吡非尼酮抑制调节性T细胞延缓小鼠膀胱癌进展

Pirfenidone inhibits bladder cancer xenograft growth in mice by regulating regulatory T cells

摘要

目的 观察吡非尼酮（PFD）对小鼠异位膀胱肿瘤的抑制和肿瘤微环境调节性T细胞（Treg）的调控作用。 方法 构建C57BL/6小鼠异位膀胱肿瘤模型共32只，随机分为对照组和吡非尼酮（PFD）组，16只/组。对照组予正常饮食，PFD组小鼠建模后每天按500 mg/kg口服PFD。对比各组小鼠生存率和肿瘤生长速度，药物干预21 d后两组各随机留取6只小鼠的肿瘤、脾脏、肝脏、肺脏、心脏及肾脏等组织，免疫组化染色（IHC）检测肿瘤组织CD3、CD4、CD8和FOXP3等表达情况，流式细胞仪和PCR检测肿瘤和脾脏组织中CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺ Treg细胞数量和IL-2、IL-10、IL-35等Treg细胞相关因子的表达。H&E染色观察小鼠脏器的损伤。 结果 与对照组相比，PFD组小鼠肿瘤相对生长速率及21d肿瘤体积减小（P<0.01），28 d生存率提高（P<0.05）。IHC结果显示两组小鼠肿瘤组织中CD3⁺和CD8⁺的细胞数量差别无统计学意义（P<0.05），但PFD组小鼠肿瘤组织中CD4⁺和Foxp3⁺的细胞数量均低于对照组（P<0.05）。流式细胞学分析证实PFD组小鼠肿瘤组织中CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺细胞数和Treg细胞相关因子IL-2，IL-10和IL-35的基因表达水平均低于对照组（P<0.05），但两组小鼠脾脏组织Treg细胞数量及相关因子表达差异无统计学意义（P>0.05）。H&E染色结果显示两组小鼠脏器组织均无明显损伤。 结论 PFD可显著抑制小鼠膀胱癌生长，提高生存率，其效应可能与肿瘤微环境Treg细胞的抑制相关。

Abstract

Objective To investigate the inhibitory effect of pirfenidone (PFD) on growth of bladder cancer xenograft and its regulatory effect on Treg cells in tumor-bearing mice. Methods Thirty-two C57BL/6 mice bearing ectopic bladder tumors were randomized into control and PFD groups (n=16). In PFD group, PFD was administered orally at the daily dose of 500 mg/kg, and tumor growth and survival of the mice were monitored. After treatment for 21 days, the tumors and vital organs were harvested for analysis. Immunohistochemistry was used to assess CD3, CD4, CD8, and FOXP3 expressions in the tumors. Flow cytometry and RT-qPCR were used to analyze the percentage of CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺ Treg cells and IL-2, IL-10, and IL-35 expressions in the tumors and spleens; organ damage of the mice was examined with HE staining. Results Compared with the control group, the PFD-treated mice exhibited significantly lower tumor growth rate with smaller tumor volumes at day 21, along with improved survival at day 28. Immunohistochemistry revealed no significant differences in the infiltration of CD3⁺ and CD8⁺ cells between the two groups, but the percentages of CD4⁺ and FOXP3⁺ cells were significantly lower in the tumors of PFD-treated mice. Flow cytometric analysis confirmed a decrease in CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺ Treg cells in the tumors from PFD-treated mice, which also had reduced expression levels of IL-2, IL-10 and IL-35 mRNAs in the tumors. No significant differences were found in Treg cell populations or cytokine expressions in the spleen tissues between the two groups. HE staining showed obvious organ damage in neither of the groups. Conclusion PFD inhibits bladder cancer growth and enhances survival of tumor-bearing mice possibly by suppressing Treg cells in the tumor microenvironment.

