天麻钩藤饮通过抑制坏死性凋亡通路改善帕金森病小鼠的运动功能障碍

Tianma Gouteng Granule improves motor deficits in mouse models of Parkinson's disease by regulating the necroptosis pathway

摘要

目的 利用网络药理学分析、分子对接分析及动物实验验证探讨天麻钩藤饮（TGY）对1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）诱导的亚急性帕金森病（PD）模型小鼠的运动功能障碍及分子机制的影响。 方法 90只8周龄C57BL/6小鼠随机分为6组（n=15）：对照组、模型组、模型+坏死性凋亡抑制剂NEC-1组（6.5 mg/kg）、模型+不同剂量的天麻钩藤饮治疗（TGY-L组2.5 g/kg；TGY-H组5 g/kg）、模型+阳性对照美多芭组（76 mg/kg）。采用连续5 d腹腔注射MPTP （30 mg/kg）构建亚急性PD小鼠模型。随机选取小鼠进行运动能力测试（n=6）；Western blotting检测小鼠纹状体中酪氨酸羟化酶（TH）和α-突触核蛋白（α-syn）、坏死性凋亡相关蛋白受体相互作用蛋白1（RIPK1）、RIPK3和混合谱系激酶域样（MLKL）及磷酸化的表达情况（n=4），并基于网络药理学和分子对接分析方法对天麻钩藤饮调控坏死性凋亡治疗PD的关键靶点进行预测。 结果 与对照组相比，PD组小鼠出现运动功能障碍，α-syn表达增加（P<0.001），TH蛋白表达下降（P<0.001）。连续6 d的NEC-1治疗后运动功能得到改善，p-RIPK1/RIPK1、p-RIPK3/RIPK3、p-MLKL/MLKL和α-syn表达减少（P<0.05或P<0.001），以及TH表达增加（P<0.01）。网络药理学预测结果显示天麻钩藤饮可调控坏死性凋亡通路中的RIPK1来改善神经退行性疾病，且分子对接结果表明天麻钩藤饮中的化合物与RIPK1存在相互作用。动物实验结果证实，低、高剂量的天麻钩藤饮改善了PD小鼠的运动功能障碍，增加TH表达（P<0.01），降低α-syn和坏死性凋亡通路相关蛋白表达水平（P<0.05或P<0.01）。 结论 天麻钩藤饮通过抑制坏死性凋亡通路，促进TH蛋白表达和减轻α-syn蓄积，进而改善PD小鼠的运动功能障碍。

Abstract

Objective To investigate the effects of formulated granules of Tianma Gouteng Yin (TGY) on motor deficits in a mouse model of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)-induced subacute Parkinson's disease (PD) and explore the possible molecular mechanisms. Methods Ninety C57BL/6 mice were randomized equally into 6 groups, including a control group, a PD model group, a NEC-1 (6.5 mg/kg) treatment group, two TGY treatment groups at 5 and 2.5 g/kg, and a Madopar (76 mg/kg) treatment (positive control) group. Mouse models of PD were established by intraperitoneal injection of MPTP (30 mg/kg) for 5 consecutive days with the corresponding treatments for 15 days. The mice were randomly selected for motor function tests. Western blotting was used to detect the changes in expressions of TH, α-syn, RIPK1, RIPK3 and MLKL in the striatum of the mice. Network pharmacology analysis and molecular docking studies were performed to explore TGY-mediated regulation of the necroptosis pathway for PD treatment. Results Compared with those in the control group, the PD model mice exhibited obvious motor deficits with significantly increased α-syn protein expression and lowered TH protein expression in the striatum. Treatment with NEC-1 obviously improved motor deficits, inhibited the necroptosis pathway, and alleviated the changes in TH and α‑syn proteins in PD mice. Network pharmacology and molecular docking analyses suggested that the therapeutic effect of TGY in PD was associated with the modulation of RIPK1, a key protein in the necroptosis pathway. In PD mouse models, TGY treatment at the two doses significantly improved motor deficits of the mice, increased TH expression, and decreased the expressions of α-syn and necroptosis-related proteins in the striatum. Conclusion TGY can effectively inhibit the necroptosis pathway, increase TH expression and decrease α-syn expression in the striatum to improve motor deficits in PD mice.

