外泌体来源的miR-1275通过上调淋巴细胞中IL-38的表达抑制脓毒症心肌细胞凋亡

Exosome-derived miR-1275 mediates IL-38 upregulation in lymphocytes to suppress lipopolysaccharide-induced apoptosis of myocardial cells in vitro

摘要

目的 探究心肌细胞来源的外泌体对脂多糖（LPS）诱导的脓毒症心肌细胞损伤的影响及其作用机制。 方法 采用LPS构建脓毒症心肌细胞损伤模型，分离心肌细胞来源外泌体，与大鼠淋巴细胞共培养。实验分为以下2组：对照组（心肌细胞置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中）和LPS组（心肌细胞置于含500 ng/mL LPS的培养基诱导3 h）。利用CCK-8检测淋巴细胞增殖情况；qRT-PCR和Western blotting法检测淋巴细胞中白细胞介素-38（IL-38）的mRNA和蛋白表达水平；通过生物信息学挖掘LPS诱导脓毒症心肌细胞损伤的关键外泌体，双荧光素酶报告验证其与IL-38是否有靶向关系。将LPS诱导的心肌细胞来源外泌体处理后的淋巴细胞与心肌细胞损伤模型共培养，实验分为以下2组：对照组（上层培养淋巴细胞，下层培养经LPS诱导的心肌细胞，共培养48 h）和LPS-exosome组（上层将淋巴细胞和经LPS诱导的心肌细胞来源外泌体混合培养，下层培养经LPS诱导的心肌细胞）。通过流式细胞术检测心肌细胞凋亡。并用人重组IL-38（Re-IL-38）蛋白处理LPS诱导的脓毒症心肌细胞损伤模型，实验分为以下2组：对照组（心肌细胞+LPS）和重组IL-38组（心肌细胞+IL-38预处理+LPS）。通过流式细胞术检测心肌细胞凋亡，Western blotting法检测心肌细胞中凋亡，PI3K/AKT通路相关蛋白表达水平。 结果 与正常心肌细胞来源外泌体相比，LPS诱导的心肌细胞来源外泌体能够提高淋巴细胞增殖活力（P<0.05），且淋巴细胞中IL-38 mRNA和蛋白表达水平显著升高（P<0.05）。GEO数据库搜索及差异分析发现miR-1275为LPS诱导脓毒症心肌细胞损伤的关键外泌体；双荧光素酶报告基因结果显示，miR-1275 mimics增加WT-IL-38的荧光素酶活性（P<0.05）。LPS诱导的心肌细胞来源外泌体处理的淋巴细胞与LPS诱导的心肌细胞共培养，能抑制心肌细胞凋亡（P<0.05）。Re-IL-38处理后，心肌细胞凋亡率降低（P<0.05），Bax蛋白表达量降低（P<0.05），Bcl-2、p-PI3K和p-AKT蛋白表达量升高（P<0.05）。 结论 LPS诱导的心肌细胞外泌体中的miR-1275介导上调淋巴细胞中IL-38的表达，激活PI3K/AKT通路从而抑制LPS诱导的心肌细胞凋亡。

Abstract

Objective To investigate the effect of cardiomyocytes-derived exosomes on lipopolysaccharide (LPS)-induced cardiomyocyte injury and its mechanism. Methods Exosomes isolated from rat cardiomyocytes with or without LPS treatment were co-cultured with rat lymphocytes. The lymphocytes with or without exosome treatment were co-cultured with LPS-induced rat cardiomyocytes for 48 h. Cardiomyocyte apoptosis was detected using flow cytometry, and the expressions of apoptosis marker proteins and the PI3K/AKT pathway proteins were detected using Western blotting. The effects of human recombinant IL-38 protein on apoptosis and protein expressions in LPS-induced cardiomyocytes were examined. Results Compared with normal cardiomyocyte-derived exosomes, the exosomes from LPS-induced cardiomyocytes significantly enhanced proliferation and increased mRNA and protein expression levels of IL-38 in rat lymphocytes. Bioinformatics analysis suggested that miR-1275 in the exosome played a key role in LPS-induced cardiomyocyte injury, and in dual luciferase reporter gene assay, miR-1275 mimics significantly increased luciferase activity of WT-IL-38. Co-culture with lymphocytes treated with exosomes from LPS-induced cardiomyocytes significantly inhibited apoptosis of LPS-induced cardiomyocytes. Treatment with recombinant IL-38 also effectively lowered apoptosis rate of LPS-induced cardiomyocytes, reduced cellular expression of Bax protein, and increased the protein expression levels of Bcl-2, p-PI3K and p-AKT. Conclusion miR-1275 in exosomes derived from LPS-induced cardiomyocytes mediates IL-38 up-regulation expression in lymphocytes to activate the PI3K/AKT pathway and inhibit LPS-induced cardiomyocyte apoptosis.