Graphical abstract

关键词

吡非尼酮 / 膀胱癌 / 免疫微环境 / 调节性T细胞

Key words

pirfenidone / bladder cancer / immune microenvironment / regulatory T cells

膀胱癌是常见的泌尿系统恶性肿瘤，在全球范围内发病率居高不下且持续上升。以顺铂为基础的化疗作为晚期和转移性膀胱癌临床一线治疗方案，其客观有效率仍未超过50%^［1］。以PD-1/PD-L1抑制剂为代表的免疫治疗，尤其免疫联合化疗或抗体偶联药物（ADC）等治疗方案，在膀胱癌治疗中显示出更好的疗效^［2，3］，成为最具潜力的治疗药物之一。然而，肿瘤客观反应率低下及易耐药复发等问题仍制约着临床膀胱癌的治疗进展。调节性T细胞（Treg）介导的免疫抑制是肿瘤发生免疫逃逸的主要机制之一^［4］，免疫检查点抑制剂可诱导Treg 表达^［5］，Okato等^［6］发现厄达替尼可抑制FGFR3突变的小鼠膀胱癌组织Treg的增殖，增强免疫检查点抑制剂治疗疗效。可见，针对Treg的干预措施已成为目前膀胱癌治疗领域的研究焦点。

吡非尼酮（PFD）目前获批用于特发性肺纤维化的治疗，其可有效控制组织纤维化过程和炎症反应^［7］。除此之外，目前多个研究已初步证实PFD可抑制肿瘤的发展，并可增强免疫抑制剂对肺癌的治疗疗效^{［8， 9］}，说明PFD可能通过重塑肿瘤免疫微环境增敏免疫治疗，然而仍缺少关于PFD增强免疫治疗机制的深入研究。最新文献结果表明，PFD通过抑制CCL2减少Treg细胞向乳腺癌组织的趋化，阻止免疫耐受的发生^［10］。然而，PFD对膀胱癌组织Treg细胞的影响仍未见报道。本课题组前期发现PFD联合PD-L1抑制剂可有效抑制膀胱癌进展，并抑制骨髓源性抑制细胞（MDSCs）表达^［11］。本研究进一步观察了PFD对膀胱癌组织中Treg细胞的影响，深入探讨PFD调控膀胱癌免疫微环境预防免疫耐受的作用机制，明确了吡非尼酮增强膀胱癌免疫治疗的潜在机制，为靶向Treg细胞的免疫治疗策略提供了有力的研究证据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

小鼠膀胱癌细胞（MB49）、1640培养基、胰酶及胎牛血清购于武汉普洛赛生物科技有限公司，吡非尼酮（APExBIO），鼠抗CD3单克隆抗体、鼠抗CD8单克隆抗体、鼠抗CD4单克隆抗体、鼠抗Foxp3单克隆抗体（三鹰公司）。工作台、CO₂培养箱、多功能酶标仪、冷冻离心机（Thermo）。

1.2 实验动物

选取6~8周龄C57BL/6雌性小鼠32只（江苏省协同医药生物工程责任有限公司），体质量18~20 g。饲养室温20~24 ℃，自由饮食，12 h昼夜交替。本实验遵循国家实验动物管理保护条例，并通过蚌埠医科大学第一附属医院伦理委员会批准（伦理批号：伦动科批字〔2024〕第329号）。

1.3 小鼠异位肿瘤模型建立

接种前1 d备皮，用0.1 mL PBS与基质胶2∶1混匀重悬2×10⁶ MB49膀胱癌细胞，于小鼠右侧腋下进行皮下注射肿瘤细胞。肿瘤达100 mm³时开始给药干预。观察肿瘤生长并测量体积，肿瘤体积（TV）计算为肿瘤最长直径（D）和短直径（d'，d''）的乘积：TV=D×d'×d''^［16］。

1.4 小鼠分组及处理

将32只荷瘤鼠随机分为对照组（建立肿瘤模型正常饮食）和PFD组（PFD 500 mg/kg口服，1次/d），16只/组。药物干预21 d后，过量CO₂麻醉处死小鼠（6只/组），手术剥离小鼠肿瘤，制成组织切片和肿瘤单细胞悬液检测相关指标。剩余小鼠观察生存时间至28 d，记录死亡和至观察终点小鼠数量。

