维生素A缺乏联合CCl₄诱导制备稳定的小鼠慢性肝纤维化模型

A stable mouse model of chronic liver fibrosis induced by vitamin A deficiency and intraperitoneal CCl₄ injection

摘要

目的 采用维生素A（VA）缺乏饲料饲喂联合低浓度CCl₄诱导，制备一种稳定的慢性肝纤维化动物模型。 方法 126只Balb/c小鼠随机分3组，分别给予VA正常饲料（VAN组）、500 IU/kg VA（VAD组1）及200 IU/kg VA（VAD组2）饲料饲养，4周后每组选取6只小鼠检测血清视黄醇水平；将剩余108只小鼠平均分为未造模组与造模组，每组再分为VAN组、VAD组1、VAD组2，18只/组。造模组腹腔注射5% CCl₄ 10 mL/kg，2次/周，共8周。检测血清视黄醇、ALT/AST、肝脏指数；进行肝组织HE、Masson染色、纤维化程度评分和氧化应激水平检测。 结果 饲养4周后，VAD组的血清视黄醇水平均低于VAN组，VAD组2更低（P<0.05）。CCl₄造模8周，肝脏指数及ALT/AST增高，肝脏表面有颗粒状突起，肝索结构紊乱、假小叶形成，可见大量蓝染纤维组织和纤维间隔；VAD组较VAN组更显著，但VAD组2肝脏坏死严重，假小叶纤维间隔处大量炎性细胞浸润，2只小鼠死亡。CCl₄停止给药，VAN造模组肝脏指数及ALT/AST基本恢复，肝索结构恢复正常，纤维化自发逆转；VAD造模组血清ALT/AST、肝脏大体及病理无明显变化，VAD组1仍可见肝索结构紊乱和假小叶，VAD组2腹腔黏连严重，仍可见假小叶及大量炎性细胞浸润，纤维化分期评分为3；CCl₄造模组（VAD组1）氧化损伤指标8-OHdG高于CCl₄造模组（VAN组）。 结论 以含有500 U/kg VA的饲料饲喂小鼠4周，10 mL/kg CCl₄干预8周，可获得中重度的肝纤维化模型，成功率100%，停药8周无自发逆转，可建立一种稳定的肝纤维化动物模型。

Abstract

Objective To prepare a stable mouse model of chronic liver fibrosis induced by dietary vitamin A (VA) deficiency combined with CCl₄ injections. Methods A total of 126 Balb/c mice were randomized into 3 groups for feeding with a normal VA diet or a VA-deficient diet containing 500 or 200 IU/kg VA. After 4 weeks of feeding, half of the mice in each group were given intraperitoneal injections of 5% CCl₄ (10 mL/kg, twice a week) for 8 weeks. Serum retinol, ALT/AST and liver index of the mice were examined, liver tissue pathologies were observed with HE and Masson staining, and liver fibrosis score and oxidative stress level were evaluated. Results Four weeks of VA-deficient feeding, especially at 200 IU/kg, significantly lowered serum retinol level of the mice. CCl₄ injections for 8 weeks obviously increased liver index and ALT/AST and caused obvious liver fibrosis in all the mice, but liver pathologies were more severe in the 2 VA-deficient groups; severe liver necrosis with inflammatory cell infiltration was observed in 200 IU/kg VA group, where 2 mice died. After discontinuation of CCl₄, the mice with normal dietary VA showed gradual recovery of the liver index, ALT/AST, liver cord structure and liver fibrosis; the mice with VA deficiency, however, showed no significant improvements in these parameters, and the mice with 200 IU/kg VA still had serious abdominal adhesion, false lobules and massive inflammatory cell infiltration with a fibrosis stage score of 3. The oxidative damage index 8-OHdG was significantly higher in 500 IU/kg VA group than in normal VA group after CCl₄ modeling. Conclusion Feeding with diet containing 500 IU/kg VA for 4 weeks and 10 mL/kg CCl₄ injections for 8 weeks can result in stable moderate to severe liver fibrosis in mice without spontaneous reversal at 8 weeks of drug withdrawal.