Graphical abstract

关键词

外泌体 / 心肌细胞 / miR-1275 / IL-38 / 脓毒症

Key words

exosomes / cardiomyocyte / miR-1275 / IL-38 / sepsis

有流行病学研究显示，脓毒症发病率约为32.6%，25%~50%成人脓毒症患者伴有心肌损伤或心功能障碍，其死亡率可高达70%^{［1， 2］}。目前脓毒症引起的心肌损伤或心功能障碍的发生发展机制仍未明确，仍缺乏有效的干预或治疗手段。因此，探索新的靶点来改善心脏组织损伤，积极治疗脓毒症引起的心功能障碍是提高患者生存率和预后的必要措施。

外泌体是直径为30~100 nm的小囊泡，内含蛋白质、脂质、mRNA和miRNA等多种分子^［3］，在抗原呈递、细胞间信号通讯、炎症反应和免疫监视中发挥作用。然而，外泌体的生物学功能和相关分子机制仍有待阐明。心肌组织分泌的外泌体是参与心脏细胞间通讯的重要物质^［4］。Cao等^［5］研究表明，脂多糖（LPS）诱导的内源性外泌体可减轻大鼠心肌细胞损伤和凋亡。LPS刺激的外泌体可被用作免疫刺激剂，心肌细胞衍生的外泌体是调节心脏氧化应激损伤的重要炎症反应调节剂^［6］。心肌细胞、血管细胞、成纤维细胞和常驻干细胞释放的外泌体具有低免疫原性，在生理上比心肌细胞更稳定，可以在体内循环，并且能够穿过血脑屏障^［7］。

miR-1275是一类小型非编码RNA（长度约为22个核苷酸），能够参与癌症、炎症和心血管疾病等多种疾病的发展^［8，9］。Zeng等^［10］研究发现，敲低miR-1275能够通过促进神经介素U型受体1来防止心肌细胞损伤。研究证明，前列腺癌衍生的外泌体miR-1275能够通过调节 SIRT2/Runx2 信号传导来促进成骨细胞的增殖和活性^［11］。也有研究发现，肝癌外泌体源性miR-1275通过调控Foxp3进而影响Treg细胞表达，从而参与肝癌的发生和发展过程^［12］。然而，关于心肌细胞来源的外泌体miR-1275对脓毒症心肌细胞损伤的作用及机制尚未见报道。

白细胞介素-38（IL-38）是一种B淋巴细胞产物，具有抑制炎症的功能，而脓毒症是由感染引起的危重症，以全身炎症反应激活为特征，炎症因子大量释放并引发脓毒症性休克、多器官功能障碍^{［13， 14］}。由于心肌细胞来源外泌体调控炎症反应改善心肌细胞损伤的具体机制仍不清楚。因此，我们研究了心肌细胞来源的外泌体对脓毒症心肌细胞损伤模型的作用及机制，并探讨了新分子水平上的干预路径。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

孕20 d清洁级SD大鼠18只，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。实验已获华北理工大学实验动物伦理委员会批准（伦理批号：20240607001）。

1.1.2 主要材料

DMEM和RPMI-1640培养基（Hyclone）；10%胎牛血清和II型胶原酶（Gibco）；青霉素和链霉素、CCK-8试剂盒（Solarbio）；大鼠脾脏淋巴细胞分离液试剂盒（TBD）；LPS（Abcam）；Trizol（Ambion）；反转录试剂盒（TAKARA）；SYBR FAST qPCR Master Mix（KAPA Biosystems）；双荧光素酶报告基因检测试剂盒（碧云天）；AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒（BD）；PVDF转移膜、化学发光试剂（millipore），BCA蛋白浓度测定试剂盒（Solarbio）；兔抗白细胞介素38（IL-38）抗体、兔抗B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）抗体、兔抗Bcl-2相关X（Bax）抗体、兔抗磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）抗体、兔抗蛋白激酶B（AKT）抗体、溶酶体相关膜蛋白-3 （CD63）抗体、肿瘤易感基因101 （TSG101）抗体、兔抗GAPDH和羊抗兔IgG（Bioswamp）。