1.5 免疫组织化学染色（IHC）

脱蜡水化后将组织切片浸入柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中行抗原修复。3%H₂O₂溶液浸泡15 min后PBS冲洗，加入一抗（CD3，CD4，CD8，Foxp3抗体均为1∶400稀释）4 ℃孵育过夜。PBS冲洗后加入二抗（1∶1000稀释），室温放置20 min。DAB工作液显色，苏木青复染，然后盐酸分化、脱水、透明、中性树脂封片。通过Image-J软件评估染色区域占比，图像的染色区域占比指示相对表达水平。随机选择的3个视野的组织信号密度以盲法计数，并进行统计分析。

1.6 流式细胞仪检测

将肿瘤组织与脾脏制成单细胞悬液后，进行细胞计数，将细胞调整到1×10⁷/mL。取100 μL细胞悬液加入1 μg纯化人CD16抗体进行封闭，室温孵育10 min。封闭结束后，分别加入CD4，CD25抗体5 μL，混匀，4 ℃避光孵育30 min进行表面抗体孵育。然后依次加入1mL Cell Staining Buffer，1mL Fixation Working Solution，1×Permeabilization Working Solution，每次加入溶液后均需离心后取上清，然后加入下一工作液。然后再用100 μL Cell Staining Buffer重悬细胞，加入FOXP3抗体5 μL，室温避光孵育30 min，重悬后调整仪器参数并上机检测。

1.7 逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）

通过Trizol试剂从组织样品中分离总RNA，然后根据制造商的说明书使用逆转录试剂盒进行逆转录。所需引物由生工生物工程股份有限公司合成，逆转录试剂盒购于苏州近岸蛋白质科技股份有限公司。在以下条件下进行RT-PCR反应：94 ℃ 3 min； 40个PCR循环：94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s； 72 ℃ 10 min。通过2%琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物。根据制造商的方案在Applied Biosystems StepOne-Plus Real-Time PCR System（Thermo Fisher）上进行RT-PCR，并使用GAPDH标准化mRNA水平。相对基因表达水平使用2^-△△Ct计算。每个实验均进行3次重复。

1.8 统计学分析

采用 SPSS 25.0统计软件进行分析，计量资料采用均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PFD抑制小鼠膀胱肿瘤生长

观察对照组和PFD组小鼠肿瘤生长情况，结果显示与对照组相比，PFD组小鼠肿瘤生长速率明显低于对照组（图1A，P<0.01）。用药21 d时PFD组小鼠肿瘤体积小于对照组（图1B）。至用药28 d，PFD组小鼠生存率高于对照组（图1C，P<0.05）。

2.2 PFD抑制肿瘤组织Treg细胞

免疫组织化学染色结果显示，PFD组和对照组小鼠肿瘤组织中CD3⁺和CD8⁺的细胞数量差别无统计学意义（图2A~C，P>0.05），但PFD组小鼠肿瘤组织中CD4⁺和Foxp3⁺的细胞数量均低于对照组（图2A、D、E， P<0.05）。进一步通过流式细胞学分析证实PFD组小鼠肿瘤组织中CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ 细胞数明显低于对照组（图3A~C，0.30±0.02 vs 2.49±0.02， P<0.05），且Treg相关细胞因子IL-2，IL-10和IL-35的基因表达水平均低于对照组（图3D~F，P<0.05）。

2.3 PFD对小鼠脾脏Treg细胞无明显影响

流式细胞学和PCR结果显示，两组小鼠脾脏组织中CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺的细胞数量（图4A~C，2.59±0.32 vs 2.71±0.02，P>0.05）及Treg细胞相关因子（图4D~F，P>0.05）差异均无统计学意义。