Graphical abstract

关键词

维生素A缺乏 / 四氯化碳 / 慢性肝纤维化 / 动物模型

Key words

vitamin A deficiency / CCl₄ / chronic liver fibrosis / animal models

肝纤维化是慢性肝脏损伤相关的肝脏瘢痕修复反应，是多种慢性肝病进展至肝硬化的中间过程^［1］，由多种致病因子诱发肝内结缔组织异常增生，导致肝内细胞外基质（ECM）过度沉积引起^［2］。肝纤维化和终末期肝硬化现已成为严重的全球医疗问题，但肝纤维化的发生机制目前仍未完全阐释清楚^［3］。目前通过清除病毒、抗炎、肝损伤治疗和抑制ECM的产生使其降解等成为了常见的治疗方式^［4］。

由于肝纤维化的早期阶段很难被发现，晚期逆转也无法降低肝癌的风险和严重的并发症。因此，在肝病发展过程中对各种致病因素的动物模型进行深入研究，探索出能缓解甚至逆转早期肝纤维化发展的机制和药物，对治疗肝病具有极高的价值^［5］。小鼠具有与人类基因组同源度高、易于饲养管理、价格低廉且易操作等特点而成为制备肝纤维化模型的首选^［6］。反复给予CCl₄是一种诱导毒素来介导肝纤维化模型的方式^［7］，也是最早且最广泛使用的方法之一。但只运用该方法存在造模周期长，死亡率高，稳定性差等缺点。维生素A（VA）与肝纤维化的进程密切相关，参与并维持肝星状细胞在生理条件下的静止状态^［8］和活化过程^［9，10］。本研究不只是通过传统CCl₄诱导的单一造模方式，而是采用了VA缺乏饲料饲养与腹腔注射低浓度CCl₄诱导相结合的造模方法，将VA缺乏用于新型模型的构建，探讨了不同缺乏程度对于模型构建稳定性和成功率的影响，拟构建出一种死亡率低、成功率高、稳定性和重复性好的慢性小鼠肝纤维化模型。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

126只6~8周龄的SPF级雄性Balb/c小鼠，体质量22±3 g，购于重庆医科大学动物中心［实验动物许可证号：SCXK（渝）2018-0003］。小鼠均饲养在重庆医科大学附属儿童医院动物实验中心SPF区［实验动物使用许可证号：SYXK（渝）2022-0002］。饲养环境：保持12 h昼夜节律，温度为21±2 ℃，相对湿度为40%~70%。本研究已通过重庆医科大学附属儿童医院动物伦理委员会审批要求（伦理批号：CHCMU-IACUC20210114027），实验过程中严格遵循3R原则。

1.1.2 主要仪器与试剂

VA软胶囊（星鲨制药）；CCl₄（Sinopharm）；辛癸酸甘油酯（麦克林生化科技）；盐酸塞拉嗪注射液（瑞沃德生命科技）；Masson染色试剂盒、苏木精-伊红（HE）染色液（Beyotime）；显微镜盖玻片及载玻片（BASO）；8-OHdG兔抗人多克隆抗体（Proteintech）；SP 免疫组化试剂盒（华美生物）；全自动组织脱水机（Dakewe）；病理石蜡包埋机、石蜡切片机（Leica）；正置显微镜（Nikon55i）；全自动生化分析仪（MSL）；微量移液枪（Eppendorf）；电子精密天平（PL203）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的构建及分组

