芪芎左归颗粒通过上调BDNF/TrkB通路提高衰老大鼠突触可塑性

Qixiong Zuogui Granules enhance synaptic plasticity in aging rats by regulating the BDNF/TrkB signaling pathway

摘要

目的 探讨芪芎左归颗粒通过调控脑源性神经营养因子（BDNF）/酪氨酸激酶受体B（TrkB）通路对衰老大鼠突触可塑性的影响。 方法 将40只SD大鼠随机分为对照（Control）组、模型（Model）组、阳性药多奈哌齐（Don）组、中药芪芎左归颗粒（QXZG）组，10只/组。除对照组外，其余各组大鼠均连续腹腔注射D-半乳糖构建脑衰老大鼠模型；造模同时，Don组给予盐酸多奈哌齐混悬液（0.45 mg/kg灌胃）、QXZG组给予芪芎左归颗粒混悬液（7.97 g/kg灌胃），持续8周。干预结束后，评估各组大鼠的一般情况情况、行为学表现、血清中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力及丙二醛（MDA）含量；HE及尼氏染色观察海马CA1区病理变化；免疫组化法检测细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A（CDKN2A/p16INK4a）蛋白阳性表达、免疫荧光法观察突触可塑性蛋白突触素（SYN）、生长相关蛋白43（GAP43）的阳性表达、蛋白免疫印迹检测BDNF/TrkB通路相关蛋白及突触后致密蛋白95（PSD95）的表达情况。 结果 与对照组相比，模型组大鼠出现牙齿、毛发变黄，体质量减轻等衰老表型并表现出学习记忆能力的损伤；血清SOD、GSH-Px活力降低，MDA含量升高（P<0.001）；海马CA1区出现病理损伤，尼氏小体减少伴有p16蛋白升高（P<0.001）；BDNF/TrkB通路蛋白BDNF、TrkB、CREB及突触可塑性蛋白SYN、GAP43、PSD95表达量降低（P<0.01）。与模型组相比，芪芎左归颗粒能够一定程度上抑制大鼠衰老表型的发生，提高学习记忆能力；改善海马CA1区病理损伤，降低氧化应激反应及p16蛋白表达（P<0.05）；促进BDNF/TrkB通路蛋白及突触可塑性蛋白表达（P<0.05）。 结论 芪芎左归颗粒可能通过上调BDNF/TrkB信号通路相关蛋白的表达，提高衰老大鼠突触可塑性、降低体内氧化应激水平，发挥抗脑衰老及提高学习记忆能力的作用。

Abstract

Objective To exple the mechanism of Qixiong Zuogui Granules (QXZG) for enhancing synaptic plasticity in aging rats. Method Forty SD rats were randomized into control group, aging model group, donepezil treatment group, and QXZG treatment group (n=10). Except for the control rats, all the rats were subjected to daily intraperitoneal injection of D-galactose for 8 consecutive weeks to induce brain aging, and donepezil hydrochloride and QXZG suspension were administered by gavage during modeling. After the interventions, the rats were evaluated for general conditions, behavioral changes, oxidative stress indicators, hippocampal pathologies, and expressions of the brain-derived neurotrophic factor (BDNF)/tyrosine kinase receptor B (TrkB) pathway, p16, and synaptic plasticity-associated proteins. Results The rats in the model group exhibited obvious aging phenotypes such as yellowing of the teeth and hair, body weight loss, and impaired learning and memory abilities, with decreased serum SOD and GSH-Px activities and increased serum MDA level. The rat models also showed obvious pathological changes, reduced Nissl bodies, and elevated p16 protein expression in the hippocampal CA1 region, with significantly decreased expression levels of BDNF, TrkB, CREB and synaptic plasticity proteins SYN, GAP43, and PSD95. Treatment with QXZG alleviated the aging phenotypes in the rat models, improved their learning and memory abilities and pathological changes in the hippocampal CA1 region, reduced oxidative stress and p16 protein expression, and promoted the expressions of the BDNF/TrkB pathway proteins and synaptic plasticity proteins. Conclusion QXZG enhances synaptic plasticity and reduces oxidative stress in aging rats possibly by upregulating the BDNF/TrkB signaling pathway proteins, thereby delaying brain aging and improving learning and memory abilities of the rats.