Graphical abstract

关键词

帕金森病 / 天麻钩藤饮 / 运动功能障碍 / 坏死性凋亡

Key words

Parkinson's disease / Tianma Gouteng Yin / motor deficits / necroptosis pathway

帕金森病（PD）是中老年人多发的以静止性震颤等运动症状为主要临床表现的第二大神经退行性疾病。随着全球老年人数量的不断增加，导致PD的发病率不断增长，据统计，中国现存PD患病人数超过500万例^［1］，患病人数约占全球患病人数的43.14%，因PD导致死亡的人数约占全球因PD导致死亡人数的23.71%。PD患者会出现震颤、肌强直、姿势平衡障碍等，造成独立生活能力的丧失和跌倒风险的增加，不仅对患者本人造成身体上和心理上的严重障碍，还会给家庭和社会带来巨大的负担。然而，PD的具体发病机制尚未完全明确，且缺乏有效的根治方法。临床上多采用美多芭（多巴丝肼片）和手术治疗，以对症治疗为主，但药物引发“剂末现象”和“开关现象”等不容忽视的不良反应，以及昂贵的手术费用限制了其应用范围。坏死性凋亡是一种不依赖半胱天冬酶活性的由受体相互作用蛋白1（RIPK1）启动的与炎症密切相关的程序性死亡形式^［2］。炎症反应在PD发病机制中作用备受关注，炎症反应可以诱导不同形式的细胞凋亡发生，进而导致多巴胺能神经元的广泛丢失^［3］。在PD患者的尸检结果中发现，黑质中坏死性凋亡关键蛋白RIPK1、RIPK3和混合谱系激酶域样蛋白（MLKL）的表达水平比健康对照个体中显著增加^［4］，提示坏死性凋亡途径在PD运动障碍进展中发挥重要作用。本团队前期研究表明MPTP诱导的PD小鼠海马中坏死性凋亡通路异常激活，导致PD小鼠出现认知功能障碍^［5］。但是，坏死性凋亡在PD运动功能障碍发病机制中的作用尚不清楚。天麻钩藤饮是由天麻、钩藤等11味中药配伍组成中药方剂，常用于治疗代谢和炎症相关的疾病^{［6， 7］}，具有抗炎、抗氧化、保护神经元的作用。已有研究表明天麻钩藤饮可通过减轻Aβ聚集和神经炎症，改善阿尔兹海默病模型小鼠的认知功能障碍^［8］。体外研究表明，天麻素和异钩藤碱联合使用可以提高MPP⁺诱导的PC12细胞抗凋亡能力^［9］。虽然临床研究显示天麻钩藤饮对PD具有治疗作用^{［10， 11］}，但是天麻钩藤饮治疗PD的神经机制尚不清晰，特别是坏死性凋亡途径是否参与天麻钩藤饮改善PD运动功能障碍的机制尚未有研究报道。鉴于PD治疗的迫切需求及现有疗法的局限性，构建符合中医证候属性的PD模型，深入探索天麻钩藤饮的治疗机制，对推动中药现代化研究具有重要意义。因此，本研究采用MPTP诱导的亚急性PD小鼠模型，通过网络药理学、分子对接和动物实验验证，探讨天麻钩藤饮治疗PD的潜在机制，为天麻钩藤饮的临床应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 动物

8周龄雄性SPF级C57BL/6小鼠90只［三峡大学公司，实验动物生产许可证号：SCXK（鄂）2022-0012，实验使用许可证号：SYXK（鄂）2021-0087］。将小鼠按照每笼2~4只的数量进行随机分笼。饲料、垫料均严格按国家啮齿类动物标准，由湖北省实验动物研究中心提供。自由饮水摄食，定期更换垫料，饲养间保持通风且温度控制在23±2 ℃，湿度控制在50%~60%，设定12 h光照/12 h黑暗的光暗循环周期。正式实验前所有实验小鼠适应性饲养1周。动物实验已获得武汉体育学院动物管理伦理委员会批准（伦理批号：S0087-20231206-02）。

1.2 药物及试剂

天麻钩藤饮（成都九芝堂金鼎药业有限公司，成分：天麻、钩藤、石决明、栀子、黄芩、牛膝、盐杜仲、益母草、桑寄生、首乌藤、茯苓）。辅料：糊精。将天麻钩藤颗粒用热水溶解，现配现用，使用剂量分别为：天麻钩藤饮低剂量2.5 g/kg，天麻钩藤饮高剂量5 g/kg。

1.3 主要仪器

脱色摇床、涡旋混合器、掌上离心机（Servicebio）；移液枪（Dragon）；化学发光成像仪（上海勤翔）；垂直电泳仪（北京市六一仪器厂）；转膜仪器（海天能科技）；低温高速离心机（Eppendorf）；酶标仪（赛默飞）；超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技）。

