性SD大鼠腹腔注射氯化锂-匹罗卡品诱导癫痫后认知障碍模型，空白对照组大鼠腹腔注射生理盐水。将癫痫后认知障碍大鼠随机分为：模型组（生理盐水）、阳性对照组（Donepezil，90 mg·kg^-1·d^-1）、柴胡疏肝汤1组（CHSG-1，2.5 g·kg^-1·d^-1）、柴胡疏肝汤2组（CHSG-2，5 g·kg^-1·d^-1）、柴胡疏肝汤3组（CHSG-3，10 g·kg^-1·d^-1）、柴胡疏肝汤4组（CHSG-4，20 g·kg^-1·d^-1）、柴胡疏肝汤5组（CHSG-5，40 g·kg^-1·d^-1），空白组大鼠（n=12）以生理盐水灌胃给药，各组大鼠连续灌胃给药4周后，Morris水迷宫观察各组大鼠认知行为变化，Western blotting检测大鼠海马区ASIC1、NR1、NR2A、NR2B蛋白表达水平，荧光定量PCR检测大鼠海马区 ASIC1、NR1、NR2A、NR2B的mRNA表达水平。 结果 柴胡疏肝汤治疗4周后，Morris水迷宫认知行为学结果显示，与模型组相比，CHSG-2和CHSG-3组大鼠逃避潜伏期缩短（P<0.05，P<0.01），CHSG-2和CHSG-3组大鼠目标象限停留时间延长（P<0.05），CHSG-2和CHSG-3组大鼠穿越平台次数增加（P<0.05）；Western blotting结果显示，CHSG-2和CHSG-3组大鼠海马区ASIC1、NR1、NR2A、NR2B蛋白表达增加（P<0.05），与CHSG-3相比较，CHSG-1、CHSG-4和CHSG-5组蛋白表达降低（P<0.01）。PCR结果显示，与模型组相比较，CHSG-2组、CHSG-3组、CHSG-4组及CHSG-5组大鼠海马区ASIC1、NR1、NR2A、NR2B mRNA表达增加（P<0.05）。 结论 柴胡疏肝汤对癫痫后认知功能损害有一定的治疗作用，可能通过上调ASIC1通道蛋白进而调节抗N-甲基-D-天冬氨酸受体蛋白及亚单位蛋白及基因的表达及通道活性，调节神经元兴奋性及突触可塑性发挥治疗作用；柴胡疏肝汤的治疗作用在一定的剂量范围内显示剂量依赖性，且剂量浓度有一定的安全范围。

Abstract

Objective To explore the therapeutic mechanism of Chaihu Shugan (CHSG) Decoction for improving cognitive impairment in rats with epilepsy induced by lithium chloride and pilocarpine. Methods Male SD rat models of cognitive impairment model after epilepsy induced by intraperitoneal injection with lithium chloride and pilocarpine were randomly divided into 5 groups (n=12) for treatment with daily gavage of saline, donepezil (90 mg/kg), or CHSG Decoction at 2.5, 5.0, 10, 20 and 40 g/kg for 4 consecutive weeks, with 10 rats with intraperitoneal injection with saline as the blank control group. Morris water maze test was used to evaluate cognitive and behavioral changes of the rats after treatment. The mRNA and protein expressions of ASIC1, NR1, NR2A and NR2B in the hippocampus of rats were detected using RT-qPCR and Western blotting. Results Compared with those with saline treatment, the rat models treated with CHSG Decoction at 5 and 10 g/kg showed significantly shortened escape latency and prolonged stay in the target quadrant with increased number of platform crossings in Morris water maze test. CHSG Decoction treatment at the two doses significantly increased ASIC1, NR1, NR2A and NR2B protein expressions in the hippocampus of the rat models, and their mRNA expression levels were all increased significantly after the treatment at the doses above 2.5 g/kg. Conclusion CHSG Decoction can improve cognitive impairment in rats after epilepsy possibly by regulating the expression and channel activity of NMDAR protein and its subunit protein via upregulating ASIC1 to modulate neuronal excitability and synaptic plasticity in the hippocampus.