Graphical abstract

关键词

脑衰老 / BDNF/TrkB信号通路 / 突触可塑性 / 学习记忆 / 芪芎左归颗粒

Key words

brain aging / BDNF/TrkB signaling pathway / synaptic plasticity / learning and memory / Qixiong Zuogui Granules

衰老又称老化，指随着时间的推移，生物体内环境稳态失调并对应激刺激等适应能力下降，出现组织器官结构改变和生理功能退化的现象^［1］。随着社会的进步，人类寿命在不断提高的同时，全球老龄化带来的相关问题也日渐突显。与此同时，衰老相关的疾病问题逐渐成为威胁人类健康的巨大挑战。研究发现^［2］，脑是最先衰老的器官之一，随着年龄的增长，会出现学习记忆、执行决策等认知能力的降低。脑老化是引发阿尔茨海默症等神经退行性疾病的关键危险因素之一，在影响患者生活质量的同时，给家庭及社会医疗等资源带来沉重的负担^［3］。因此，防治衰老相关的疾病成为目前研究的重点方向。

脑源性神经营养因子（BDNF）是广泛分布于脑中的一种营养因子，在促进神经生成、增加突触可塑性等过程中发挥重要作用^［4］。BDNF与其高亲和力受体酪氨酸激酶受体B（TrkB）结合后，启动一系列细胞内信号级联反应，继而调节神经元的生长、分化，增强突触间传递^［5］。突触是神经元间“沟通”的桥梁，是执行大脑活动的关键结构。突触形态和其间信号的传递可受相关因素的影响而变化，此过程称为突触可塑性，被认为是学习记忆的基础^［6］。位于突触前后膜上的蛋白突触素（SYN）、突触后致密蛋白95（PSD95），轴突末端生长相关蛋白43（GAP43）与突触可塑性密切相关，影响着机体的学习记忆及认知能力^［7］。

中医药以其安全有效性在抗衰老方面具有独特的优势和广阔的应用前景^［8］。衰老属于祖国医学中“虚证”的范畴，多由肾精亏虚，累及五脏，渐至机体阴阳气血虚衰；虚久气血运行不畅，多伴血瘀之象，故中医治疗多以补虚化瘀为治疗总则^［9］。芪芎左归颗粒是课题组将经典名方中具有补肾益髓功效的左归丸及活血化瘀功效的补阳还五汤加减化裁，结合现代制剂工艺加工而成，临床疗效确切^{［10， 11］}；其在抗脑衰老方面的效果已在实验中得到初步验证^{［12， 13］}，然而抗脑老化的具体作用机制有待进一步研究。故本实验在前期成果的基础上，围绕BDNF/TrkB信号通路，考察芪芎左归颗粒对衰老大鼠突触可塑性的影响，挖掘其抗脑衰老的作用机理及特点；以期为芪芎左归颗粒的在临床的应用及中药改善脑老化疗效方面提供实验依据、为衰老相关神经系统疾病的研究提供一些思路及参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物

6周龄SPF级雄性SD大鼠40只，体质量180~210 g，购于济南朋悦实验动物繁育有限公司，许可证号SCXK（鲁）20230002。动物饲养于河南中医药大学动物实验中心屏障环境中，温度23±2 ℃，湿度40%~60%，光照周期12 h，3只/笼，自由摄食、饮水，定期更换垫料。本研究实验人员均已获得河南中医药大学动物实验资格证，且所有操作符合动物伦理相关要求并经河南中医药大学实验动物伦理委员会批准（伦理批号：IACUC-202309019）。