2.4 PFD对内脏器官无明显损伤

HE染色观察PFD对肝、脾、肾、心及肺组织的影响，结果发现，两组小鼠脏器均未见明显组织和细胞损伤（图5）。

3 讨论

PFD是一种多能吡啶酮类似物，已被获批用于肺纤维化的治疗^［12］。有研究表明，吡非尼酮可以改善肺癌患者的预后，减少非小细胞肺癌的转移^{［13， 14］}，说明吡非尼酮在癌症治疗中有着一定的疗效。此外，多个研究显示PFD对多种癌细胞都存在抑制作用^［15-17］，可通过抑制TGF-β通路调控尿路上皮癌细胞的迁移侵袭^［18］。我们在前期通过小鼠皮下移植瘤模型也证明了PFD可有效抑制膀胱癌的进展^［11］，本研究进一步发现了PFD调控肿瘤微环境（TIME）中Treg功能可能是其抑制膀胱癌的重要作用机制，为PFD用于膀胱癌甚至多种恶性肿瘤的治疗提供理论借鉴。

肿瘤免疫微环境是肿瘤微环境中以免疫细胞为主的特异成分，与抗肿瘤免疫密切相关^{［19， 20］}。有研究表明，PFD可以降低癌症相关成纤维细胞（CAFs）的免疫抑制能力起到抑癌作用^{［21， 22］}，但在TIME中，Treg细胞作为免疫抑制的主要效应细胞，是否受到PFD的调控尚不明确。Treg细胞是免疫系统中一种特殊的以CD25⁺FOXP3⁺为标志的T细胞亚群，其中，以FOXP3高表达的调节性T细胞（FOXP3⁺Treg）为主，这些细胞保护其自身的反应性淋巴细胞免受免疫反应，从而维持其免疫力和组织稳定性^［23］。如前所述，研究显示PFD可增强肺癌免疫治疗效果^{［8， 9］}，而Treg细胞增加有利于肿瘤对PD-1抑制剂免疫耐受^［24］。基于此，我们推测PFD增效免疫治疗可能与Treg细胞调控相关，并在本研究中初步评估了PFD对Treg细胞数量和功能的调控作用。

高FOXP3表达与膀胱癌的不良预后相关。Murai等^［25］对115例手术切除的膀胱癌组织进行免疫组化检测，结果发现肿瘤组织中FOXP3+ Treg细胞数量明显增多。FOXP3能够通过抑制Akt磷酸化影响葡萄糖转运蛋白-1（GLUT-1）的表达，抑制泛素-蛋白酶体降解促进膀胱癌低氧诱导因子-1α（HIF-1α）靶基因表达，将免疫系统与膀胱癌细胞代谢之间提供了分子基础^{［26， 27］}。此外，FOXP3⁺Treg细胞也可通过影响肿瘤微环境促进膀胱癌的进展。Koll等^［28］研究发现肌层浸润性尿路上皮膀胱癌中的Treg和巨噬细胞浓度是预后的独立预测因子，并且是TIME的重要参与者。基于以上研究结果，我们选择PFD对膀胱肿瘤Treg细胞的调控，同时我们考虑靶向免疫检查点的治疗已成为晚期和转移性膀胱癌的主要治疗策略，另一方面，本课题组既往已在小鼠肿瘤模型中证实PFD对膀胱肿瘤的抑制效果，这提示我们研究PFD对免疫细胞作用的必要性和重要意义。在本研究中，通过动物实验发现了PFD在膀胱癌治疗中的作用，机制方面PFD能有效减少Treg细胞数量并减少Treg相关细胞因子的释放。而在用药安全性方面，通过对心、肝、脾、肺等重要脏器免疫组化分析发现PFD并未引起明显的重要脏器损害，说明PFD在膀胱癌辅助治疗中的疗效和安全性，为后续药物的开发，以及联合药物治疗提供新思路。

综上所述，本研究再次证实我们既往发现的PFD对膀胱癌的抑制作用，并在此基础上，证实PFD调控Treg细胞数量和功能抗肿瘤的作用机制。本研究初步揭示PFD治疗膀胱癌的免疫调节机制，为临床上治疗膀胱癌的药物应用和预防免疫检查点抑制剂耐药提供了新的思路。

参考文献

[1] Dobruch J, Oszczudłowski M. Bladder Cancer: Current Challenges and Future Directions. Medicina (Kaunas), 2021, 57(8):749. doi：10.3390/medicina57080749