首先观察确认小鼠健康状态是否良好，正常饮水和普通饲料饲养1周以适应新环境。将126只小鼠平均分为3组：VA正常组（VAN组）、VA缺乏组1（VAD组1）、VA缺乏组2（VAD组2），42只/组，称取小鼠体质量并记录。按照专利CN202210011928.4^［11］配制基础饲料。VAN组是指VA正常饲料（VA 7000 IU/kg）：在10 kg基础饲料中加入14粒（VA 5000 IU）软胶囊油剂；VAD组1是指VA缺乏饲料1（VA 500 IU/kg）：在10 kg基础饲料中加入1粒（VA 5000 IU）软胶囊油剂；VAD组2是指VA缺乏饲料2（VA 200 IU/kg）：在10 kg基础饲料中加入0.4粒（VA 5000 IU）软胶囊油剂。将上述成分混匀后，揉团做成条状，放入80~85 ℃的恒温干燥箱内烘烤3~4 h，烘烤结束冷却后放入密封袋于4 ℃冰箱保存备用。

动态观察小鼠的健康状况和机体状态，饲养4周后，随机选取6只/组小鼠检测血清视黄醇水平，共18只。将其余108只小鼠分为未造模组和造模组，54只/组，作为CCl₄诱导的模型小鼠。未造模组与CCl₄造模组各分VAN组、VAD组1、VAD组2（n=18）。将5 mL CCl₄溶于95 mL辛癸酸甘油酯，紫外照射30 min消毒备用。CCl₄造模组按10 mL/kg的剂量进行腹腔注射CCl₄，2次/周，共注射8周，造模期间保持正常饮水、按分组要求给予不同VA饲料饲养。CCl₄停药后，继续给予不同VA饲料饲养8周。

1.2.2 ALT/AST、血清视黄醇水平检测

根据上述分组给予饲料和在自由饮用纯水的条件下饲养至第4、8、12、16周结束后进行ALT/AST和血清视黄醇水平检测。随机选取6只/组小鼠，按照0.6~1.0 mg/kg的剂量肌肉注射浓度为50%的盐酸塞拉嗪注射液，麻醉后眼球取血，1500 r/min离心5 min得到血清，取70 μL血清置于生化分析仪上进行丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）的浓度检测；剩余血清使用高效液相色谱法（HPLC）进行血清视黄醇水平的检测。

1.2.3 肝脏组织大体观察及肝脏指数检测

CCl₄造模8周后，CCl₄停药后4周及8周，随机选取6只/组小鼠进行检测，按照0.6~1.0 mg/kg的剂量肌肉注射浓度为50%的盐酸塞拉嗪注射液，麻醉后以眼球采血，分离血清于-20 ℃保存备用。处死后解剖小鼠收集肝组织，观察肝脏组织大体并拍照记录。采用电子精密天平（精度0.001 g）称取各实验组小鼠的体质量和肝脏质量，计算肝脏指数。肝脏指数=肝脏质量（g）/体质量（g）×100%。

1.2.4 肝组织HE染色病理学观察

将小鼠的肝脏组织置于4%的中性多聚甲醛溶液中固定24 h，随后进行脱水、石蜡包埋、4 μm切片等处理。HE染色：组织切片依次用二甲苯I、二甲苯II脱蜡5~10 min；100%→95%→80%→75%乙醇各洗脱3 min，水洗1~2 min，沥干切片水分；苏木素染色5~20 min，水洗1~2 min，镜下观察细胞核着色深浅，推测分化时间；1%盐酸乙醇分化3~5 s，水洗1~2 min；饱和碳酸锂5~10 s，水洗1 min，沥干切片；伊红溶液染色60 s；95%→100%乙醇各洗脱2 min；二甲苯I、二甲苯II分别透明1 min，中性树胶封片置于显微镜下观察组织病理形态学变化^{［12，13］}。

1.2.5 肝组织纤维化程度评估

采用肝脏组织学METAVIR病理评分系统，对肝纤维化病理程度进行评估，共分为5个肝组织纤维化分期评分，其纤维化分期判定标准：无纤维化病变，分值计为0；汇管区纤维性扩大，但无纤维间隔形成，分值计为1；汇管区纤维性扩大，少数纤维间隔形成，分值计为2；多数纤维间隔形成，但无硬化结节，分值计为3；肝硬化，分值计为4。

