ELFN1高表达是结肠癌的预后生物标志物并促进结肠癌细胞的增殖转移

High expression of ELFN1 is a prognostic biomarker and promotes proliferation and metastasis of colorectal cancer cells

摘要

目的 探讨细胞外富含亮氨酸重复序列和纤连蛋白III型结构域的蛋白质1（ELFN1）在结肠癌中的表达、临床预后、基因功能、信号通路和生物学表型。 方法 运用R语言，通过公共数据库TCGA、GEO数据库分析33种癌谱ELFN1表达水平，并鉴定结肠癌中ELFN1的差异基因，通过基因功能注释和富集分析鉴定其相关信号通路；分析并评价ELFN1表达与临床病理特征的相关性；qPCR及Western blotting验证ELFN1在细胞株以及肠癌组织中的表达水平；Transwell、EDU实验分析ELFN1在SW480细胞的生物学表型。 结果 ELFN1在14种肿瘤中高表达，结肠癌中ELFN1的表达高于癌周组织（P<0.001）；临床特征与预后分析结果显示，ELFN1 mRNA高表达的患者OS较差；Cox回归分析显示，ELFN1表达是OS的独立预后因素（P<0.05）；ELFN1在肿瘤转移增殖中显著富集，进一步GSEA分析识别了与之相关的肿瘤信号通路；实验分析结果显示，肠癌细胞系ELFN1的表达水平高于正常细胞（P<0.05）；细胞功能实验显示，敲低ELFN1可阻止肠癌SW480细胞增殖和转移（P<0.05）。 结论 ELFN1在结肠癌中异常高表达，并代表了不良的临床预后；并与肠癌增殖转移表型相关，提示ELFN1可能为结肠癌的预后标记物。

Abstract

Objective To explore the correlation of ELFN1 expression level with prognosis of colorectal cancer and its regulatory role in colorectal cancer cell proliferation and metastasis. Methods We analyzed the expression levels of ELFN1 across 33 cancer types using publicly available databases and identified differential genes related to ELFN1 in colorectal cancer. Gene function annotation and enrichment analysis were used to identify the involved signaling pathways. Logistic analysis, Kaplan-Meier analysis and Cox regression analysis were performed to evaluate the correlation between ELFN1 expression and clinicopathological parameters and survival of colorectal cancer patients. qPCR and Western blotting were used to validate the expression levels of ELFN1 in different colorectal cancer cell lines and tissues, and Transwell and EDU experiments were carried out to assess the effect of ELFN1 knockdown on biological behaviors of SW480 cells. Results ELFN1 was highly expressed in 14 cancers, and its expression was significantly higher in colon cancer tissues than in adjacent tissues. A high expression of ELFN1 mRNA was associated with a poorer overall survival of colorectal cancer patients. Cox regression analysis indicated that ELFN1 expression was an independent prognostic factor for overall survival of the patients. ELFN1 was significantly enriched in tumor metastasis and proliferation and participated in several tumor signaling pathways. The colon cancer cell lines showed significantly higher expression levels of ELFN1 than normal cells, ELFN1 knockdown obviously inhibited proliferation and migration of SW480 cells in vitro. Conclusion ELFN1 is overexpressed in colorectal cancer and is associated with poor clinical prognosis of the patients. A high ELFN1 expression is associated with malignant phenotypes of colorectal cancer and promotes cancer cell proliferation and metastasis, suggesting its potential as a prognostic biomarker for colorectal cancer.

Graphical abstract

关键词

结肠癌 / ELFN1 / ECM信号通路 / 临床预后 / 生物信息学

Key words

colorectal cancer / ELFN1 / ECM signaling pathway / clinical prognosis / bioinformatics