1.4 网络药理学方法

1.4.1 天麻、钩藤、坏死性凋亡作用靶点获取和交集的Venn图构建以及PPI网络的构建

在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）、SwissTarget Prediction（http：//www.swisstargetprediction）等数据库中找出中药成分，PubChem（https：// www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）获取天麻、钩藤的多种格式结构文件，通过GeneCards（https：//www.genecards.org）、SwissTarget Prediction等数据库获取天麻、钩藤的药物成分的作用靶点，并通过GeneCards获取坏死性凋亡基因。将天麻钩藤饮成分作用靶点、坏死性凋亡靶点数据集输入Venn图在线工具（http：// www.bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），识别交集靶点去除重复值，得到天麻钩藤饮调控坏死性凋亡途径的潜在作用靶点。将交集基因导入STRING（https：// www.string-db.org）数据库进行蛋白质相互作用分析，利用Cytoscape软件中的cytoHubba插件对交集基因分析并根据度值（degree）获取前20的靶点，并进行可视化处理。

1.4.2 京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析

利用生物学信息注释数据库（DAVID，https：// www.david.ncifcrf.gov）对核心靶点蛋白进行KEGG分析，对KEGG富集结果进行分析并筛选出核心通路，通过微生信平台（https：//www.bioinformatics.com.cn）进行可视化绘图。

1.4.3 分子对接

将RIPK1与天麻钩藤饮中的有效成分化合物进行分子对接验证。通过查阅文献报道和PDB（https：//www.rcsb.org/）数据库获取靶基因蛋白结构的pdb文件。采用Pymol 2.5.5软件对 TCMSP数据库获取的天麻钩藤饮中的化合物分子结构去除水分子和小分子配体，采用AutoDock Tools 1.5.6对化合物结构文件和RIPK1蛋白结构文件进行加氢、定义受体和配体、分配扭转键等构象处理；采用autogrid4 设置对接盒子，AutoDock4进行分子对接并获取最低结合能组合。最后，使用Pymol进行结果可视化处理。

1.5 动物实验验证

1.5.1 动物模型建立及分组

适应性喂养1周后，C57BL/6小鼠被随机分为：对照组、模型组（30 mg/kg MPTP）、模型加NEC-1（6.5 mg/kg）治疗（NEC-1组）。模型加不同剂量的天麻钩藤饮治疗（天麻钩藤饮低剂量组TGY-L 2.5 g/kg；天麻钩藤饮高剂量组TGY-H 5 g/kg）、模型加阳性对照美多芭组（76 mg/kg），15只/组。病症结合PD模型的构建方法参考文献［12］：连续5 d经腹腔注射MPTP（30 mg/kg）药物，同时对照组注入等体积的生理盐水。天麻钩藤饮和美多芭干预总共15 d，前10 d每天早上9点进行低、高剂量天麻钩藤饮或美多芭灌胃，后5 d每天早上9点进行灌胃，下午5点腹腔注射MPTP药物。NEC-1组连续6 d腹腔注射NEC-1，给药量为6.5 mg/kg，共6 d。

1.5.2 步态分析实验

采用VisuGait动物可视步态分析系统检测小鼠自发运动行为和运动协调性。正式实验前对小鼠进行训练，保证小鼠能够自主穿过设定长度的检测通道。在实验前，将小鼠置于实验环境中适应0.5 h以上。实验过程中保持环境处于黑暗状态，每只小鼠接受5次以上检测，以其中3次步幅、频率较为均一的结果进行分析。统计运动持续时间、步幅、脚步周期、平均速度等。

1.5.3 转棒实验

采用转棒实验检测小鼠的运动和平衡能力。在正式检测前小鼠进行3 d的训练， 2次/d。第1天，所有小鼠适应以10 r/min转动120 s的转棒仪。接下来小鼠以20 r/min的恒定速度在转棒仪上接受2 d的训练，持续120 s。在最后一次训练后的24 h内，小鼠接受正式的转棒测试，速度逐渐提高5~40 r/min。小鼠掉下转棒或抓住转棒并且连续旋转2圈而没有站在棒上行走时视为测试结束。计算3次平均转棒时间，最大执行时间限制为300 s。