Graphical abstract

关键词

癫痫 / 认知障碍 / 从肝论治 / 柴胡疏肝汤 / 酸敏感离子通道 / 抗N-甲基-D-天冬氨酸受体

Key words

epilepsy / cognitive impairment / treatment from Gan / Chaihu Shugan Decoction / acid sensitive ion channel / NMDAR

流行病学调查表明，我国癫痫患病率为0.7%，现有癫痫患者900多万^［1］。临床中70%~80%的慢性癫痫患者存在认知障碍^{［2， 3］}，癫痫后认知功能损害，可表现为注意力下降，对事物的感知、抽象概括、阅读学习等方面的能力减退，目前癫痫认知障碍共病是临床治疗的重点和难点。研究表明，酸敏感离子通道（ASICs）与神经系统疾病如帕金森病、阿尔茨海默病、疼痛、癫痫的发生发展密切相关^［4］，近年来被作为神经系统疾病治疗新靶点而广泛研究^［5］，有研究提示ASICs亚单位ASIC1a可能是癫痫治疗的新靶点^［6］，酸中毒引起神经元树突棘结构重塑，影响神经元突触传递及长时程增强^［7］，抗N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）是介导神经元突触传递及突触可塑性的重要功能受体，是学习与认知功能受体^［8］，NMDAR过度激活将导致癫痫发作^［9］，NMDAR调节亚基NR2A和NR2B存在功能性的差异，其分布及表达调控也是参与突触可塑性改变的重要机制之一^［10］。NMDAR和ASICs都存在于中枢突触中，介导重要的生理和病理条件，但它们之间的功能关系尚不清楚。在缺血性小鼠卒中模型中发现谷氨酸是ASICs加剧缺血性神经毒性的正变构调节剂，与NMDAR存在密切关系^［11］，NMDAR与ASICs在癫痫及认知障碍中的相互作用未见文献报道。《黄帝内经》曰：“木郁之发，太虚埃昏，云物以扰，大风乃至，屋发折木，木有变。故民病胃脘当心而痛，上支两胁，鬲咽不通，食饮不下，甚则耳鸣眩转，目不识人，善暴僵仆”，据此理论课题组提出癫痫“从肝论治”的中医治法，拟方柴胡疏肝汤，由柴胡、黄芩、半夏、党参、桂枝、白芍、大枣、甘草、当归、生地、川芎、钩藤、生龙骨、生牡蛎、生姜组成，有疏肝解郁、柔肝平肝、镇肝潜阳之效。课题组前期研究发现柴胡疏肝汤有良好的抗临床和实验性癫痫的作用^［12-14］，临床观察发现，柴胡疏肝汤在改善癫痫患者痫性发作的同时对患者的认知功能有一定的保护作用，进一步实验研究发现柴胡疏肝汤能改善癫痫后大鼠认知功能下降、上调大鼠海马区脑源性神经营养因子（BDNF）蛋白表达水平^［15］，复方中君药柴胡单体柴胡皂苷a（SSa）能够抑制癫痫大鼠海马神经元NMDA受体介导的电流幅度^［16］。本研究拟以氯化锂-匹罗卡品诱导癫痫后认知障碍大鼠模型，观察柴胡疏肝汤干预后癫痫后认知障碍大鼠认知功能变化及大鼠海马区ASIC1及NMDAR亚单位NR1、NR2A、NR2B蛋白表达变化，探讨柴胡疏肝汤治疗癫痫后认知障碍的作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

健康雄性SPF级SD大鼠200±20 g，购于南方医科大学实验动物中心，实验动物许可证号：（粤）2021-0167。所有动物在相同环境下饲养，室温22 ±2 ℃，湿度（50±5）%，光暗循环12 h，自由饮食进水。所有动物实验均由广东省人民医院动物伦理委员会审核通过（伦理批号：GDREC2019161A）。

1.1.2 试剂与仪器

柴胡疏肝汤复方的中药材由广东至信制药有限公司提供，复方中药水煎2次，合并2次滤液纱布滤过后减压浓缩至生药含量1 g/mL，4 ℃冷藏备用；多奈哌齐片（Donepezil，卫材药业有限公司）；氯化锂，阿托品，水合氯醛，DEPC（Sigma）；匹罗卡品（盐酸毛果芸香碱，selleck）；ASIC1、NR1、NR2A、NR2B抗体（abcam）；Actin抗体（碧云天生物技术研究所）；Trizol（Invitrogen）；SYBR Premix EX Taq ⅡKit，Prime ScriptTMRT reagent Kit（TaKaRa）。Morris水迷宫视频监控系统（上海欣软信息科技有限公司）；高速冷冻离心机（Sigma）；半干电转印仪（Bio-rad）；电泳印迹系统（Amersham）；荧光定量仪（ABI）；PCR仪（BIO-RAD）。