1.2 原代心肌细胞及淋巴细胞的分离与培养

1.2.1 原代心肌细胞分离与培养

选择孕20 d的SPF级SD大鼠，处死后，取出胎鼠，取出心脏，将心脏剪成约1 mm³大小组织块，加入0.25%胰酶+0.1%II型胶原酶混合液，37 ℃培养箱中消化5 min，自然沉淀，弃上清。加入0.25%胰酶+0.1% II型胶原酶混合液，静置，取上清，重复上述步骤4次，每次分离的上清液加等量含10%胎牛血清的DMEM培养液轻轻吹打制成细胞悬液。将收集的细胞悬液过200目筛网除去未消化组织，1000 r/min 离心10 min，重复3次，加入红细胞裂解液，4 ℃裂解5 min。将收集的细胞用含10%胎牛血清的DMEM重悬，然后置于CO₂培养箱培养180 min，采用差速贴壁分离技术去除成纤维细胞，吸收培养瓶中的细胞悬液，调整细胞浓度为5×10⁵/mL，将单细胞悬液接种于培养板中，置于CO₂培养箱中培养，24 h后换液，然后隔天换液。

1.2.2 淋巴细胞的分离与培养

取大鼠脾脏，用含5%青霉素和链霉素的PBS漂洗3次，移至无菌培养皿中，加入少量DMEM高糖培养基，将脾脏剪成约1 mm³大小组织块，加入0.08%胰酶+0.1% II型胶原酶混合液重悬，37 ℃培养箱中消化30 min，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液轻轻吹打制成细胞悬液。将收集的细胞悬液过200目筛网除去未消化组织，175 g离心10 min，弃上清。加入红细胞裂解液，室温裂解5 min，加等体积PBS中和后，175 g离心5 min，弃上清，PBS重悬。加入分离液，400 g，离心30 min。吸取环状乳白色淋巴细胞层，加10 mL清洗液，混匀细胞，250 g，离心10 min，弃上清。收集细胞用于后续实验。

1.3 LPS诱导心肌细胞损伤模型

取出分离好的心肌细胞，分为：对照组和LPS组。将对照组心肌细胞置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中。LPS组心肌细胞置于含500 ng/mL LPS的培养基诱导3 h。置于37 ℃、5% CO₂的培养箱内培养。

1.4 外泌体的分离及鉴定

参照文献方法分离各组外泌体^［15］。收集各组细胞悬液，15 000 r/min离心3 min，用0.22 μm过滤器过滤去除细胞碎片，57 000 r/min超速离心1 h后，弃上清，收集离心管底部透明沉淀即为外泌体。

设置培养液组：加入与培养液等体积的心肌细胞培养液，培养24 h；正常心肌细胞来源外泌体组（exosome组）：培养液中加入10 µg正常心肌细胞来源外泌体，培养24 h；LPS-外泌体（LPS-exosome）组：培养液中加入10 µg LPS诱导的心肌细胞损伤模型来源外泌体，培养24 h。

使用Western blotting鉴定外泌体标志蛋白CD63和 TSG101，提取各组外泌体总蛋白，BCA测定蛋白浓度，以每孔20 μg蛋白上样量进行SDS-PAGE电泳分离蛋白，将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉4 ℃封闭过夜，加入兔抗CD63和TSG101（稀释比均为1∶1000），与膜室温孵育1 h。洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，与膜室温孵育1 h。洗膜后加入化学发光试剂，曝光显影后读取蛋白条带灰度值。

1.5 CCK-8检测淋巴细胞增殖能力

收集淋巴细胞接种于96孔板，调整悬液浓度为3×10³/孔，体积为100 μL/孔，置于37 ℃、5%CO₂培养箱中培养过夜，使细胞贴壁。分组及培养方式同1.4，5 d后取出细胞培养板，每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续培养4 h。酶标仪检测吸光值A_{450 nm}。

