高表达PRELID1促进胃癌细胞上皮间质转化并与不良预后相关

High PRELID1 expression promotes epithelial-mesenchymal transition in gastric cancer cells and is associated with poor prognosis

摘要

目的 探究含PRELI域1（PRELID1）在胃癌组织中的表达水平及对患者预后和癌细胞上皮间质转化的影响与可能的调控机制。 方法 纳入115例我院在2018年2月~2023年3月接受胃癌根治术的患者，探究PRELID1在胃癌组织中的表达水平与肿瘤进展和预后的关系。使用慢病毒转染干预MGC803和AGS胃癌细胞PRELID1的表达水平，将细胞分为3组：对照组（NC）、PRELID1过表达组（LV组）和干扰组（siRNA组），分析其对细胞迁移、侵袭和上皮间质转化的影响，以及相关的分子机制。 结果 免疫组化结果显示，PRELID1在胃癌组织中的表达水平高于癌旁组织（P<0.05），且和患者的恶性进展临床参数［CEA≥5 ng/mL（P=0.007）、CA199≥37 U/mL（P=0.007）、G_3~4（P=0.001）、T_3~4（P=0.001）和N_2~3期（P=0.020）］呈正相关。依据单因素分析和Cox多因素分析的结果提示PRELID1高表达是影响胃癌5年生存期的独立危险因素（P=0.001）。CCK-8实验结果显示，过表达PRELID1促进胃癌细胞的增殖（P<0.05），而干扰PRELID1则抑制（P<0.05）；Transwell迁移和侵袭实验数据提示，过表达PRELID1上调胃癌细胞的迁移与侵袭数量（P<0.05），而干扰PRELID1则结果相反（P<0.05）；免疫印迹检测发现，过表达PRELID1增强胃癌细胞中基质金属蛋白酶（MMP）的表达（P<0.05），而干扰PRELID1则反之（P<0.05）。过表达PRELID1上调胃癌细胞中N-cadherin和vimentin的表达（P<0.05），以及下调E-cadherin的表达（P<0.05）；而干扰PRELID1则结果相反（P<0.05）。过表达胃癌细胞中PRELID1增加了p-PI3K、p-AKT和p-mTOR的表达（P<0.05），而干扰则抑制（P<0.05）；相对干扰PRELID1组的细胞，PI3K/AKT通路激活剂（740 Y-P）增加了细胞迁移和侵袭的数量（P<0.05），以及上调了N-cadherin和vimentin的表达与下调E-cadherin的表达（P<0.05）。 结论 PRELID1高表达于胃癌中且影响患者预后，其可能通过激活PI3K/AKT/mTOR通路，进而增强胃癌细胞的迁移和侵袭及上皮间质转化。

Abstract

Objective To investigate the correlation of PRELID1 with gastric cancer (GC) progression, prognosis, and epithelial-mesenchymal transition (EMT) and the underlying mechanisms. Methods We analyzed the data of 115 patients undergoing radical gastrectomy for GC in our hospital between February, 2018 and March, 2023 to explore the correlation of PRELID1 expression level in GC tissues with tumor progression and patient prognosis. In cultured GC cells, the effects of lentivirus-mediated overexpression or interference of PRELID1 were observed on cell migration, invasion and EMT. Results Immunohistochemical staining revealed significantly higher PRELID1 expression in GC tissues (P<0.001), whose expression level was positively correlated with CEA ≥5 ng/mL (P=0.007), CA199 ≥37 U/mL (P=0.007), G_3-4 stages (P=0.001), T_3-4 stages (P=0.001), and N_2-3 stages (P=0.020). Univariate and Cox multifactorial analysis showed that high PRELID1 level was an independent risk factor affecting 5-year survival of GC patients (P=0.001). In cultured GC cells, PRELID1 overexpression obviously promoted cell proliferation, migration, invasion, and the expressions of MMP2 and MMP9, and interference of PRELID1 produced the opposite changes. PRELID1 overexpression also increased the expressions of N-cadherin and vimentin and reduced the expression of E-cadherin. Mechanistic analyses showed that up-regulation of PRELID1 increased the expression of p-PI3K, p-AKT, and p-mTOR in GC cells, whereas its interference caused the opposite changes; the application of 740 Y-P, a PI3K/AKT pathway activator, significantly enhanced the migration, invasion, and EMT of GC cells with PRELID1 knockdown. Conclusion PRELID1 is highly expressed in GC and affects prognosis of the patients, and its high expression promotes migration, invasion and epithelial mesenchymal transition of GC cells possibly by activating the PI3K/AKT/mTOR pathway.