1.5.4 爬杆实验

采用爬杆实验检测小鼠的运动协调能力。爬杆仪器由圆形木基底和圆柱形杆（高度：50 cm，直径：1.5 cm）组成，用橡胶带缠绕在圆柱杆的表面以增加摩擦力。将小鼠头朝上放在球上，小鼠从开始移动到完全转过身头朝下即为转头时间（T turn）和小鼠从掉头后到它爬到杆底端记为下杆总时间（T total）。每只小鼠适应2次，在第2天进行测试，每只小鼠测试3次，取平均值。

1.5.5 样品制备及动物处理

行为学实验结束休息24 h，取材方法采取脱颈方法处死小鼠，冰上迅速剥离出纹状体组织置于抗凝EP管中，放入液氮速冻，后转移到-80 ℃冰箱便于长期保存。

1.5.6 蛋白免疫印迹分析

取纹状体组织匀浆后、离心、超声、提取蛋白澄清液备用。制作12%胶板用于SDS-PAGE电泳，80 V恒压电泳2.5 h，330 mA恒定电流将蛋白转移PVDF膜，5% BSA或脱脂奶粉常温封闭1 h；洗膜10 min×3，4 ℃孵育一抗过夜（p-RIPK1抗体1∶1000、RIPK1抗体1∶1000、α-syn抗体1∶1000，proteintech；p-RIPK3抗体1∶1000，RIPK3抗体1∶1000，ABclonal；p-MLKL抗体1∶1500、MLKL抗体1∶1500，ABclonal；GAPDH抗体1∶5000，Servicebio；TH抗体1∶1000，abcam。洗膜，常温孵育二抗1 h（1∶10000，ABclonal）。使用ECL化学发光试剂将检测条带置于超敏荧光及化学发光仪中曝光，保存图像。

1.6 统计学分析

采用GraphPad Prism 9.0、SPSS 16. 0软件进行统计学分析，所有计量资料均符合正态分布采用均数±标准差表示，方差齐则组间比较采用单因素方差分析；方差不齐则用Dunnett-t检验，以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 MPTP成功诱导病证结合的PD小鼠模型。

一般体征表现^［13］：给予MPTP腹腔注射0.5 h后，观察到小鼠出现全身抖动、立毛、弓背、肢体僵硬、竖尾征，呼吸急促、烦躁不安等反应。随后出现支撑不稳、身体震颤、转圈等现象，约12 h后逐渐平稳，类似PD患者震颤等症状。行为学检测：小鼠自发步态分析仪的检测结果表明，与对照组相比，模型组小鼠的脚步周期时间增加（P<0.001），步幅距离减少（P<0.01），表明模型组小鼠出现自发运动障碍。生化指标检测：α-突触核蛋白（α-syn）和酪氨酸羟化酶（TH）是PD的主要病理特征，其中，高浓度的α-syn会发生异常聚集，形成PD的特征性病理标志物—路易小体和路易神经突，而TH是多巴胺（DA）的合成限速酶，TH活性的降低导致DA能神经元的退行性变。采用Western blotting检测各组小鼠纹状体中α-syn蛋白和TH蛋白的表达情况。模型组小鼠纹状体中α-syn蛋白表达水平增加（P=0.0015），TH蛋白表达水平减少（P=0.0041）。因此本研究采用MPTP（30 mg·kg^-1·d^-1，5 d）诱导的PD模型属肝阳上亢PD病症结合模型，可以作为PD中医药动物实验研究（图1）。

2.2 天麻钩藤饮改善PD小鼠运动功能障碍

步态分析结果显示，与模型组相比，天麻钩藤饮高剂量组和美多芭组小鼠的步幅距离增加（P<0.05）；脚步周期时间减少（P<0.001，图2A、B）。与天麻钩藤饮低剂量组相比，天麻钩藤饮高剂量组和美多芭组小鼠步幅距离增加（P<0.05）；脚步周期时间明显减少（P<0.01）。与模型组相比，天麻钩藤饮低剂量组、高剂量组、美多芭组小鼠在转棒上的停留时间延长（P<0.05，图2C）；天麻钩藤饮低剂量组、高剂量组、美多芭组的小鼠爬杆的转身时间和触底时间比模型组小鼠缩短（P<0.001，图2D、E）。与天麻钩藤饮低剂量组相比，天麻钩藤饮高剂量组和美多芭组小鼠爬杆的转身时间和触底时间明显减少（P<0.001）；美多芭组小鼠在转棒上的停留时间明显增加（P<0.05）。另外，天麻钩藤饮高剂量组与阳性对照美多芭组之间差异没有统计学意义（P>0.05）。