1.2.6 肝组织Masson染色观察肝纤维化程度

切片常规脱蜡至水，进行Masson染色。切片入媒染液加盖浸染，置于57~60 ℃温箱内作用1 h，流水冲洗10 min。天青石蓝染色液滴染2~3 min，水洗2次，10~15 s/次。苏木素染色液滴染2~3 min，蒸馏水洗2次，10~15 s/次。酸性乙醇分化液分化数秒至组织完全变红，水洗终止分化，蒸馏水冲洗10 min。丽春红品红染色液滴染10 min，蒸馏水洗2次，10~15 s/次。磷钼酸溶液处理10~15 min。倾倒上液，滴加苯胺蓝染色液染3~5 min。弱酸溶液洗去苯胺蓝溶液，滴加弱酸工作液覆盖切片处理2 min。95%乙醇脱水30 s。无水乙醇脱水2次，第1次30 s，第2次1 min。二甲苯透明2次，1~2 min/次。中性树胶封片后置于显微镜下观察肝组织病理形态变化^{［12，13］}。根据蓝染色面积评估肝组织纤维化程度，肝组织纤维化水平（%）=Masson蓝染色面积/总面积×100%。

1.2.7 肝组织氧化应激水平的测定

检测肝组织氧化应激指标8-OHdG的表达，免疫组织化学染色采用SP法进行。切片常规脱蜡至水，经灭活、修复、封闭、一抗1∶100稀释，以PBS代替一抗作为阴性对照。二抗1∶10000稀释，结合后加DAB显色，苏木素复染，返蓝、脱水、封片。镜检为棕色则是阳性显色，8-OHdG阳性细胞主要为核膜着色。

1.3 统计学分析

使用GraphPad Prism 9.0软件进行统计分析，所有数据均为计量资料，符合正态分布且方差齐时以均数±标准差表示；多组间比较使用单因素方差分析，采用LSD-t检验进行两两比较。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠血清视黄醇水平

分组饲育4周后，VAN组小鼠精神状态好、眼睛有神、动作灵敏、皮毛光泽度好；VAD组1小鼠活动频繁，精神状态欠佳、眼神略显呆滞、毛发较粗糙、色泽偏黄；VAD 组2小鼠活动频繁，精神状态欠佳、眼神呆滞、易激怒、毛发粗糙、色泽偏黄；VAD组1和VAD组2的血清视黄醇水平均低于VAN组，其中VAD组2的血清视黄醇水平与VAN组和VAD组1差异有统计学意义（P<0.05）。

2.2 CCl₄造模8周后对小鼠血清视黄醇、ALT/AST水平及肝纤维化程度的影响

CCl₄诱导8周后VAN组和VAD组1小鼠均无死亡，VAD组2死亡2只。CCl₄造模组和未造模组的VAD组1和VAD组2的血清视黄醇水平均低于VAN组；CCl₄造模组的血清视黄醇、血清ALT/AST水平、肝脏指数和肝纤维化程度均高于未造模组（P<0.05，表1）。未造模的3组小鼠的肝脏指数无差异，在正常范围内，且无纤维化发生，分期评分为0。未造模组VAD组1的血清指标ALT正常，AST水平均高于VAN组；VAD组2的ALT、AST水平均高于VAN组和VAD组1（P<0.05）。CCl₄造模组的3组小鼠的肝脏指数、血清指标ALT、AST均有升高趋势；VAD组1和VAD组2较VAN组更显著；VAD组2的血清肝功指标ALT、AST高于VAD组1（P<0.05）；VAD组1和VAD组2纤维化程度评分为3（表1）。