1.2 方法

1.2.1 氯化锂-匹罗卡品诱导癫痫后认知障碍大鼠模型^［17］

SD大鼠首日腹腔注射氯化锂（125 mg/kg），24 h后腹腔注射阿托品（1 mg/kg），30 min后腹腔注射匹罗卡品（10 mg/kg）。参照国际公认的Racine分级标准，0级：无发作反应；I 级：节律性口角、耳或面部肌肉抽动阵挛；Ⅱ级：点头并伴随更严重的面部肌肉抽动阵挛；Ⅲ级：出现前肢阵挛但不伴随直立；Ⅳ级：前肢阵挛伴随直立；V级：全身强直阵挛发作而跌倒。Ⅳ级以上发作为癫痫持续状态（SE）。观察并记录大鼠癫痫发作情况，出现SE为造模成功，如未出现SE则每隔30 min继续腹腔注射匹罗卡品（10 mg/kg），直至大鼠出现SE后停止注射。若SE持续发作60 min，则腹腔注射l0%的水合氯醛终止发作。空白对照组大鼠腹腔注射等体积的生理盐水。

将60只癫痫后认知障碍模型大鼠随机分为：模型组、阳性对照组、柴胡疏肝汤高剂量组、柴胡疏肝汤中剂量组、柴胡疏肝汤低剂量组，分别给予生理盐水、多奈哌齐90 mg·kg^-1·d^-1、柴胡疏肝汤1组（CHSG-1，2.5 g·kg^-1·d^-1）、柴胡疏肝汤2组（CHSG-2，5 g·kg^-1·d^-1）、柴胡疏肝汤3组（CHSG-3，10 g·kg^-1·d^-1）、柴胡疏肝汤4组（CHSG-4，20 g·kg^-1·d^-1）、柴胡疏肝汤5组（CHSG-5，40 g·kg^-1·d^-1）灌胃给药，各组大鼠连续灌胃给药4周，Morris水迷宫行为学评估大鼠认知功能变化，于用药第28天末次给药后脱臼处死大鼠，断头取脑冰上分离海马，-80 ℃冻存备用。

1.2.2 Morris水迷宫评估难治性癫痫大鼠认知功能变化

Morris水迷宫实验主要用于测试实验动物对空间位置觉和方向觉（空间定位）的学习记忆能力^［19］。采用直径180 cm、高60 cm的恒温圆形水箱，水温维持22±1 ℃，采用黑色染料将箱内水染至黑色不透明状，与白色大鼠形成色差对比利于轨迹记录。由Super Maze动物行为监测系统将水箱划分为W、E、S、N 4个象限，在N象限的水面下1 cm 处放置1个直径为12 cm的隐蔽平台作为大鼠的逃避目标，并记录N象限为目标象限，水箱中央正上方安置，记录大鼠游泳速度、路径、登上目标平台消耗时间以及在各象限游泳时间。实验由定位航行和空间探索两个部分构成，共进行6 d。首先进行定位航行实验，共5 d，大鼠头朝池壁随机从4个象限入水，大鼠自入水至登上平台所消耗时间记为逃避潜伏期，若大鼠60 s内未能成功登上目标平台，则引导其登上平台，并记录逃避潜伏期为60 s，每次实验后允许大鼠在目标平台上停留10 s。实验结束后，取出大鼠，毛巾擦拭，放在150 W的白炽灯下烤5 min，放回笼内。每只大鼠每日训练4次（每象限下水训练1次），两次训练之间间隔20 min，连续进行5 d。每只大鼠最终逃避潜伏期的成绩为其实验最后3天逃避潜伏期的均值。第6天进行空间探索实验，将目标平台从水箱中移除，大鼠自原先象限的对测入水，记录120 s内大鼠在N目标象限游泳的时间和进入该象限的次数。用Super Maze软件分析系统分析大鼠逃避潜伏期、目标象限停留时间、穿越平台次数等作为评价指标。