2.3 天麻钩藤饮改善帕金森病的网络药理学预测

在TCMSP、SwissTarget Prediction等数据库中找出中药成分，PubChem获取天麻、钩藤的多种格式结构文件，通过GeneCards、SwissTarget Prediction等数据库获取天麻、钩藤的药物成分的作用靶点，将靶点合并去重后获得1760个作用靶点，通过GeneCards获取坏死性凋亡基因。将天麻钩藤饮成分作用靶点、坏死性凋亡作用靶点数据集输入Venn图在线工具，得到183个天麻钩藤饮调控坏死性凋亡途径的潜在作用靶点（图3A）。将交集基因导入STRING数据库进行蛋白质相互作用分析，利用Cytoscape软件中的cytoHubba插件对交集基因分析并根据度值（degree）获取前20的靶点，针对20个核心靶点构建核心靶点PPI图，重点关注度值前20作用靶点中的RIPK1蛋白，激活RIPK1蛋白是启动坏死性凋亡通路的先决条件（图3B）。将核心靶点上传David数据库进行KEGG富集分析，在富集结果中取Count值为7以上的通路进行部分展示（图3C），其中退行性疾病-多种疾病的Count值为9。对RIPK1与天麻钩藤饮有效成分的化合物进行分子对接。RIPK1与天麻钩藤饮活性成分中3种化合物存在相互作用，RIPK1与hirsutaside A的结合能为-2.5 kcal/J，RIPK1与四氢鸭脚木碱的结合能为-5.58 kcal/J，RIPK1与毛钩藤碱（2S，12bR）-methyl 2-（（E）-1-oxobut-2-en-2-yl）-1，2，6，7，12，12b-hexahydro-indolo［2，3-a］quinolizine-3-carboxylate的结合能为-5.99 kcal/J，提示RIPK1与天麻钩藤饮中的3种化合物均能良好结合（图3D）。

2.4 RIPK1抑制剂NEC-1减轻PD小鼠运动功能障碍和病理蛋白蓄积

转棒实验评价小鼠的运动和平衡能力，并结合爬杆实验评价小鼠的运动协调性，与对照组相比，模型组小鼠爬杆的转身时间和触底时间延长（P<0.001）；在转棒上的停留时间缩短（P<0.001，图4A~C）。相反，NEC-1缩短了PD小鼠爬杆的转身时间（P=0.002）和触底时间（P=0.0056），延长了在转棒上的停留时间（P=0.0013）。与对照组相比，模型组小鼠的纹状体中p-RIPK1/RIPK1、p-RIPK3/RIPK3、p-MLKL/MLKL表达水平明显增加（P<0.05），MPTP诱导的PD小鼠纹状体中的确出现坏死性凋亡通路异常激活现象；而与模型组相比，NEC-1组小鼠纹状体中p-RIPK1/RIPK1、p-RIPK3/RIPK3、p-MLKL/MLKL表达水平减少（P<0.05），NEC-1干预成功抑制了PD小鼠纹状体中坏死性凋亡通路（图4D）。与对照组相比，模型组小鼠的纹状体中出现TH低表达和α-syn高表达；而NEC-1治疗后PD小鼠纹状体中TH表达量增加（P=0.0058），α-syn表达量减少（P=0.0022），RIPK1抑制剂NEC-1治疗在一定程度上逆转了PD小鼠病理蛋白表达水平，改善PD小鼠运动功能障碍（图4E）。

2.5 天麻钩藤饮改善PD小鼠运动功能障碍的分子机制验证

与模型组相比，天麻钩藤饮低剂量组、高剂量组的小鼠纹状体中p-RIPK1/RIPK1、p-RIPK3/RIPK3、p-MLKL/MLKL表达水平降低（P<0.05，图5A）。与天麻钩藤饮低剂量组相比，高剂量的天麻钩藤饮明显降低了p-RIPK1/RIPK1、p-MLKL/MLK的表达水平（P<0.05）。与模型组相比，天麻钩藤饮低剂量组、高剂量组和美多芭组的小鼠纹状体中TH蛋白表达量增加（P<0.001），高剂量组和美多芭组小鼠纹状体中α-syn蛋白表达量减少（P<0.01，图5B）。