2.3 CCl₄诱导8周后肝脏组织的病理变化

未造模组的小鼠大体肝脏组织未见明显差异，VAN组的肝脏组织结构正常，肝小叶完整；VAD组1和VAD组2有较多空泡产生，但是肝小叶完整，未见胶原纤维增生和纤维化。CCl₄造模组，肝脏大体标本表面可见白色颗粒状隆起，病理切片可见肝索结构紊乱、核固缩或消失，有较多岛屿状假小叶结构形成。汇管区有较多炎性细胞浸润，Masson染色门静脉周围有大量蓝染纤维组织和纤维间隔形成，肝小叶结构部分保留。与VAN组相比，VAD组1的蓝染纤维化更多且明显，有纤维间隔伴假小叶形成。VAD组2肝脏可见严重坏死，假小叶纤维间隔处有大量炎性细胞浸润（图1）。

2.4 CCl₄停药后模型稳定性评估

停药4周后，VAN组、VAD组1无死亡，VAD组2有2只小鼠死亡。未造模组的各项指标无变化，且无纤维化。CCl₄造模组的肝脏指数无变化，VAN组的血清生化指标ALT/AST较4周前有恢复趋势（表2），大体标本可见少量的颗粒状凸起，仍有纤维间隔存在。CCl₄造模组的VAD组1和VAD组2，血清视黄醇、血清ALT/AST水平、肝脏指数、肝纤维化程度各项指标，肝脏大体及病理形态学均无明显变化。其中，造模组VAD组1仍可见假小叶和肝索结构紊乱；CCl₄造模组的VAD组2腹腔黏连严重，仍可见假小叶及大量炎性细胞浸润（图2），纤维化分期评分为3。

CCl₄诱导小鼠8周后，在停止给药的第4周末~第8周末，VAN组及VAD组1无死亡，VAD组2有3只小鼠死亡，在第8周末进行各项指标的检测。未造模组的各项指标无变化，纤维化分期评分为0。CCl₄造模组的肝脏指数略有下降，VAN组的血清生化指标ALT/AST基本恢复（表3），肝脏大体表面几乎无颗粒状，肝索结构恢复正常，仅在汇管区有纤维化，几乎无纤维间隔；VAD组1和VAD组2的血清生化指标ALT/AST和肝脏组织病理形态，较停药4周无明显变化；VAD组1和VAD组2仍可见肝索结构紊乱和假小叶；VAD造模组2仍可见假小叶，但炎性细胞浸润较之前减少（图3），纤维化分期评分为3。

2.5 优选模型组肝脏氧化损伤的评估

CCl₄停药8周后进行8-OHdG肝脏氧化损伤指标的进一步验证，免疫组化染色结果显示，未造模组（VAN组和VAD组1）为阴性，无显著差异，细胞核染色未见棕黄色，单纯VA缺乏不会导致肝细胞氧化应激的改变；CCL₄造模组（VAN组）细胞核染色可见棕黄色，出现明显阳性，主要集中在汇管区；VAD组1氧化损伤程度更明显，阳性染色的细胞数更多，黄染部位在汇管区和肝实质区（图4）。