1.2.3 Western boltting检测

精确称取海马组织于液氮研磨，后加入组织蛋白提取液（组织裂解液：PMSF=100∶1），充分混匀后冰上裂解1.5 h，4 ℃离心15 min，上清液再以4 ℃离心15 min，留取上清液，以BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。根据蛋白定量标准曲线取标本置于95 ℃恒温器中蒸煮5 min进行蛋白变性，采用半干电转移法转移蛋白至PVDF膜，PVDF膜用含5%脱脂奶粉的PBST封闭1.5 h，然后加入ASIC1、NR1、NR2A、NR2B抗体（稀释比例1∶1000）及GAPDH抗体（稀释比例1∶1000），4 ℃冰上孵育过夜，再用相应的二抗IgG室温孵育1.5 h，最后ECL发光液孵育后于成像系统曝光成像，ASIC1、NR1、NR2A、NR2B条带灰度值与GAPDH条带灰度值的比值作为衡量目的蛋白的表达量。

1.2.4 荧光定量PCR检测

取各组大鼠海马组织液氮研磨后取适量，用Trizol法提取总NRA，使用RNase-free的DNase I（Promega），按试剂盒说明书进行配置反应液，37 ℃消化30 min，65 ℃灭活10 min，取4 μL RNA模板做逆转录反应，反应体系见表1。

反应条件：37 ℃，60 min，然后95 ℃，3 min。荧光定量PCR （SYBR Green法）检测大鼠海马组织 ASIC1、NR1、NR2A、NR2B基因的mRNA表达水平。引物由Sangon公司合成（表2），ABI 3900台式高通量DNA合成仪。使用=2^-△△CT法计算mRNA的相对表达量。

1.3 统计学分析

运用SPSS 26.0统计软件进行数据统计，实验数据均为正态分布的计量资料，以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析、LSD法。对于水迷宫项指标，首先采用多因素方差分析（因素包括各处理组、观测天数）对所有数据进行分析，若各处理组间差异有统计学意义，再采用LSD检验进行组间两两比较。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Morris水迷宫观察各组大鼠认知行为变化

与空白组相比，模型组大鼠逃避潜伏期延长、目标象限停留时间缩短（P<0.01），穿越平台次数减少（P<0.01）。与模型组相比，CHSG-2组和CHSG-3组大鼠逃避潜伏期缩短、目标象限停留时间延长、大鼠穿越平台次数增加（P<0.05）。与CHSG-3组相比较，CHSG-1、CHSG-4和CHSG-5组大鼠逃避潜伏期延长、目标象限停留时间缩短（P<0.01），穿越平台次数减少（P<0.01，图1）。

2.2 Western blotting检测大鼠海马区ASIC1、NR1、NR2A、NR2B蛋白表达情况

与空白组相比，模型组大鼠海马区ASIC1、NR1、NR2、NR2B蛋白表达降低（P<0.01）。与模型组比较，CHSG-2组和CHSG-3组大鼠海马区ASIC1、NR1、NR2A、NR2B蛋白表达增加（P<0.05）。与CHSG-3组相比较，CHSG-1、CHSG-4和CHSG-5组大鼠ASIC1、NR1、NR2、NR2B蛋白表达降低（P<0.01，图2、3）。

2.3 荧光定量PCR检测大鼠海马区 ASIC1、NR1、NR2A、NR2B的mRNA表达水平

与空白组相比较，模型组大鼠ASIC1、NR1、NR2A、NR2B的mRNA表达水平降低（P<0.01），与模型组相比较，CHSG-2组、CHSG-3组、CHSG-4组及CHSG-5组大鼠海马区ASIC1、NR1、NR2A、NR2B mRNA表达增加（P<0.01，图4）。

3 讨论

NMDAR是介导突触可塑性改变的重要功能受体，同时也是参与、调控突触可塑性稳态的重要分子^［19］。由于NR1亚基是NMDAR的必备亚基，故NR1表达水平可反映NMDAR数量，其表达水平的改变是介导突触再可塑性调控突触可塑性、并参与学习记忆功能的重要机制。因调节亚基NR2A和NR2B在学习与记忆过程的突触表达存在差异^［20］。ASICs属于上皮Na⁺通道/退化蛋白家族中的一类非电压敏感性、能被H⁺直接激活的阳离子通道，到目前为止，已发现4个ASICs亚单位，分别为ASIC1、ASIC2、ASIC3和ASIC4，主要分布在中枢和外周感觉神经元上，ASIC1是介导中枢神经元酸激活电流最重要的亚基，有研究在体外培养小鼠海马脑片上采用多电极通道记录技术发现ASIC1可通过多种机制影响海马神经元突触可塑性及海马神经元LTP水平^［21］。ASIC1亚单位ASIC1a有助于大脑不同区域的突触可塑性，研究发现ASIC1a参与突触传递，对学习与记忆过程至关重要^［22］。