Graphical abstract

关键词

胃癌 / PRELI域1 / 预后 / 上皮间质转化 / PI3K/AKT/mTOR

Key words

gastric cancer / PRELID1 / prognosis / epithelial mesenchymal transition / PI3K/AKT/mTOR

胃癌（GC）在全球范围内是第3大常见癌症和第2大癌症相关死亡原因，且呈现发病年轻化趋势^［1-3］。尽管手术治疗和综合治疗在胃癌的治疗中取得了一些进展，但胃癌的5年生存期仍然没有显著提高，主要原因是与其复杂的发病机制有关^［4-7］。胃癌细胞的迁移、侵袭以及上皮间质转化等生物学过程在胃癌的进展中扮演了重要角色，导致了治疗难度加大和生存率的提高受限^［8-10］，这些生物学过程受到复杂的分子信号调控，深入研究该领域可以为胃癌的精准靶向治疗提供宝贵的参考^{［5， 11］}。新近的研究显示，含PRELI域1（PRELID1）有助于乳腺癌、子宫内膜癌和胶质瘤等恶性肿瘤的侵袭性以及预测患者的预后^［12-15］。尽管PRELID1在乳腺癌、子宫内膜癌和胶质瘤等恶性肿瘤中的侵袭性和预后预测作用已有报道，但其在胃癌这一高发且高度异质性肿瘤^{［3， 16， 17］}中的研究仍处于空白状态。本研究通过分析大量胃癌患者的临床病理资料和肿瘤标本，首次系统性地揭示了PRELID1在胃癌组织中的高表达特征，并明确其与患者不良预后的显著相关性。这一发现不仅填补了胃癌领域对PRELID1功能研究的空白，还为胃癌患者预后评估提供了潜在的生物标志物，为个体化诊疗策略的制定奠定了基础。

1 资料和方法

1.1 资料来源与分组

纳入病理诊断为原发性胃癌的115例在我院（2018年2月~2023年3月）接受胃根治性R0切除手术的患者。基于胃癌病理蜡块，通过免疫组化技术评估PRELID1的表达，以其表达水平的中位数为界，将患者分为高表达PRELID1组（n=53）和PRELID1低表达PRELID1组（n=52）。

1.2 临床资料采集和来源

患者一般临床资料：性别、年龄、癌胚抗原（CEA）和糖类抗原199（CA199）和肿瘤临床分期等数据来源于我院的电子病例系统。生存资料：患者术后的生存情况和死亡原因是通过电话随访采集，截止到2023年3月。胃癌病理蜡块：癌和癌旁组织蜡块来自我院病理科。本研究通过蚌埠医科大学第二附属医院伦理委员会审批（伦理批号：2024KY054）。

1.3 qRT-PCR

依据Trizol法提取胃癌组织和胃癌细胞中的总RNA，其按照逆转录试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）在梯度PCR仪（C1000 Touch，伯乐）上操作反转录为cDNA，程序如下：50 ℃ 5 min和85 ℃ 5 s；qPCR反应根据SYBR Green I嵌合荧光法试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）进行操作，上机（QuantStudio Dx，赛默飞）程序为：预变性95 ℃ 30 s；循环反应95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，40个循环。以β-actin为内参，采用2^-△△CT法计算不同基因的相对定量结果。PCR引物均由上海生工合成，引物序列如下：

PRELID1-Forward：5'-CAATGTTGCTCACTCG GTGTA-3'，PRELID1-Reverse：5'-GGTGAAGGTAGT CATGGTCTGA-3'；CDH1-Forward：5'-GATAGAGAA CGCATTGCCACATA-3'，CDH1-Reverse：5'-ACCTTC CATGACAGACCCCTTAA-3'；CDH2-Forward：5'-TG TTTGTCCTTACTGTTGCTGC-3'，CDH2-Reverse：5'-T TCTTCTTGGCGAATGATCTTAG-3'；vimentin-Forw-ard：5'-GACCTGCTCAATGTTAAGATGGC-3'，vim-entin-Reverse：5'-CAGAGGGAGTGAATCCAGATTA GTT-3'；β‑actin-Forward：5'-CATGTACGTTGCTATCC AGGC-3'，β‑actin-Reverse：5'-CTCCTTAATGTCACG CACGAT-3'。