3 讨论

肝纤维化的动物模型对于深入研究肝纤维化发生发展分子生物学机制，筛选防治肝纤维化药物等具有极高价值。目前，肝纤维化动物模型的构建包括血吸虫肝纤维化模型、酒精性肝纤维化模型、营养诱发肝纤维化模型、病毒性肝纤维化模型等^［14］。其中，以CCl₄通过激活CYP450氧化酶诱导的肝纤维化模型应用十分广泛，作为最经典的造模药物，其经济性好，安全性高^［6］。在动物选择方面，大鼠因无胆囊的特殊生理结构，并不能完全排除其对肝纤维化的影响。因此，选取小鼠作为肝纤维化模型动物具备严谨度高、操作性强等优势。Balb/c小鼠具有个体差异小、基因纯和度高等优点，以CCl₄诱导Balb/c小鼠建立肝纤维化模型具备理论可行性，实验重复性强^［15］。有研究证实CCl₄诱导的小鼠肝纤维化在组织形态学，生理学、病理表现等方面与人肝纤维化最为接近，可用于肝纤维化发生发展动态和临床基础研究^［16］。CCl₄造模周期由给药途径和剂量同时决定，一般为8~16周， 将40%~60%的CCl₄溶于橄榄油以腹腔注射的方式最常见，有研究证实每隔2 d注射1次，2个月即可成功造模^［17］。用1 mL/kg的CCl₄灌胃，其死亡率为10%左右， 腹腔注射的死亡率则高达80%，大剂量注射死亡率高，小剂量造模又不易成功^［18］。有研究显示^［19］，CCl₄（40% CCl₄，2 mL/kg）联合饮用酒精，造模成功率高，但死亡率仍有7.9%~26.9%。在CCl₄造模停药后，损伤的肝脏组织有自然恢复的趋势，并不适合长周期研究。肝硬化是不可逆的病变过程，在肝纤维化药物治疗中，肝脏自发修复并不能准确判断药物的实际效果，使得肝纤维化模型的建立更加复杂，肝脏自我修复与造模死亡率构成了肝纤维化模型构建的重难点。因此，要制备一种成功率高、死亡率低、重复性好且稳定的慢性肝纤维化动物模型，对临床药物的筛选有很大帮助。

肝脏参与维甲酸代谢，维甲酸在肝脏合成，与维甲酸受体相互作用，从而控制大量肝代谢基因的表达^［20］。肝星状细胞（HSC）是VA在体内的主要储存场所，它以维生素A酯的形式储存于脂滴中，其活化可导致维甲酸存储丢失和信号失调，是肝纤维化形成的中心环节^［21］。VA调节脂质积累和基因转录，在肝纤维化发生发展过程中，储存VA的肝星状细胞分化为缺乏VA的肌纤维母细胞，参与维持HSCs在生理条件下的静止状态^［22］。专利CN 102526012 B也公开了视黄酸及其衍生物在制备治疗肝纤维化药物中的应用^［23］。有临床研究显示，病毒性肝炎，胆道闭锁，原发性胆管炎等慢性肝脏疾病患者中都普遍存在VA缺乏。当维甲酸摄入不足时，多种急性和慢性肝病会影响胆盐的产生和分泌，影响VA吸收，造成胆汁淤积和免疫功能紊乱；维甲酸释放过多时，肝损伤导致肝星状细胞活化、增殖和分化，释放VA并分泌大量的胶原蛋白和纤维连接蛋白，促进肝脏进展为纤维化^［24］。

因此，为保证血清中VA含量维持在较低水平，避免含有VA的溶剂对肝脏和体内VA水平产生影响，本研究使用的CCl₄溶液配制均采用不含VA的辛癸酸甘油酯^［25］。本研究结果显示，给予VA缺乏饲料饲喂8周后的未造模的VAD组和VAD组2，其肝小叶完整，未见肝纤维化，但肝脏中脂肪增多且有较多空泡产生。维甲酸（RA）作为VA的重要代谢产物，主要通过激活RA受体控制大量肝代谢基因的表达，它也是脂肪细胞分化的抑制剂^［20］。研究报道，肥胖患者血清中的VA水平明显低于健康对照组^［26］。研究发现，长期给予VA补充饲料的肥胖大鼠，其体质量和体脂含量均呈降低趋势；给予VA缺乏饲料，大鼠的体质量和体脂均有增长^［27］。长期喂养富含VA饲料的高胆固醇肥胖大鼠，可以纠正其血浆高密度脂蛋白水平和降低血浆胆固醇水平^［28］。VA还可影响脂质代谢，VA和维甲酸在脂肪细胞中的调控机制及作用，对临床具有积极的参考意义。现在临床治疗中仍然面临缺乏特异性药物治疗肝纤维化的问题，这一迫切需求推动了对新型肝纤维化动物模型的积极探索^［29］。现国内采用VA缺乏饲料饲喂联合低浓度CCl₄诱导造模方法的相关研究报道较少，本研究预建立一种稳定的中重度慢性肝纤维化模型。