细胞外富含亮氨酸重复序列和纤连蛋白III型结构域的蛋白质1（ELFN1）是一个蛋白质编码基因，编码的蛋白ELFN1属于富含亮氨酸重复序列（LRR）神经元粘连蛋白家族，是一种跨膜重复的突触后蛋白，在神经系统中扮演重要角色，参与神经细胞和视杆双极细胞等细胞突触形成的信号转导^［1］。多项研究表明ELFN1与Ⅲ型代谢型谷氨酸受体（mGluR）相互作用调节中间神经元突触的发生与释放^［2］，并与发育性和癫痫性脑病^［3］和失用症、创伤后应激障碍等神经系统疾病相关^［4］。然而，ELFN1在癌症相关疾病中的作用鲜有报道，目前的研究主要集中位于ELFN1反义位置的长链非编码RNA（lncRNA）ELFN1-AS1，研究表明ELFN1-AS1在多种肿瘤如视网膜母细胞瘤^［5］、卵巢癌^［6］、食管癌^［7］、胰腺癌^［8］、结直肠癌^［9］中发挥作用，并与患者总生存率降低密切相关^［10］，可促进结直肠癌的生长、增殖、侵袭及肿瘤耐药，可作为结直肠癌诊断生物标志物和药物治疗靶点^［11］。但目前关于ELFN1的生物学功能未见进一步研究，其中发挥的作用机制亦尚未见报道，在结肠癌中的作用机制仍待进一步挖掘。本研究旨在通过公共数据库结合实验，通过癌症基因组图谱计划（TCGA）、基因表达综合数据库（GEO）等数据集，应用生物信息学方法分析ELFN1在结肠癌中的表达、临床相关性及生存预后相关性。使用基因富集分析（GSEA）分析挖掘ELFN1可能参与的信号通路，揭示其在结肠癌中发生发展中的分子机制，以期提供一种新的候选基因来改善结肠癌的预后和生存率。

1 材料和方法

1.1 生物信息学分析

本研究所包含的RNA-seq数据及临床病理信息数据均来自于TCGA数据库。RNA-seq数据从FPKM格式转换为每百万次读数的转录本格式。本研究根据TCGA指南进行，并在数据收集之前获得知情同意。纳入标准的数据集应包括结肠癌样本组和对照样本组（健康组织、相邻的非癌组织），每组至少包含10个样本。最后选择纳入GSE23878、GSE9348、GSE83889基因表达谱。采用R4.2.1用于初始转换数据归一化，并统计分析与可视化。

1.2 结肠癌中ELFN1的临床预后分析

通过ROC曲线分析比较结肠癌肿瘤与癌旁组织中的表达，检验ELFN1对结肠癌诊断的预测价值。采用R4.2.1软件对生存资料进行统计分析。

1.3 整合差异表达基因（DEGs）筛选并构建PPI网络

将ELFN1（cut-off值=50%）分为低表达和高表达组，整合项目中 level3 HTSeq-Counts格式的RNAseq数据，使用R包DESeq2（2.26.0）用来鉴定DEGs，通过R包ggplot2（4.3.3）进行热图可视化展示。通过STRING数据库分析ELFN1蛋白列表中的分子互作情况构建蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPI），并展示蛋白网络互作关系，使用R包igraph 进行可视化。

1.4 ELFN1功能通路及GSEA分析

对ELFN1 进行基因本体（GO）功能注释和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。统计分析和可视化均在R4.2.1中进行。Cluster Profiler4.14.3包用于富集分析，ggplot2包用于可视化。使用R包clusterProfiler进行GSEA以阐明高ELFN1组和低ELFN1组之间的显著功能和通路差异。数据集来源于MSigDB数据库，以调整后的dp<0.05、错误发现率<0.25和标准化富集评分（|NES|）>1为显著富集。

1.5 细胞培养与RNA提取

人肠上皮细胞NCM460于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养，人肠癌SW480、RKO、HCT116、LOVO、HT29均于10%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养，所有细胞均处于37 ℃、5% CO₂、95%湿度培养箱中孵育培养，细胞均由中科院细胞库提供。

按照试剂盒说明，使用TRIzol试剂（TaKaRa）从组织中提取总RNA。使用PrimeScriptRT逆转录试剂盒（TaKaRa）。SYBR绿色PCR试剂盒（TaKaRa）检测分离的RNA数量。qRT-PCR采用CFX-96连接实时荧光定量系统（Bio-Rad）进行。引物序列来自于上海捷瑞生物科技有限公司，所用引物序列：5'-CTACCTCATGAA GATCCTCACCGA-3'（β-actin， Forward）；5'-TTCTCC TTAATGTCACGCACGATT' （β-actin， Reverse）；5'-G CCCTGTGCCGATGATGAG'（ELFN1， Forward）；5'-G GCCGAGTTCTGAGTGAGC-3' （ELFN1， Reverse）。

1.6 Western blotting分析

SW480细胞使用含有PMSF（1 mmol/L）的RIPA裂解缓冲液裂解。蛋白裂解物在高温下变性，并通过10%的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。用5%的脱脂牛奶封闭后，加入了一抗混合液（Proteintech β-actin，1∶1000），在4℃下孵育过夜，然后加入二抗（Mouse、Rabbit二抗，Proteintech，1∶2000）在室温下孵育2 h。使用Western blotting-ECL（Merck）试剂孵育膜，并使用Chemidoc XRS+成像系统进行成像。