3 讨论

PD是一种常见的中老年神经退行性疾病，具有高患病率、高病残率和不可逆性的特点。PD运动功能障碍的发病机制尚不清晰，涉及蛋白质异常聚集、炎症反应、细胞凋亡等，最终导致多巴胺能神经元的广泛丢失。目前PD主要采用药物治疗和手术治疗，虽然在缓解症状和生活质量方面取得了一定进展，但是药物的不良反应和手术的接受度上仍面临诸多挑战，因此，加强对PD发病机制和治疗手段的研究已成为当务之急。天麻钩藤饮以“老药新用”的方式应用在神经退行性疾病的基础研究和临床实践中，并取得了显著疗效^［14-16］。本研究使用的造模方法借鉴何建成^［12］发表的PD造模方法，使用连续5 d腹腔注射30 mg/kg MPTP诱导的亚急性PD小鼠作为研究对象，构建肝阳上亢型PD模型以探究天麻钩藤饮干预PD运动功能障碍的效果及分子机制。MPTP通过损伤线粒体功能，促进活性氧产生，选择性地损害多巴胺能神经元。多巴胺能神经元负责合成和释放多巴胺，其损伤会通过黑质-纹状体通路影响纹状体中多巴胺水平，纹状体中多巴胺水平的下降是PD运动功能障碍出现关键原因^［17］。TH是多巴胺合成的限速酶，TH的显著降低会直接导致多巴胺的合成减少。研究表明MPTP（25 mg/kg，5 d）诱导的亚急性PD模型中，纹状体中TH蛋白表达水平显著降低，并出现运动功能缺陷^［18］。α-syn蛋白是PD的关键致病蛋白，在神经元中错误折叠的α-syn蛋白可聚集并形成不溶性原纤维，也可在相邻细胞间传播，导致神经元的退化和死亡^［19］。因此，α-syn蛋白的高表达和TH蛋白的低表达标志着多巴胺能神经元损伤，是PD的主要病理特征。本研究结果显示MPTP诱导的PD小鼠的自发运动能力降低，纹状体中α-syn蛋白的显著增加和TH蛋白的显著降低，并且注射MPTP药物后小鼠出现多种类似PD患者肌强直、震颤等症状，表明本研究成功建立病证结合的PD小鼠模型。

PD被中医归属为“颤症”，其病位肝，表征为风。PD初期患者的主要表现为轻微震颤、头晕目眩、烦躁易怒等，属于肝阳上亢证型，到后期转为肾阳虚为主。天麻钩藤饮以治疗肝阳上亢型高血压具有奇效而传承至今，具有平肝息风、清热止痉、补益肝肾的功效，适用于治疗癫痫、震颤等病症，是PD患者早期治疗的优选方剂^［14］。为了探究天麻钩藤饮对MPTP诱导的PD小鼠自发性行为异常的改善情况，本研究采用更精准的小鼠步态分析仪来分析自主行走过程中的足印信息。结果显示，与对照组相比，模型组的小鼠在行走过程中出现，步幅显著减少，步长周期显著增加，这与MPTP诱导的PD小鼠出现肌肉僵硬、震颤、支撑不稳有关，表明PD小鼠的运动功能明显减弱。相反，低、高剂量天麻钩藤饮的干预均不同程度上改善了PD小鼠的自主运动能力。转棒和悬挂实验是分析PD小鼠运动能力和平衡能力的经典实验^［20］，本研究在此基础上结合了爬杆实验以评估天麻钩藤饮对PD小鼠的运动协调能力的影响，结果表明高、低剂量天麻钩藤饮可延长PD小鼠在转棒上的停留时间，并减少爬杆实验中的转身时间和触底时间。不同于以往的研究，本研究全面评估了MPTP诱导的PD小鼠的自主运动能力、运动能力、平衡功能和协调性，来评价天麻钩藤饮在PD小鼠运动功能障碍方面的改善作用。本研究采用的高剂量（5 g/kg）天麻钩藤饮的干预方案，在改善PD小鼠运动功能障碍方面表现出与阳性对照美多芭相当的治疗效果。与本研究结果一致，有研究报道，连续7 d腹腔灌胃天麻钩藤饮（14.82 g/kg）可改善MPTP诱导的亚急性PD大鼠运动功能障碍^［21］。值得注意的是，天麻钩藤饮在改善肝阳上亢型运动障碍疾病上均表现出明确的疗效优势。有研究表明，天麻钩藤饮可通过降低炎症因子水平改善抽动障碍大鼠的过度梳毛和撕咬等刻板行为，以及持续头部抽动、摆头、旋转等运动行为^［22］。临床研究发现天麻钩藤饮联合针刺治疗能够显著改善抽动障碍患者的临床症状，并且相较于单纯口服西药盐酸度洛西汀胶囊，具有不良反应小、复发率低的优点^［23］。