1.2 实验药品

芪芎左归颗粒方剂组成，黄芪24 g、川芎12 g、桃仁12 g、红花12 g、熟地 24 g、山药12 g、枸杞子12 g、山茱萸12 g、川牛膝9 g、菟丝子12 g、鹿角胶12 g、龟胶12 g、茯苓12 g，均购于河南中医药大学第一附属医院，经医院药师鉴定为合格品。鹿角胶、龟胶粉碎成细粉，备用；川芎、桃仁超临界萃取提取挥发油，将挥发油制成环糊精包合物备用；川芎、桃仁药渣与其余九味加水煎煮3次，合并水煎液，浓缩，精制，精制后的药液浓缩为浸膏，喷雾干燥制得浸膏粉；将浸膏粉与挥发油包合物、鹿角胶与龟胶细粉、适宜辅料混合，干法制成颗粒。本实验中颗粒剂型由河南中医药大学药学院制剂室制备。盐酸多奈哌齐［卫材（中国）药业有限公司，5 mg/片］，取1片研碎后加入50 mL生理盐水充分混匀，制备成浓度为0.1 mg/mL的混悬液备用。因实验所处周期为冬季，所有灌胃药品使用前均于37 ℃水浴锅中加热处理。

1.3 试剂

D-半乳糖（北京索莱宝科技有限公司）； BDNF抗体、TrkB抗体、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A（CDKN2A/p16INK4a）抗体（Abcam）； PSD95抗体、环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）抗体（CST）； 苏木素-伊红（HE）染色试剂盒、尼氏染液、SYN抗体（servicebio）；GAP43抗体、β-肌动蛋白（β-actin）抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）（南京建成生物工程研究所有限公司）；β-半乳糖苷酶染色试剂盒（上海碧云天技术股份有限公司）。

1.4 主要仪器

恒温水浴锅（常州苏瑞仪器有限公司）；离心机（Eppendorf）；脱水机（深圳市达科为医疗科技有限公司）；包埋机（Zonway）；切片机（深圳市达科为医疗科技有限公司）；高速低温组织研磨仪（servicebio）；酶标仪 （Thermo Scientific）；倒置相差显微镜、荧光显微镜［NIKON精机（上海）有限公司］；电泳仪、转膜仪（上海天能科技有限公司）；显影仪（VILBER BIO IMAGING）；Y迷宫行为学仪器、新物体识别箱（上海欣软信息科技有限公司）。

1.5 方法

1.5.1 动物分组及模型制备

大鼠适应性饲养1周后，按随机数字表法随机分为4组，10只/组，分别为对照组（Control），模型组（Model），阳性药组（Don），中药组（QXZG）；根据课题组前期方法进行造模^{［12， 13］}。除空白组外其余各组大鼠均腹腔注射10% D-半乳糖500 mg/（kg·d），空白组给予等体积生理盐水腹腔注射，每周称质量1次，连续注射8周。根据人与大鼠体表面积计算公式（折算系数6.3），及课题组前期研究和预实验结果^［12-14］，于造模当日起，阳性药组给予盐酸多奈哌齐研磨成粉溶于生理盐水中以0.45 mg·kg^-1·d^-1灌胃；中药组给予芪芎左归颗粒7.97 mg·kg^-1·d^-1溶于生理盐水中灌胃；空白组和模型组给予等体积生理盐水灌服， 1次/d，干预至造模结束。

1.5.2 一般情况观察

每周对大鼠进行体质量测量，并于末次灌胃后，观察各组大鼠的外观状态、饮食、活动度、抓取反抗能力、精神状态等情况。

1.5.3 新物体识别实验

实验包括3个阶段，分别为适应期、训练期和测试期。在造模结束前1 d，将各组大鼠放入新物体识别箱中任其自由探索10 min以熟悉测试环境。末次灌胃给药后，将两个完全相同的物体甲、乙放入新物体识别箱两边靠近顶部的对称位置，各物体距离箱体侧边2~3 cm；将各组大鼠背对两物体连线的中心位置依次放入箱体靠底边处，视频分析系统记录10 min训练期中大鼠对两物体的探索情况（大鼠鼻子、嘴巴或前爪接近或触碰物体算1次探索行为；新的大鼠训练开始前需用酒精彻底清洁箱面以消除气味）。训练期结束1 h后，将物体乙换成与其大小类似形状不同的物体丙，再次将大鼠以相同的方式放入，记录10 min内的探索行为。用认知指数评价测试大鼠的学习记忆能力。认知指数=新物体探索次数/（新物体+旧物体）探索次数×100%。