1.7 siRNA转染

siRNA及序列设计均来自于上海（罗氏）捷瑞生物科技有限公司；使用siRNA转染试剂进行操作，接种细胞至30%~40%汇合度，使用Opti-MEM 培养基稀释siRNA转染试剂，充分混匀，使用Opti-MEM培养基稀释ELFN1-siRNA，制备预混液，充分混匀。加入siRNA复合物至培养基中37 ℃孵育细胞2~4 d，分析转染细胞。所用ELFN1-siRNA序列：5'-GCGAGGUGG AGCAGUACAATT-3'；5'-UUGUACUGCUCCACCU CGCTT-3'（#1）；5'-AGACCAUCAUCGAGCUCAATT-3'；5'-UUGAGCUCGAUGAUGGUCUTT-3'（#2）。

1.8 细胞功能Transwell migration分析及EDU实验

转染48 h后，将100 μL含有2×10⁴个细胞的培养基接种到Transwell插入物的上室中，并在下室插入物中加入含有20%胎牛血清的600 μL培养基（8.0 μm，康宁）。培养48 h后，使用冰冷的甲醇固定细胞20 min，采用结晶紫溶液染色25 min。细胞增殖使用EDU-555荧光标记检测。2×10⁵个细胞在6孔板中培养，并转染48 h。EDU标记2.5 h。反应溶液被制备并染色，并在荧光显微镜下拍照。

1.9 统计学方法

采用GraphPad Prism 8.2进行数据统计分析。Western blotting、RT-PCR、EDU实验、Transwell实验均采用两样本的配对t检验，检验前进行方差齐性检验；若方差齐，采用t检验。结肠癌患者的临床预后信息包括总生存期（OS）采用Kaplan-Meier（K-M）分析，预后分析采用单因素和多因素Cox回归分析。采用单变量Logistic回归分析ELFN1的表达水平与临床特征的关系。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ELFN1在肿瘤中的差异表达及预后情况

TCGA数据库显示，ELFN1的mRNA水平在33种肿瘤类型中存在表达差异，ELFN1在宫颈鳞状细胞癌和宫颈管、胆管癌、肾脏嫌色细胞癌等6种肿瘤中低表达，而在14种肿瘤中高表达，胃肠道肿瘤包括胃癌、结肠腺癌、直肠腺癌等（图1A）。配对样本也显示ELFN1在结肠癌等肿瘤中的高表达（图1B）。分析ELFN1在具有差异表达肿瘤中的预后情况，发现其在肝癌、胃癌、结肠癌中具有预后意义（图1C，HR>1，P<0.05）。

2.2 ELFN1在结肠癌中的诊断价值及表达情况

对配对样本中的ELFN1差异表达基因集合（P<0.05）、ROC曲线下面积（AUC）>0.8基因集、总生存期（OS）的差异基因集（P<0.05）三者取交集，结果显示，COAD具有3项特征（图2A）；AUC为0.851（95%CI：0.794~0.908，图2B）。在TCGA配对样本（n=41）及GEO数据库多个数据集（GSE23478、GSE9348、GSE83839）中相互验证了ELFN1在结肠癌中高表达（图2C~F）。

2.3 COAD中ELFN1的表达与临床预后分析

K-M生存分析结果显示，高表达ELFN1的患者表现出更差的总生存期OS（HR=1.81，95%CI： 1.22~2.70，P=0.003）、疾病特异性生存期DSS（HR=2.53，95%CI： 1.48~4.33，P<0.001）和无进展间期PFI（HR=1.96，95%CI： 1.26~3.03，P=0.003，图3A~C）。进一步对ELFN1在不同临床病理特征的COAD患者中的表达分析发现，ELFN1 mRNA高表达与N分期（图3D）、M分期（图3E）、肿瘤病理分期（图3F）、化疗结局（图3G）、外周神经侵犯（图3H）以及淋巴结转移（图3I）相关（P<0.05）。单因素及多因素的Cox回归分析结果显示：ELFN1表达水平、年龄、M分期、病理分期是总生存期OS的独立预后因素（P＜0.05，表1）。Logistic回归分析结果显示，ELFN1高表达在N分期、M分期、肿瘤病理分期、淋巴结转移、化疗不良结局以及外周神经侵犯具有高风险比（表2）。