天麻钩藤饮的核心成分包括天麻和钩藤，二者均为君药，具有平肝熄风的作用，对应PD中的病因肝阳上亢。其中天麻性温和，钩藤则寒凉，二者相辅相成，既平抑肝阳，又避免过度寒凉，加重PD中肝肾阴虚的体征。方剂中的臣药如石决明、川牛膝、杜仲、桑寄生等，发挥清热潜阳、活血利水、补益肝肾的功效，进一步强化了方剂的治疗效果。佐药如黄芩、栀子、益母草、夜交藤、朱茯神等，主要用于清热泻火、活血安神。因此，该方剂对于PD具有标本兼治的功效。一方面，本研究使用的造模方法主要复制PD早期的病症，如全身抖动、立毛、弓背、肢体僵硬、竖尾征，呼吸急促、烦躁不安等，属肝阳上亢。此阶段阴损未甚，阳亢初现，天麻钩藤饮方中清热平肝药可有效遏制"阳亢化风"。另一方面，现代药理学研究表明，天麻钩藤饮具有抗氧化应激、抑制炎症反应、调节神经递质水平等作用^{［15， 24］}。如在血管紧张素II诱导的高血压小鼠模型中，天麻钩藤饮可上调转录因子 EB表达水平，发挥抗氧化应激和抗炎作用，从而逆转高血压引起的心血管重构^［15］。PD临床研究表明，天麻钩藤饮单独使用或者联合西药（盐酸普拉克索、美多芭）治疗可显著降低炎症因子白介素-6（IL-6）、IL-1β、肿瘤坏死因子（TNF-α）水平，改善PD患者的运动功能障碍，并减轻西药的副作用^［16］，提示天麻钩藤饮可通过抑制炎症相关通路来改善PD运动功能障碍。鉴于坏死性凋亡是一种与炎症密切相关的程序性细胞死亡方式，是造成神经元广泛丢失的重要原因^［25］，我们推测天麻钩藤饮的作用机制涉及坏死性凋亡通路，基于此来进行后续的探索。利用网络药理学和分子对接等现代药理学方法来解析天麻钩藤饮中两味君药的作用机制，结果表明，天麻和钩藤中的活性成分发挥调控作用的关键靶点涉及RIPK1，RIPK1是介导坏死性凋亡启动的先决条件，激活坏死性凋亡会造成多巴胺能神经元的损失。KEGG通路富集结果显示天麻钩藤饮调控坏死性凋亡通路涉及神经退行性疾病。因此，我们推测RIPK1可能是天麻钩藤饮调控坏死性凋亡改善PD的关键靶点。接下来，我们采用分子对接技术将RIPK1分别与天麻和钩藤中的活性成分进行对接，结果显示RIPK1与天麻和钩藤中的3种化合物存在良好的结合性，表明天麻钩藤饮能够靶向RIPK1改善PD运动功能障碍在分子层面得到了验证。为了验证坏死性凋亡在PD运动功能障碍中的作用，使用RIPK1抑制剂NEC-1干预MPTP诱导的亚急性PD小鼠。结果表明，NEC-1显著降低坏死性凋亡通路蛋白的磷酸化水平，减少α-syn蛋白表达并上调TH蛋白表达，缓解了PD小鼠运动功能障碍。