1.5.4 Y迷宫检测

新物体实验测试完毕后，对各组大鼠进行Y迷宫测试。清洁Y迷宫箱体后，依次将各组大鼠头部朝向一个方向放入Y迷宫箱体中心位置，任其自由探索5 min，记录在此过程中大鼠进入每只臂的顺序。当大鼠连续进入不同的3个臂时（只区分进入了3个不同的臂如ABC，每次进入3个不同臂的顺序不必考虑）认为其发生了自发交替行为，观察测试时间内每只大鼠自发交替行为总次数，依此计算出自发交替率。自发交替率＝自发交替次数/（进入臂的总次数-2）×100%。

1.5.5 血清中氧化应激指标检测

行为学测试结束后，使用戊巴比妥钠麻醉大鼠，暴露腹主动脉取血。采集血液样品，静置后于离心机3000 r/min，4 ℃，离心15 min分离血清。按照试剂盒说明书测定各组大鼠血清中SOD、GSH-Px活性及MDA含量。

1.5.6 脑组织病理染色

腹主动脉取血后，每组随机选取3只大鼠，暴露心脏，进行半灌注。待大鼠前肢及两肺变白立刻完整取出脑组织放入多聚甲醛中。固定24 h后将脑组织脱水、包埋、将海马部冠状位切成3~4 μm的切片。经过脱蜡、水化、进行HE及尼氏染色；中性树胶封片后，光学显微镜下观察海马区组织形态特征。

1.5.7 免疫组化检测

石蜡包埋的组织经过切片、脱蜡、水化后，置于柠檬酸钠抗原修复液中行高温修复；PBS清洗后，放入3%过氧化氢中避光室温孵育25 min以阻断内源性过氧化氢酶，PBS清洗3次；使用组化笔绕组织周围画圈，滴加3% BSA室温下封闭30 min，随后滴加p16抗体（1∶50），4 ℃孵育过夜。次日切片PBS清洗3次，滴加二抗（1∶500），室温孵育30 min后PBS清洗3次；滴加DAB显色液至合适程度时清水冲洗终止显色；最后使用苏木素染细胞核后进行酒精梯度脱水、二甲苯透明后封片。使用荧光显微镜观察并拍照，利用ImageJ软件进行平均光密度值测定，用来表示p16蛋白的相对阳性表达量。

1.5.8 免疫荧光检测

石蜡切片进行脱蜡、水化、抗原修复后，用免疫组化笔围绕组织画圈，滴加3% BSA封闭；加入SYN（1∶500）、GAP43（1∶300）一抗稀释液4 ℃孵育过夜。次日PBS清洗组织切片3次后滴加荧光二抗（1∶500），室温下避光孵育50 min；PBS清洗3次后滴加DAPI染核，最后滴加抗荧光猝灭剂后封片。使用荧光显微镜观察并拍照，利用ImageJ软件进行荧光强度分析。

1.5.9 蛋白免疫印迹检测

每组另随机选取3只大鼠，取血后快速冰上取出大脑，提取海马区组织。按照1∶10比例加入RIPA裂解液；按适当比例加入蛋白酶抑制剂后行低温组织研磨，提取蛋白上清液。取部分用于BCA蛋白定量及浓度归一化处理，剩余部分加入蛋白上样缓冲液并于金属浴中煮沸10 min，分装后保存于-20 ℃冰箱。经过制胶、上样、电泳、转膜后将PVDF膜放入5%的脱脂奶粉中，于摇床上封闭2 h后，置于BDNF（1∶1000）、TrkB（1∶5000）、CREB（1∶1000）、PSD95（1∶1000）、β-actin（1∶8000）一抗稀释液中，4 ℃孵育过夜。次日TBST清洗3次后加入二抗（1∶10 000）室温孵育1 h，TBST清洗3次；加入ECL发光液后曝光显影。使用ImageJ软件分析蛋白条带灰度值。

1.5.10 统计学分析

采用GraphPad Prism 9.0及SPSS 25.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示，服从正态分布，两组间比较采用 t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，并通过Tukey事后检验进行两两组间差异对比；不服从正态分布的数据采用秩和检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 芪芎左归颗粒对衰老大鼠一般情况的影响