为达到成功率高、死亡率低的稳定的肝纤维化模型的最优方案，本研究采用5% CCl₄，10 mL/kg剂量进行腹腔注射，减少高浓度CCl₄在腹腔聚积导致的严重炎症反应，以降低动物死亡率。同时，在CCl₄诱导肝纤维化模型的相同条件下，设置了VAN组、VAD组1和VAD组2，其中VAN组出现了肝纤维化模型在CCl₄停药后的自发逆转，而VAD组2由于体内严重缺乏VA，造模过程中小鼠死亡，成功率不高。近年来，肝纤维化发病机制倍受关注，普遍观点认为肝纤维化是可以逆转的。Wnt信号通路通过激活HSC参与肝纤维化的形成，而VA的活性形式ATRA可通过诱导RORa磷酸化，抑制Wnt/β-catenin信号传递从而抑制肝纤维化发生。有研究在胆道闭锁（BDL）及CCl₄诱导的肝纤维化模型中发现皮下注射VA可显著改善门脉周围炎性反应，在肝纤维化组织的 HSCs内脂滴几乎耗尽时，VA干预后获得明显改善，并减少了3种纤维化标志物的表达^［30］。腹腔注射ATRA可使CCl₄肝损伤小鼠的总存活率从26.5%提高到75.0%，血清白蛋白、总胆红素和γ-谷氨酰转肽酶水平显著改善，阻止了α-SMA阳性细胞的增殖，抑制其肝纤维化进程^［31］。本研究为避免恢复正常VA浓度饲喂，保证小鼠肝纤维化模型的稳定，在CCl₄停药后仍持续给予VA缺乏饲料饲养。氧化应激是氧化系统产生的活性氧（ROS）超越抗氧化系统的清除能力所导致的一种应激状态，过量的 ROS可造成正常肝细胞的坏死和凋亡以及 HSCs 的激活^［32］。8-OHdG作为DNA氧化损伤评估中最常用的生物标志物，其主要位于细胞核，少量位于线粒体，细胞核染色呈棕黄色为阳性表达。在CCl₄停药8周后选取中度VA缺乏的优选造模组VAD组1，做进一步肝脏氧化损伤指标的验证，其肝组织氧化损伤程度更明显。

本研究结果提示，采用含500 IU/kg的VA缺乏饲料喂养小鼠8周以上，CCl₄造模停药后持续给予VA缺乏饲料饲养，纤维化形成后不发生逆转，分期评分稳定，且造模时间短、成功率高、死亡率低、重复性好，可获得一种稳定的慢性中重度肝纤维化模型，与直接使用CCl₄造模停药后肝纤维化的可逆转相比具有明显优势；能用于较长周期的实验研究，有效应用于肝纤维化发生发展的分子机制研究，开拓新型肝纤维化治疗药物等研究领域。但本研究仅考察了造模停药8周后的情况，后续还将进一步观察长周期其肝纤维化模型的稳定性。

综上所述， 本研究以VA缺乏饲料饲养与低浓度CCl₄诱导相结合的方式，以含500 IU/kg VA的饲料喂养小鼠4周，10 mL/kg CCl₄干预8周，动物血清视黄醇浓度达到0.7~1.0 μmol/L，可获得中重度的肝纤维化模型，模型成功率为100%。血清生化指标ALT/AST及肝纤维化病理结构稳定，并伴有明显的氧化损伤，停药8周无自发逆转，可建立一种稳定的慢性肝纤维化动物模型。本研究解决了现有技术中肝纤维化动物模型造模时间较长，死亡率高，模型不稳定等缺陷，为肝纤维化小鼠模型的构建奠定了理论和实践基础，为肝病基础和临床治疗提供了新思路、新方法。

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