2.4 ELFN1在TCGA差异表达基因及共表达基因

ELFN1高低表达样品中的差异表达基因结果以火山图展示（图4A）。共鉴定出874个差异表达基因，其中504个基因上调（logFC为正），370个基因下调（logFC为负）；共表达和弦图显示了与ELFN1正负相关的前10位基因（图4B）。通过构建PPI，与ELFN1相关的互作编码蛋白基因（图4C）。

2.5 ELFN1功能注释富集及GSEA通路分析

GO功能注释结果包括：细胞外基质组织、含胶原蛋白的细胞外间质、细胞外间质结构成分、生长因子结合、G蛋白偶联肽受体活性等（图5A）。KEGG信号通路主要结果包括转化生长因子-β（TGF-β）信号通路、黏着、ECM-受体相互作用、细胞黏附分子（图5B）。基于以上结果GSEA识别与ELFN1正相关的信号通路包括：Ras信号通路、MAPK信号通路、IL-18信号通路、癌症通路、PI3K-Akt信号通路（图5C）；负相关通路：G2/M期检查点、DNA修复、DNA甲基化、Notch信号通路和Wnt信号通路（图5D）。

2.6 ELFN1在结直肠癌细胞系中的表达及其对SW480细胞的促增殖、迁移作用

qRT-PCR和Western blotting结果显示，ELFN1在癌细胞系中的mRNA及蛋白表达水平均高于正常细胞，其中SW480结肠癌细胞系中ELFN1的表达水平更高（P＜0.01，图6A、B）。在10对结肠癌组织样本中的结果也相同（图6C）。进一步对SW480细胞进行了敲低ELFN1处理，Transwell细胞迁移能力检测结果提示：敲低ELFN1可降低两组SW480细胞的迁移能力（图6D）；同样地，EDU结果显示ELFN1低表达组的细胞增殖能力减弱（图6E）。

2.7 ELFN1促进结肠癌发展的分子机制

ELFN1在结肠癌发生发展相关信号通路：ECM信号通路、TGF-β信号通路、细胞粘附信号通路高度相关（图7A）。Western blotting结果显示，敲低处理ELFN1后E-钙粘蛋白蛋白水平上调，NF-κB、TGF-β蛋白水平随之下降（P<0.05，图7B）。

3 讨论

结肠癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，发病率逐年呈上升趋势^［12］。目前对COAD的病因和发病机制认识有限，以及缺乏早期诊断指标和有效的治疗靶点^［13］。因此，有必要发现新的生物标志物，阐明COAD的潜在分子机制。本研究旨在对ELFN1在COAD中的表达、临床意义及功能进行验证和探讨。ELFN1作为定位在细胞核内的蛋白编码基因，属于LRR家族蛋白，在神经元组成和信号传导等方面有重要的作用^［14］。然而，关于ELFN1以往的研究主要关注其在神经元方面的功能，在肿瘤中的表达丰度及临床特征尚未报道。本研究首次报道了ELFN1在不同肿瘤中的表达水平及在结肠癌中的临床特征及预后意义，在结肠癌肿瘤中ELFN1表达显著增加，与结肠癌的临床N分期、M分期、晚期病理分级、肿瘤转移相关，并且是结肠癌OS的独立预后因素，ELFN1可能是一个很好的诊断标志物，可能与结肠癌的恶性程度有关。SW480细胞功能验证了ELFN1可以促进结肠癌细胞的增殖、迁移能力，ELFN1除了编码ELFN1蛋白还有其上游长链非编码RNA（lncRNA）在各种肿瘤中发挥了重要的作用，例如，ELFN1-AS1 通过多种机制对结肠癌细胞发挥了促增殖、抗凋亡和促迁移的功能^［15］，并在介导肿瘤免疫逃逸及结直肠癌化疗耐药发挥了重要的作用^［16］，基于此前研究可见，ELFN1的研究已从神经科学拓展至肿瘤生物学和免疫治疗领域。其在耐药性、代谢重编程及免疫微环境调控中的核心作用值得进一步挖掘。

既往研究显示，ELFN1以跨突触调节III组mGluR而闻名^［17］，如mGluR4^［18］在胰腺癌、胶质瘤等肿瘤中已被证实通过MAPK/PI3K^［19］通路促进细胞存活。ELFN1作为其跨突触调控因子，可能通过神经-内分泌机制影响肿瘤微环境中的癌细胞^{［20，21］}。此外，LRR蛋白与细胞粘附或迁移有关，常参与Wnt信号调控，从而影响肿瘤转移^［22］。例如，结直肠癌中LRP5/6等LRR蛋白的异常激活并通过Wnt/β-catenin信号通路影响β-catenin核转位从而促进癌细胞增殖、迁移^{［23，24］}。虽然在肿瘤中研究甚少，但最新的研究报道了ELFN1参与细胞外基质（ECM）的黏附调控^{［25，26］}，ECM作为肿瘤微环境中的重要组成部分，不但为肿瘤提供物理支撑条件，还通过多种信号通路影响肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和血管生成等行为^［27］。