经过8周D-半乳糖干预后，对照组大鼠毛发稠密有光泽、不易脱落；饮食正常，体质量在正常范围；好动、移动迅速、有打斗、夺食等行为；不易抓取、挣扎剧烈且易挣脱、伴响亮嘶鸣；精神状态可。模型组大鼠表现出牙齿及毛发发黄，毛发稀疏、枯燥无光泽、抓取时易脱落；饮食减少，体质量减轻；活动度明显减少、行动速度降低、反应迟钝、嗜卧懒动，常蜷缩于饲养笼一角；较温顺、抓取时无反抗或轻微挣扎、进行操作时无呻吟或低呻吟；精神萎靡。阳性药及中药组大鼠毛发、牙齿发黄较少，饮食、体质量、活动能力及精神状态接近于对照组大鼠（图1）。

2.2 芪芎左归颗粒对衰老大鼠新物体识别实验的影响

与对照组相比，模型组大鼠对新物体（方形物体）的探索次数明显减少，甚至缺乏对物体的探索兴趣，认知指数下降（P<0.001）；与模型组比较，阳性药及中药组大鼠对新物体的探索行为明显增多，认知指数提升（P<0.05，图2）。

2.3 芪芎左归颗粒对衰老大鼠Y迷宫实验的影响

模型组大鼠在Y迷宫中的交替次数低于对照组，自发交替率降低（P<0.001）；与模型组相比，阳性药组及中药组的交替次数及自发交替率增高（P<0.01，图3）。

2.4 芪芎左归颗粒对衰老大鼠血清中SOD、MDA、GSH-Px的影响

与对照组相比，模型组大鼠血清中SOD、GSH-Px活力明显减弱（P<0.001）、MDA含量明显增多（P<0.001）；阳性药组及中药组与模型组相比，SOD、GSH-Px活力明显提升（P<0.05），MDA含量大幅度降低（P<0.01，表1）。

2.5 芪芎左归颗粒对衰老大鼠海马组织病理形态的影响

光镜下可见对照组大鼠海马CA1区神经细胞排列整齐紧密、形态规则、数量丰富、染色均一；模型组大鼠神经细胞排列松散稀疏、形态不规整、数量减少、胞浆着色深浅不一，部分胞核固缩及深染、缺失；相比模型组，阳性药及中药组细胞形态有所改善，数量增多、大小相对统一、核固缩及深染现象减少（图4）。

2.6 芪芎左归颗粒对衰老大鼠尼氏小体的影响

光镜下可见对照组大鼠海马CA1区神经细胞排列紧密，形态规则，尼氏小体成深蓝色、含量丰富；模型组神经细胞排列松散，形态不规则，尼氏小体含量较少甚至消失；与模型组相比，阳性药及芪芎左归颗粒组神经细胞排列较紧密，尼氏小体数量明显增多（图5）。

2.7 芪芎左归颗粒对衰老大鼠p16蛋白表达的影响

p16蛋白主要分布于神经细胞胞浆中，成棕褐色。与对照组相比，模型组海马CA1区p16蛋白表达明显升高（P<0.001）；与模型组相比，阳性药及芪芎左归颗粒组p16蛋白表达明显降低（P<0.05，图6）。

2.8 芪芎左归颗粒对衰老大鼠SYN、GAP43表达的影响

与对照组相比，模型组SYN、GAP43的阳性表达减少（P<0.001）；与模型组相比，阳性药组及芪芎左归颗粒组SYN、GAP43的阳性表达明显增多（P<0.01，图7）。

2.9 芪芎左归颗粒对衰老大鼠BDNF/TrkB信号通路因子及PSD95蛋白的影响

与对照组相比，模型组BDNF/TrkB通路蛋白BDNF、TrkB、CREB含量明显降低（P<0.01），突触可塑性蛋白PSD95表达水平明显降低（P<0.01）；与模型组相比，阳性药及芪芎左归颗粒组BDNF、TrkB、CREB、PSD95含量明显升高（P<0.05，图8）。

3 讨论

脑老化为学习记忆功能减退的一大诱因。衰老可导致大脑体积萎缩，出现神经元丢失，神经生理功能及神经可塑性下降，表现为学习、记忆力降低等认知领域的损伤和精神行为异常^［15］。研究发现^［16］，通过扩展树突分支和突触连接可以补偿衰老小鼠大脑中神经元的损失，而调节突触可塑性相关机制可能会对脑衰老早期神经功能的稳定发挥作用。因此，通过调节大脑中的突触的结构和功能，对衰老后的脑损伤修复至关重要。