1.4 免疫组化分析PRELID1的表达

将组织蜡块经石蜡切片制作为4 μm厚度的切片，切片经烤片、脱蜡、抗原修复、过氧化氢处理、封闭、一抗（1∶200，Proteintech）孵育，洗涤后经二抗孵育和显色。最后，切片经细胞核复染和相对积分光密度（IOD）值的测定。

1.5 干预胃癌细胞中PRELID1的对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭、上皮间质转化和移植瘤的作用和机制

1.5.1 胃癌细胞中PRELID1的干预和分组

MGC-803和AGS细胞培养于RPMI 1640完全培养基中，待细胞生长至对数期时，转染PRELID1过表达慢病毒（LV-PRELID1组）和特异性干扰慢病毒（siRNA：CCGG AGTTCCTGGGACCAAGTGT，siRNA-PRELID1组）。另外，在siRNA-PRELID1组细胞中加入PI3K/AKT通路的激活剂（740 Y-P，20 μmol/L；740 Y-P组）处理24 h后^{［18， 19］}，以及在LV-PRELID1组细胞中加入PI3K/AKT通路的抑制剂（LY294002，50 μmol/L；LY294002组）处理24 h后^［20］，收集细胞用于验证PRELID1调控胃癌细胞恶性行为的分子机制。

1.5.2 CCK8检测细胞增殖

将1×10³/孔的细胞种植于96孔板中，加入10 μL/孔的CCK8溶液，450 nm测定A_{450 nm}值。

1.5.3 Transwell迁移和侵袭实验

将含有4×10⁴细胞的200 μL无血清培养基加入Transwell小室（8.0 μm，corning）中，以及下室加入1 mL完全培养基。1 d后，小室经固定和结晶紫染色后采集图片。此外，细胞侵袭实验需在Transwell小室上层铺1层基质胶，其余步骤同上。

1.5.4 免疫印迹检测蛋白表达

使用含有蛋白酶和磷酸化蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液提取总蛋白，再经定量、变性、电泳和转膜，膜再经封闭、一抗［anti-MMP9（1∶1000，proteintech）、anti-MMP2（1∶1000，proteintech）、anti-p-PI3K（1∶1000，CST）、anti-PI3K（1∶1000，CST）、anti-p-AKT（1∶1000，proteintech）、anti-AKT（1∶1000，proteintech）、anti-p-mTOR（1∶1000，Abcam）、anti-mTOR（1∶1000，Abcam）和anti-β-actin（ZSGB-BIO，1∶1000）］和二抗孵育，以及采集图片。

1.5.5 裸鼠背部成瘤与分组

9只裸鼠（江苏集萃药康生物科技有限公司）饲养于SPF级动物房中，随机分成3组（NC、LV和siRNA），3只/组。每组裸鼠分背部接种100 μL含有1×10⁷MGC-803细胞，正常饲养治疗2周后，取检移植瘤并测量其质量和体积。

1.6 统计学方法

采用SPSS 26.0软件分析数据，计量资料表示为均数±标准差，χ ² 检验用于组间比较，t检验用于两组间比较。单因素方差分析多组间比较，Tukey多重检验法分析两组间比较。采用Kaplan-Meier曲线评估术后生存率，采用Log-rank χ ² 检验分析组间比较；采用Cox比例风险回归模型（Enter法）评估影响术后5年生存期的多因素分析^{［21， 22］}。采用受试者工作特征曲线（ROC）判断诊断价值。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 PRELID1高表达于胃癌组织中

qRT-PCR结果显示，PRELID1在胃癌中mRNA水平显著地高于癌旁组织（P<0.001，图1A）。同时，免疫组化结果发现，PRELID1在胃癌组织中的表达增高（P<0.001，图1B、C）。

2.2 PRELID1在胃癌组织中的表达量和恶性进展临床参数呈正相关

CEA≥5 ng/mL（P=0.007）、CA199≥37 U/mL（P=0.007）、G_3~4（P=0.001）、T_3~4（P=0.001）和N_2~3期（P=0.020）的胃癌患者比例在PRELID1高表达组的数量显著高于低表达组（P<0.05，表1）。

2.3 胃癌组织中PRELID1高表达影响患者预后

基于KM生存曲线分析，相对于PRELID1低表达组，高表达组胃癌患者术后5年生存率较低（P<0.001，图2A）。此外，ROC分析显示，以PRELID1相对表达量2.85为截点值，预判患者术后5年死亡的敏感性为76.67%，特异性为72.73%，曲线下面积为0.786（P<0.001，图2B）。