坏死性凋亡途径是近年来发现的与炎症密切相关的不受caspase活性影响的细胞死亡形式，与多种病理条件下的细胞损伤有关^［26］。当多种信号诱导后，RIPK1被募集并激活，发生自磷酸化，随后募集并激活RIPK3，形成RIPK1-RIPK3复合体，启动坏死性凋亡，该复合体也被称为“坏死小体”，复合体进一步磷酸化并激活MLKL。MLKL是坏死性凋亡的执行者，被激活的MLKL会转位至细胞膜，插入并形成孔道，最终导致细胞膜破裂和细胞内容物泄露，触发炎症反应。本团队前期研究表明，NEC-1干预可以改善慢性PD小鼠的运动功能障碍^［27］。本研究发现NEC-1干预同样可以提高亚急性PD小鼠的运动表现，其可通过抑制坏死性凋亡通路，降低α-syn蛋白并恢复TH表达水平达到保护神经元的作用，与本研究一致，使用NEC-1抑制坏死性凋亡通路也减轻了MPTP诱导的PD小鼠黑质中多巴胺能神经元丢失和运动功能障碍^［28］。此外，抑制坏死性凋亡通路中的其他关键蛋白也可达到改善PD运动功能障碍的作用效果。敲除MLKL基因通过抑制纹状体和黑质区域的小胶质细胞和星形胶质细胞的激活，减轻了TH阳性神经元丢失和神经炎症，从而改善A53T转基因PD小鼠运动功能障碍^［29］。在MPTP诱导的PD小鼠中也得到同样验证，敲除MLKL基因和使用MLKL抑制剂Necrosulfonamide均可减轻炎症和多巴胺能神经元丢失，进而改善运动功能障碍^{［30， 31］}。此外，敲除RIPK3基因或使用RIPK3抑制剂GSK872也可通过抑制炎症因子表达来挽救TH阳性神经元死亡，从而改善MPTP诱导的运动功能障碍^{［30， 32］}。以上研究表明，不管是敲除坏死性凋亡通路关键基因，还是使用药源性抑制关键蛋白的功能，均可以显著减轻多巴胺能神经元损失，改善PD小鼠的运动功能障碍。虽然NEC-1是一种可以跨越血脑屏障并有效抑制脑内RIPK1表达的抑制剂^［33］，但遗憾的是，NEC-1药物的研究目前仅进展到临床一期试验阶段，其因自身毒性导致在临床应用上还面临着一些挑战。

网络药理学和分子对接分析结果表明了天麻钩藤饮可通过坏死性凋亡途径改善PD运动功能障碍的可能性。紧接着，分子实验进一步证实，低、高剂量天麻钩藤饮干预可以不同程度地降低p-RIPK1/RIPK1、p-RIPK3/RIPK3、p-MLKL/MLKL表达水平。表明天麻钩藤饮可显著抑制坏死性凋亡通路，揭示了天麻钩藤饮在改善炎症和运动功能障碍方面的作用机制。除了多巴胺能神经元广泛丧失外，神经元内高浓度的α-syn聚集体也是PD的主要病理特征。α-syn异常聚集可以激活小胶质细胞和星形胶质细胞，启动炎症级联反应，释放TNF-α，进而诱导神经元的坏死性凋亡^［34］。研究发现天麻钩藤饮可通过抑制α-syn蛋白表达，恢复黑质中退化的多巴胺能神经元，改善MPTP 诱导的亚急性PD小鼠运动功能障碍^［20］。另一项研究表明，天麻钩藤饮可增加TH蛋白表达和提高多巴胺能神经元的抗凋亡能力，改善MPTP诱导的亚急性PD大鼠的运动功能障碍^［35］。本研究结果显示，天麻钩藤饮可降低α-syn表达量，恢复TH表达水平，从而保护多巴胺能神经元免受坏死性凋亡损害。天麻钩藤饮在6-OHDA 处理的PD大鼠及A53T转基因小鼠中也被证实可以减少α-syn的表达和多巴胺能神经元丢失，改善运动功能障碍^［36］。尽管目前关于天麻钩藤饮改善PD运动功能障碍的机制研究有限，我们的研究在一定程度上补充了此方面研究的不足。同时，本研究揭示了天麻钩藤饮可以调控坏死性凋亡途径这一新作用机制，为坏死性凋亡参与PD病理过程提供了直接证据。坏死性凋亡与神经炎症的关联机制是当前研究的热点领域。我们的前期研究发现，DHM可改善MPTP诱导的PD小鼠运动功能障碍，其机制是通过激活自噬抑制神经胶质细胞活化，进而减轻细胞坏死性凋亡^［27］，表明坏死性凋亡与神经炎症密切相关，抑制其上游机制可有效阻断坏死性凋亡，这为接下来天麻钩藤饮在PD运动功能障碍方面的机制研究提供了可行方向。因此，未来可以进一步探索天麻钩藤饮在调控坏死性凋亡通路方面的机制作用。

综上所述，本研究，证实天麻钩藤饮可以改善MPTP诱导的亚急性PD小鼠的运动功能障碍，其机制可能是通过降低坏死性凋亡蛋白的磷酸化水平来抑制坏死性凋亡通路，从而降低α-syn的表达和增加TH的表达水平，保护多巴胺神经元免受损伤。其中，与美多芭组相比，高剂量天麻钩藤饮在PD小鼠行为学改善方面展现出相当的治疗效果。

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