现多认为肾虚血瘀为衰老的主要机制^［17］。肾为先天之本，机体的生、长、壮、老、已与肾中精气的盛衰密切相关。《素问》中记载，男子“五八，肾气衰，发堕齿槁” ^［18］，肾精亏虚为衰老的根本原因；虚久则气失统帅之性，气不行血，渐至血瘀脉阻，出现血瘀之证。衰老后机体出现腰酸耳鸣、齿脱发白、眼昏健忘，舌暗脉涩为肾虚血瘀的主要表现。课题组围绕“补肾活血”的抗衰老大法，结合现代制剂工艺，创制了兼具补肾活血功效的芪芎左归颗粒。方中重用黄芪以培补元气；熟地黄补血养阴，填精益髓；枸杞子、山茱萸、菟丝子滋补肝肾，益精明目；山药补脾益肾，益气养阴；桃仁、红花活血散瘀通经；川牛膝益肝肾，逐瘀通经，引血下行；川芎为血中之气药，使血随气行；茯苓利湿泻浊，使无留湿邪之患；另配鹿龟二胶之血肉有情之品以填精益髓、阴阳双补；全方共奏补肾填精，活血祛瘀之效。现代药理研究亦证实，方中黄芪、菟丝子、桃仁、牛膝、熟地等具有明确的抗衰老功效^［19-23］。山药、黄芪、山茱萸等多种中药的有效成分具有抗氧化作用^［24-26］。

D-半乳糖诱导的衰老模型因其周期短、可重复性高等优点，成为目前公认且常用的构建老化模型的方法^［27］。D-半乳糖为一种小分子单糖，正常量摄入可以被机体代谢；但当大量D-半乳糖进入体内后，会被分解为不易代谢的半乳糖醛等，导致组织渗透压失衡、线粒体功能紊乱、氧化应激增强，出现细胞肿胀、代谢异常，进而表现出衰老征象^{［28，29］}。研究发现^［30］，长期大量注射D-半乳糖会导致大鼠大脑功能减退，学习、记忆能力下降，因此可以用于制备脑衰老动物模型。p16是一种细胞周期抑制蛋白，可以与细胞周期蛋白依赖性激酶4/6（CDK4/6）结合，抑制细胞周期循环；随着机体年龄的增长，其表达不断增多，故常被当做细胞衰老的关键靶标^［31］。盐酸多奈哌齐是中枢乙酰胆碱酯酶抑制剂，通过延缓乙酰胆碱在突触间隙部位的分解，改善学习记忆功能，为临床常用的治疗认知功能减退的药物^［32］；故本研究选择多奈哌齐作为阳性对照药。海马是大脑中负责记忆与存储的核心区域，是经典的认知相关脑区，其中CA1区与学习记忆功能密切相关^［33］。本实验中使用D-半乳糖成功复制出衰老大鼠模型，模型组大鼠出现明显的衰老特征和行为表现；海马CA1区神经细胞损伤、尼氏小体减少、p16蛋白升高；新物体识别实验、Y迷宫等行为学方法检测到模型组大鼠学习记忆能力受损明显。多奈哌齐及芪芎左归颗粒可以一定程度上抑制D-半乳糖导致的大鼠衰老表型的发生，修复海马区病理损伤，降低p16蛋白的表达，削弱其对大脑学习认知能力的损害。结果证明D-半乳糖可以诱导大鼠衰老表型、造成脑细胞损伤，降低大鼠认知相关的学习记忆能力；芪芎左归颗粒可以修复D-半乳糖诱导的衰老大鼠海马区域的神经细胞损伤，刺激尼氏小体新生，改善衰老造成的脑损伤，提高大鼠学习和记忆能力。