2.4 PRELID1在胃癌组织中的高表达是影响患者预后的独立危险因素

Cox回归模型分析显示：除了CEA≥5 ng/mL （P=0.013）、CA199≥37 U/mL（P=0.010）、G_3~4期（P=0.003）、T_3~4期（P=0.005）及N_2~3期（P=0.013）以外，PRELID1高表达也是影响胃癌患者预后的独立危险因素（P=0.001，表2）。

2.5 PRELID1促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭

通过免疫印迹验证慢病毒干预MGC-803和AGS细胞中PRELID1的表达水平（图3A）。CCK-8结果显示，过表达PRELID1促进细胞增殖（P<0.001），而干扰则抑制（P<0.001，图3B）。Transwell迁移和侵袭实验显示，过表达PRELID1组细胞的迁移和侵袭数量显著增加（P=0.040，P=0.038，图3C、D；P=0.024，P=0.014，图3C、E），而干扰组则降低（P=0.041，P=0.001，图3C、D；P=0.040，P=0.044，图3C、E）。另外，免疫印迹检测发现，迁移和侵袭相关蛋白（MMP2和MMP9）在过表达PRELID1组细胞中的表达水平升高，而干扰组则相反（图3F）。

2.6 PRELID1促进胃癌细胞上皮间质转化

qRT-PCR结果发现，过表达PRELID1促进MGC-803和AGS细胞中CDH2（P=0.007，P=0.001）和vimentin的表达（P=0.016，P=0.001），以及抑制CDH1的表达（P=0.014，P=0.003）；而干扰PRELID1则结果相反（P=0.013，P=0.019；P=0.009，P=0.002；P=0.007，P=0.011；图4A）。另外，免疫组织化学结果显示，过表达PRELID1上调N-cadherin和vimentin的表达，以及下调E-cadherin的表达；而干扰PRELID1则结果相反（图4B）。

2.7 PRELID1通过激活PI3K/AKT/mTOR通路促进胃癌细胞上皮间质转化

免疫印迹分析显示：过表达PRELID1上调MGC-803和AGS细胞中p-PI3K、p-AKT和p-mTOR的表达，而干扰PRELID1则抑制p-PI3K、p-AKT和p-mTOR的表达（图5A）。Transwell迁移和侵袭实验显示，PI3K/AKT通路激活剂（740 Y-P）增加了干扰PRELID1组的细胞迁移和侵袭数量（P=0.041，P=0.015；P=0.001，P=0.008；图5B、C），以及PI3K/AKT通路抑制剂（LY294002）减少了过表达PRELID1组的细胞迁移和侵袭数量（P=0.041，P=0.025；P=0.008，P=0.017；图5E、F）。免疫印迹检测发现，740 Y-P上调了干扰PRELID1组细胞中MMP2和MMP9的表达，以及促进了N-cadherin和vimentin的表达，且抑制了E-cadherin的表达（图5D）。

2.8 Kuwanon G抑制裸鼠移植瘤的生长

裸鼠背部成瘤实验显示，LV组中移植瘤的质量和体积显著高于NC组（P=0.006，P=0.004；图6A~C），而siRNA组中移植瘤的重量和体积小于NC组（P=0.019，P=0.020；图6A~C）。

3 讨论

胃癌的恶性行为涉及肿瘤细胞的异常增殖、迁移、侵袭以及EMT，这些过程相互交织，共同促进了胃癌的进展和转移^［23-25］。本研究通过对我院胃癌患者的临床病理资料分析，发现PRELID1高表达于胃癌组织中且影响患者的术后生存率，以及进一步通过研究发现PRELID1可激活胃癌细胞中PI3K/AKT/mTOR通路，进而促进细胞迁移、侵袭和上皮间质转化。

受子宫内膜癌、乳腺癌和神经胶质瘤中PRELID1表达研究的启发^［12-15］，我们通过我院的收治病例分析并证实PRELID1高表达于胃癌组织中。为进一步阐明PRELID1在胃癌恶性进展中作用，本文深入研究发现PRELID1高表达与胃癌患者外周血中的CEA和CA199含量，以及病理T和N分期等肿瘤进展指标^［26-28］呈正相关。在子宫内膜癌和乳腺癌中已表明PRELID1高表达影响着患者预后^{［12， 13］}，但是其在胃癌中尚未见报道，我们采用单因素和多因素分析并证实，PRELID1高表达也是影响胃癌患者5年生存期的独立风险因素。PRELID1可能作为潜在的生物标志物，有助于评估胃癌的侵袭性以及预测患者的预后，但尚不清楚其作用途径和调控机制。