[2] Galsky MD, Guan X, Rishipathak D, et al. Immunomodulatory effects and improved outcomes with cisplatin-versus carboplatin-based chemotherapy plus atezolizumab in urothelial cancer[J]. Cell Rep Med, 2024, 5(2):101393. doi：10.1016/j.xcrm.2024.101393

[3] Xu J, Zhang H, Zhang L, et al. Real-world effectiveness and safety of RC48-ADC alone or in combination with PD-1 inhibitors for patients with locally advanced or metastatic urothelial carcinoma: a multicenter, retrospective clinical study[J]. Cancer Med, 2023, 12(23): 21159-71. doi：10.1002/cam4.6680

[4] Zhou T, Xiao Z, Lu J, et al. IGF2BP3-mediated regulation of GLS and GLUD1 gene expression promotes treg-induced immune escape in human cervical cancer. Am J Cancer Res, 2023, 13(11): 5289-5305.

[5] van Gulijk M, van Krimpen A, Schetters S, et al. PD-L1 checkpoint blockade promotes regulatory T cell activity that underlies therapy resistance[J]. Sci Immunol, 2023, 8(83): eabn6173. doi：10.1126/sciimmunol.abn6173

[6] Okato A, Utsumi T, Ranieri M, et al. FGFR inhibition augments anti-PD-1 efficacy in murine FGFR3-mutant bladder cancer by abrogating immunosuppression[J]. J Clin Invest, 2024, 134(2): e169241. doi：10.1016/j.eururo.2024.03.031

[7] 李 中, 黄 旭, 陈守峰, 等. 吡非尼酮通过抑制TGF-β1通路和炎症反应预防大鼠尿道损伤后的纤维化及狭窄[J]. 南方医科大学学报, 2022, 42(03): 411-417. doi：10.12122/j.issn.1673-4254.2022.03.14

[8] Bluestone JA, McKenzie BS, Beilke J, et al. Opportunities for Treg cell therapy for the treatment of human disease[J]. Front Immunol, 2023, 14: 1166135. doi：10.3389/fimmu.2023.1166135

[9] Saleh R, Elkord E. Treg-mediated acquired resistance to immune checkpoint inhibitors[J]. Cancer Lett, 2019, 457: 168-79. doi：10.1016/j.canlet.2019.05.003

[10] Li S, Zhang X, Pang D. Pirfenidone inhibits CCL2-mediated Treg chemotaxis induced by palbociclib and fulvestrant in HR+/HER2- breast cancer[J]. Int Immunopharmacol, 2024, 142(Pt A): 113059. doi：10.1016/j.intimp.2024.113059

[11] 陈守峰, 张舒超, 樊伟林, 等. 吡非尼酮联合PD-L1抑制剂抑制小鼠异位膀胱肿瘤的生长[J].南方医科大学学报, 2024, 44(02): 210-6. doi：10.12122/j.issn.1673-4254.2024.02.02

[12] Alsomali H, Palmer E, Aujayeb A, et al. Early diagnosis and treatment of idiopathic pulmonary fibrosis: a narrative review[J]. Pulm Ther, 2023, 9(2): 177-93. doi：10.1007/s41030-023-00216-0

[13] Zhang S, Wang Y, Luo D, et al. Pirfenidone inhibits TGF-β1-induced metabolic reprogramming during epithelial-mesenchymal transition in non-small cell lung cancer[J]. J Cell Mol Med, 2024, 28(3): e18059. doi：10.1111/jcmm.18059

[14] Yamamoto Y, Yano Y, Kuge T, et al. Safety and effectiveness of pirfenidone combined with carboplatin-based chemotherapy in patients with idiopathic pulmonary fibrosis and non-small cell lung cancer: a retrospective cohort study[J]. Thorac Cancer, 2020, 11(11): 3317-25. doi：10.1111/1759-7714.13675