细胞在新陈代谢中，会产生少量性质活泼的氧自由基，正常机体能通过SOD、GSH-Px等酶系统的酶解作用清除活性氧^［34］。随着年龄增长，人体抗氧化能力不断下降，体内活性氧堆积。活性氧可侵袭细胞膜、破坏DNA、降低端粒酶活性，刺激膜脂过氧化产物MDA（可以反映机体中自由基损害的程度）增多，加速衰老的进程和各种老年病的发生发展^［35］。脑的生理活动需要大量的氧，约占人体总耗氧量的1/5，故脑细胞更易受氧自由基的侵害^［36］。因此，抑制机体过度的氧化反应，提高老龄群体的抗氧化能力，是延缓衰老进程、防治老年病的关键。本研究发现，D-半乳糖可以诱导大鼠血清中SOD、GSH-Px活力的降低，刺激 MDA表达升高，加剧氧化应激反应；而多奈哌齐及芪芎左归颗粒可以逆转上述指标的变化。结果表明，过量的D-半乳糖可以导致大鼠体内氧化应激反应异常，而芪芎左归颗粒可以通过提高大鼠体内抗氧化酶的活性，抑制过氧化物的产生，修复自由基损害。因此，抑制氧化应激反应可能是芪芎左归颗粒修复脑损伤，抗脑衰老的机制之一。

BDNF是调节突触结构和功能稳态的重要因子，由神经元和胶质细胞合成后储存于轴、树突中，通过增加树突棘密度及突触间联系来保持突触稳定^［37］。TrkB是主要表达于大脑中的一种跨膜蛋白，属于BDNF的高亲和力受体^［38］。BDNF与TrkB结合后促进前者运送至突触前膜，影响突触后膜上相关神经递质的数量及分布；并通过上调海马N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体，促进长时程增强（LTP）高频表达，增强突触间传递^［39］。CREB是一种重要的核转录因子，可以调控下游神经因子基因表达，与突触可塑性关系密切^［40］。BDNF/TrkB通路激活后可促进CREB磷酸化，又进一步介导BDNF的活化和表达，进而发挥增强突触可塑性的作用^［41］。Cai等^［42］发现BDNF信号通路通过增强CREB的表达及磷酸化促进树突棘和突触生长，保护神经细胞。脑中突触可塑性相关蛋白的表达与学习记忆功能密切相关。SYN是存在于突触前囊泡膜上的蛋白，可以通过特异性结合Ca²⁺调节神经递质释放、突触囊泡的转运、促进轴突末端侧支形成等影响突触可塑性^［43］；根据其在脑中的含量和分布可以间接判断突触的数量及传递效能。Schmitt等^［44］发现，敲除SYN的小鼠突触形态发育异常，传递效率下降，并伴有学习记忆能力受损。PSD95是位于突触后膜致密区处的骨架蛋白，主要存在于树突棘中；其通过调控谷氨酸能信号传递、维持树突棘的形态等来调节突触可塑性^［45］。研究发现^［46］，随着大鼠月龄的增加，学习记忆能力的下降与海马中PSD95蛋白等表达水平成正相关。GAP43是一种主要表达于神经元轴突末端的膜蛋白，可以与钙调蛋白结合，影响突触间信号传递，并通过刺激神经骨架蛋白在生长锥上聚合，刺激轴突末梢分支“出芽”，影响突触可塑性^［47］。本研究中，模型组大鼠BDNF/TrkB通路相关蛋白BDNF、TrkB、CREB表达量明显降低，突触可塑性蛋白SYN、PSD95、GAP43的含量减少；多奈哌齐及芪芎左归颗粒组干预后，可以提高上述蛋白的表达。表明D-半乳糖可以抑制大鼠脑中突触相关蛋白的表达，而芪芎左归颗粒可能通过上调BDNF/TrkB通路相关蛋白的表达，改善衰老大鼠突触可塑性，修复认知损伤。

综上所述，芪芎左归颗粒可能通过上调BDNF/TrkB信号通路相关蛋白，促进突触可塑性蛋白SYN、PSD95、GAP43的表达，降低衰老相关p16因子含量，改善D-半乳糖致衰老大鼠脑细胞损伤并降低体内氧化应激反应来调节海马突触可塑性，从而发挥抗脑衰老及提高学习记忆能力的作用。

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基金资助

国家自然科学基金(81974564)

国家自然科学基金(82104730)

中原英才计划——科技创新领军人才项目(224200510027)

河南省“双一流”创建学科中医学科学研究专项(HSRP-DFCTCM-2023-1-04)

河南省中医药科学研究专项课题(2023ZY1030)

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