本实验通过氯化锂-匹罗卡品诱导癫痫后认知障碍大鼠模型，以中药柴胡疏肝汤干预治疗4周后，观察柴胡疏肝汤的对大鼠认知障碍的作用。水迷宫实验中大鼠逃避潜伏期延长，目标象限停留时间缩短，穿越平台次数减少，与正常对照组比较差异均有统计学意义（P<0.01），证明氯化锂-匹罗卡品诱导诱导的难治性癫痫模型大鼠合并认知功能明显下降。柴胡疏肝汤治疗4周后，CHSG-2、CHSG-3组大鼠逃避潜伏期缩短，标象限停留时间延长，穿越平台次数增加，提示柴胡疏肝汤可改善难治性癫痫模型大鼠认知功能的损伤，对难治性癫痫合并认知障碍有一定的治疗作用。Western blotting检测结果显示与模型组比较，CHSG-2、CHSG-3组大鼠海马区ASIC1、NR1、NR2A、NR2B蛋白表达水平增加（P<0.05）。柴胡疏肝汤各剂量组组间比较结果提示，与CHSG-3组相比较，CHSG-1、CHSG-4和CHSG-5组ASIC1、NR1、NR2A、NR2B蛋白表达水平均下降（P<0.01），PCR检测结果显示，与模型组比较，CHSG-2组、CHSG-3组、CHSG-4组及CHSG-5组大鼠海马区ASIC1、NR1、NR2A、NR2B的mRNA表达水平增加（P<0.01）。有研究使用无Mg²⁺外液孵育大鼠海马脑片诱导癫痫发作模型中观察到ASIC1能够调节海马神经元自发活性与癫痫发作密切相关^［23］。临床研究发现，人脑原发性癫痫组织和继发性癫痫组织中ASIC1蛋白的表达水平较正常对照组显著减低，局灶性皮质发育不良患者病灶组织中ASIC1的mRNA及蛋白表达量较正常人存在明显下调^［24］，本研究结果在癫痫模型中ASIC1蛋白及基因表达下降与之相符；一项药物截断实验研究发现^［25］，增强ASIC1a功能有助于预防药物阶段引起的突触重排，维持原突触结构的稳定。本实验结果提示，用药后ASIC1表达较模型组升高，说明ASIC1对癫痫后认知障碍大鼠有突触保护作用。本研究中，柴胡疏肝汤各剂量组组间比较结果提示，与CHSG-3组相比较，CHSG-1、CHSG-4和CHSG-5组ASIC1、NR1、NR2A、NR2B蛋白表达水平均下降（P<0.01），提示柴胡疏肝汤可上调ASIC1、NR1、NR2A、NR2B蛋白、基因表达水平。在海马切片电生理实验中发现刺激ASIC1a诱导NMDAR EPSC振幅显著增加，抑制ASIC1a导致NMDAR EPSC振幅降低^［26］，说明ASIC1a和NMDAR之间功能关系存在协同作用，本实验结果显示，ASIC1及NMDAR及亚单位蛋白及基因表达在癫痫认知障碍模型大鼠海马区均下降，用药后均上调，表明ASIC1及NMDAR在癫痫认知障碍模型及药物干预后的变化一致。表明柴胡疏肝汤通过上调ASIC1和上调NMDAR表达发挥治疗癫痫后认知障碍的作用，上调作用在一定的剂量范围内有剂量依赖性，超过剂量后其调节作用随着剂量的增加而下降，提示柴胡疏肝汤有剂量安全范围。

综上所述，柴胡疏肝汤对癫痫后大鼠的认知损害有治疗作用，它可能通过上调ASIC1蛋白表达。调节NMDAR亚单位的蛋白表达，进而调控NMDAR通道活性，调节神经元兴奋性及突触可塑性。柴胡疏肝汤的作用效果在一定的剂量范围之内有剂量依赖性。癫痫后认知障碍的病理机制复杂，柴胡疏肝汤是否对ASICs其他亚单位也有调节作用仍未探明。另外，柴胡疏肝汤的作用效果量效关系需进一步探讨，明确柴胡疏肝汤有效安全剂量范围，为“从肝论治”治疗癫痫后认知障碍提供实验依据。

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