本研究的生信研究证实了其在结肠癌中高表达有显著特异性，并与肿瘤恶性进展相关；在功能富集分析中，ELFN1参与多种致癌通路，而ELFN1在结肠癌的增殖、转移通路显著富集，在结肠癌细胞SW480的实验中也验证了敲低ELFN1可以降低其增殖、转移能力，这一肿瘤表型与富集分析的结果相一致。而对于ELFN1是通过何种机制影响结肠癌的发生发展，进一步研究发现ELFN1可能在ECM通路、TGF-β信号通路、细胞粘附信号通路发挥了重要的作用，这提示ELFN1可能是通过这些通路影响结肠癌的增殖及转移。有研究表明ELFN1富含LRR结构，此外，ELFN1还具有纤连蛋白III型结构域（FN3）^［27］，这两种结构域的形成可以使ELFN1能够与ECM相关成分如胶原蛋白、纤连蛋白相结合，这为ELFN1促进结肠癌转移提供了结构上的条件。在肠癌细胞上，FN3能够促进细胞运动，它与细胞表面受体结合后，会改变细胞骨架的结构和动力学，使细胞能够更有效地伸展和收缩，从而实现迁移^{［28，29］}。此外，ELFN1的特殊结构还可能与跨膜蛋白结合，如整合素，细胞表面的整合素受体结合激活后，会引发一系列的细胞内信号转导事件^［30］。其中，PI3K-AKT-mTOR信号通路被激活是关键环节。PI3K被激活后，会促使AKT蛋白磷酸化，进而激活下游的mTOR，mTOR作为细胞生长和代谢的关键调节因子，能够促进蛋白质合成、细胞周期进展，最终加速肠癌细胞的增殖^［31］。同时，结果中的TGF-β信号通路在结肠癌中也发挥着重要的作用，TGF-β是一个多功能的细胞因子，在肿瘤发生、免疫调节、干细胞分化等多个过程中发挥作用^［32］，ECM与TGF-β信号通路之间存在着复杂的双向调控关系，TGF-β诱导癌症相关成纤维细胞（CAFs）分泌过量ECM，形成纤维化间质，促进肠癌的侵袭和化疗耐药^{［33，34］}。总而言之，肿瘤的ECM重构、基质细胞浸润以及ECM纤维生成引起肿瘤细胞侵袭转移已有很多研究，但是仍有许多问题未被解决。因此，ELFN1有潜力作为一个靶向ECM开发的药物靶点，并对于理解ECM动态调控提供了新视角，也为开发靶向ECM-信号轴的抗肿瘤疗法提供新的思路。

综上所述，本研究分析了ELFN1在结肠癌中的重要预后价值，ELFN1可能具有极大潜力作为诊断结肠癌的肿瘤标记物，在肿瘤诊断、预后评估及靶向治疗中展现出重要价值。在机制方面，ELFN1可能在ECM信号通路中作为调节细胞-基质相互作用的分子，促进肠癌细胞增殖转移，而其在肿瘤中的异常表达可能通过干扰这些信号通路促进疾病进展。但其机制复杂性，需要多组学整合明确ELFN1在肿瘤-基质-微环境三元互作中的精确角色。总之，ELFN1可能是一种新的结肠癌预后预测因子，可为结肠癌的早期诊断以及发生发展机制提供新的靶点。尽管本研究初步揭示了ELFN1作为结肠癌预后标志物的潜力，并为其早期诊断及肿瘤发生发展机制的研究提供了新的靶点，但研究仍存在局限性：依赖于生物信息学分析的前期研究需要通过实验方法加以验证，未来应着重于通过实验对ELFN1在结肠癌组织中的表达水平及其与预后的关系进行深入探究；同时收集和分析更多临床样本数据，以期构建更为精确的预后预测模型。本研究对ELFN1在结肠癌发生发展中的分子机制的研究亦不够深入，包括对ELFN1的上下游信号通路、相互作用蛋白以及调控网络的探索，仍需开展更为深入的实验验证和临床数据分析，通过综合实验验证、临床数据分析和机制探索，有望为结肠癌的精准诊断和治疗提供更为科学和有效的理论依据。

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