PRELID1是一种包含PRELI结构域的蛋白质，PRELI结构域是一种保守的结构域，在细胞膜运输、信号转导、细胞增殖、凋亡以及癌症发展等方面具有重要作用^{［13， 14］}，但是其在胃癌细胞中的生物学功能尚不清楚。我们干预胃癌细胞中PRELID1的表达，首先观察其对增殖、迁移和侵袭的影响。CCK-8实验、Transwell迁移和侵袭实验以及免疫印迹检测金属蛋白酶水平等发现，过表达PRELID1能促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭，而干扰则抑制了细胞增殖、迁移和侵袭。上皮间质转化是指上皮细胞失去原有的极性和细胞间连接，转变为具有间质细胞特性的细胞，其在胃癌的恶性进展中扮演了关键角色，可通过多种机制促进肿瘤细胞的侵袭和迁移，以及影响远期预后^［29-31］。更进一步结果显示，过表达PRELID1促进胃癌细胞的迁移和侵袭。这些结果提示PRELID1促进胃癌细胞的上皮间质转化，进而促进细胞的迁移和侵袭，但是相关分子机制需进一步探究。

PI3K/AKT/mTOR通路在PRELID1调控胶质瘤恶性行为的起着关键作用，以及其在胃癌细胞的迁移、侵袭和上皮间质转化密切相关^{［14， 31-33］}。为了进一步阐明PRELID1在调控胃癌恶性进展中的作用，我们发现过表达PRELID1上调p-PI3K、p-AKT和p-mTOR的表达，提示PRELID1激活了胃癌细胞中的PI3K/AKT/mTOR通路的激活。更为重要的是，相对于干扰PRELID1组的胃癌细胞，PI3K/AKT通路的抑制剂增强了细胞的迁移、侵袭和上皮间质转化。该部分结果提示PRELID1促进胃癌细胞的迁移、侵袭和上皮间质转化与 PI3K/AKT/mTOR通路的激活有关。虽然本研究通过PI3K/AKT/mTOR通路的激活剂和抑制剂证明了PRELID1对胃癌细胞调控作用对该通路依赖性，但分子互作的具体机制（如结合位点、构象变化）仍需通过共免疫沉淀、点突变或结构模拟实验进一步探索，并计划在后续研究中补充这些内容。

本研究的创新性及独特性体现在以下3个方面：系统揭示了PRELID1在胃癌中的表达特征与预后价值，通过分析胃癌患者样本发现其在胃癌组织中显著高表达，并与患者不良预后密切相关，这一发现不仅填补了胃癌领域对PRELID1功能研究的空白，还为其作为胃癌预后评估的生物标志物提供了直接证据，为临床决策提供了新的参考依据；其次阐明PRELID1在胃癌中独特的分子机制，本研究首次证实其通过激活胃癌细胞中的PI3K/AKT/mTOR通路，进而促进细胞迁移、侵袭及上皮间质转化（EMT），尽管该通路在乳腺癌、胶质瘤等肿瘤中已被报道参与EMT调控，但PRELID1在此通路中的直接作用此前未在胃癌中被发现；拓展了PRELID1的生物学功能并提出潜在治疗靶点，此前研究主要关注PRELID1在其他癌症（如乳腺癌）中的血管生成或代谢调控作用，而本研究首次揭示其在胃癌中通过调控EMT和侵袭性表型促进肿瘤进展，这为胃癌靶向治疗提供了全新的分子靶点，这一发现不仅深化了对PRELID1功能的理解，还可能为开发胃癌特异性治疗策略（如针对PI3K/AKT/mTOR通路的抑制剂联合应用）提供理论依据。综上，本研究通过填补胃癌领域对PRELID1研究的空白，揭示了其独特的分子机制和临床意义，为胃癌的精准诊疗提供了重要科学依据。

综上，本文发现PRELID1在胃癌中高表达，且预后相关，其可能通过激活胃癌细胞PI3K/AKT/mTOR通路，从而促进细胞的迁移、侵袭和上皮间质转化。

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基金资助

蚌埠医科大学自然科学重点项目(2023byzd103)

安徽省高校自然科学研究重点项目(2023AH051974)

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