[15] Shi SY, Zhao LW, Liu CB, et al. Pirfenidone promotes cell cycle arrest and apoptosis of triple-negative breast cancer cells by suppressing Hedgehog/GLI1 signaling[J]. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 2025, 398(5): 5915-25. doi：10.1007/s00210-024-03652-0

[16] Zhang J, Zhang JR, Lin RG, et al. Pirfenidone antagonizes TGF-β1-mediated gabapentin resistance via reversal of desmoplasia and the 'cold' microenvironment in pancreatic cancer[J]. Cancer Lett, 2024, 605: 217287. doi：10.1016/j.canlet.2024.217287

[17] Jamialahmadi H, Nazari SE, TanzadehPanah H, et al. Targeting transforming growth factor beta (TGF‑β) using Pirfenidone, a potential repurposing therapeutic strategy in colorectal cancer[J]. Sci Rep, 2023, 13(1): 14357. doi：10.1038/s41598-023-41550-2

[18] Kimura Y, Fujimori M, Rajagopalan NR, et al. Macrophage activity at the site of tumor ablation can promote murine urothelial cancer via transforming growth factor-β1[J]. Front Immunol, 2023, 14: 1070196. doi：10.3389/fimmu.2023.1070196

[19] Park J, Hsueh PC, Li ZY, et al. Microenvironment-driven metabolic adaptations guiding CD8⁺ T cell anti-tumor immunity[J]. Immunity, 2023, 56(1): 32-42. doi：10.1016/j.immuni.2022.12.008

[20] de Visser KE, Joyce JA. The evolving tumor microenvironment: From cancer initiation to metastatic outgrowth[J]. Cancer Cell, 2023, 41(3): 374-403. doi：10.1016/j.ccell.2023.02.016

[21] Aboulkheyr Es H, Zhand S, Thiery JP, et al. Pirfenidone reduces immune-suppressive capacity of cancer-associated fibroblasts through targeting CCL17 and TNF-beta[J]. Integr Biol: Camb, 2020, 12(7): 188-97. doi：10.1093/intbio/zyaa014

[22] Rastegar-Pouyani N, Abdolvahab MH, Farzin MA, et al. Targeting cancer-associated fibroblasts with pirfenidone: a novel approach for cancer therapy[J]. Tissue Cell, 2024, 91: 102624. doi：10.1016/j.tice.2024.102624

[23] Kang JH, Zappasodi R. Modulating Treg stability to improve cancer immunotherapy[J]. Trends Cancer, 2023, 9(11): 911-27. doi：10.1016/j.trecan.2023.07.015

[24] Exposito F, Redrado M, Houry M, et al. PTEN Loss Confers Resistance to Anti-PD-1 Therapy in Non-Small Cell Lung Cancer by Increasing Tumor Infiltration of Regulatory T Cells[J]. Cancer Res, 2023, 83(15): 2513-26. doi：10.1158/0008-5472.can-22-3023

[25] Murai R, Itoh Y, Kageyama S, et al. Prediction of intravesical recurrence of non-muscle-invasive bladder cancer by evaluation of intratumoral Foxp3+ T cells in the primary transurethral resection of bladder tumor specimens[J]. PLoS One, 2018, 13(9): e0204745. doi：10.1371/journal.pone.0204745

[26] Jou YC, Tsai YS, Lin CT, et al. Foxp3 enhances HIF-1α target gene expression in human bladder cancer through decreasing its ubiquitin-proteasomal degradation[J]. Oncotarget, 2016, 7(40): 65403-17. doi：10.18632/oncotarget.11395

[27] Basu S, Hubbard B, Shevach EM. Foxp3-mediated inhibition of Akt inhibits Glut1 (glucose transporter 1) expression in human T regulatory cells[J]. J Leukoc Biol, 2015, 97(2): 279-83. doi：10.1189/jlb.2ab0514-273rr

[28] Koll FJ, Banek S, Kluth L, et al. Tumor-associated macrophages and Tregs influence and represent immune cell infiltration of muscle-invasive bladder cancer and predict prognosis[J]. J Transl Med, 2023, 21(1): 124. doi：10.1186/s12967-023-03949-3

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