1.6 qRT-PCR检测心肌细胞来源外泌体miRNA及淋巴细胞中IL-38的mRNA表达水平

根据说明书提取LPS诱导前后心肌细胞来源外泌体的总RNA，反转录合成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增。扩增体系为：10 μL SYBR FAST qPCR Master Mix，0.5 μL上游/下游引物，1 μL cDNA模板，8 μL ddH₂O。反应程序为：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性5 s，56 ℃退火10 s，72 ℃延伸25 s，共40个循环。引物序列：

miR-4795-F/R：GGGAGAAGTGGCTAATAA，AA CTGGTGTCGTGGAGTCGGC；

miR-5089-F/R：GGGGTGGGATTTCTGAG，AAC TGGTGTCGTGGAGTCGGC；

miR-4319-F/R：GGGTCCCTGAGCAA，AACTG GTGTCGTGGAGTCGGC；

miR-1275-F/R：GGGGTGGGGGAGAG，AACTG GTGTCGTGGAGTCGGC；

miR-556-F/R：GGGGATGAGCTCATTGTAA，AA CTGGTGTCGTGGAGTCGGC；

miR-1255-F/R：GGGAGGATGAGCAAAGAAA G，AACTGGTGTCGTGGAGTCGGC；

U6-F/R：CTCGCTTCGGCAGCACATATACT，AC GCTTCACGAATTTGCGTGTC，由武汉天一辉远生物科技有限公司合成。

按相同步骤提取淋巴细胞总RNA等，引物序列：IL-38-F/R，TGTACCCAGAGGAGCATIL-38，

GAPDH-F/R：ACGGCAAAGCCTTAGAT；CAAG TTCAACGGCACAG，CCAGTAGACTCCACGACAT，检测淋巴细胞中IL-38 mRNA水平。

1.7 通过生物信息学挖掘脓毒症心肌细胞损伤的关键miRNA

使用关键词：LPS，脓毒症心肌细胞损伤，miRNA，外泌体在GEO数据库中进行搜索，将下载的数据分为正常组和脓毒症心肌细胞损伤组，用DESeq2构建表达矩阵并进行差异分析，绘制火山图。miRNA差异分析的结果中以|log2FoldChange|≥1且P≤0.05为阈值筛选显著差异的miRNA。

1.8 淋巴细胞中双荧光素酶报告基因检测

参照说明书，用Lipofectamine 2000试剂转染IL-38 3' UTR（野生型和突变型）组和miR-1275 mimics或100 nmol/L 抑制剂组细胞。48 h后收集细胞，弃去细胞培养液，加入100 μL细胞裂解液。收集细胞裂解液，加入100 μL萤火虫荧光素酶检测试剂，混匀后放入全功能微孔板检测仪，计算萤火虫荧光素酶活性（F值）。加入100 μL海肾荧光素酶检测工作液，混匀后放入全功能微孔板检测仪，计算海肾荧光素酶活性（R值）。完成所有样品测定后，根据检测到的F值和R值，计算得出相对荧光素酶活性。

1.9 流式细胞术检测

实验分为2组：对照组和LPS-exosome组。对照组上层培养淋巴细胞，下层培养经LPS诱导的心肌细胞，共培养48 h。LPS-exosome组上层将淋巴细胞和经LPS诱导的心肌细胞来源外泌体混合培养，下层培养经LPS诱导的心肌细胞。然后收集各组心肌细胞1×10⁶，加入1 mL PBS重悬细胞，离心后弃上清，加入200 μL PBS重悬细胞，再加入10 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，轻轻混匀，4 ℃避光孵育30 min。加入300 μL PBS，用流式细胞仪检测共培养6、12和48 h后细胞凋亡的变化。将经LPS诱导的心肌细胞分为2组：对照组（心肌细胞+LPS）和重组IL-38组（心肌细胞+IL-38预处理+LPS）。检测步骤同上，分别在6、12和48 h后用流式细胞术仪检测细胞凋亡的变化。

1.10 Western blotting检测

收集心肌细胞约1×10⁶进行Western blotting检测，具体步骤同1.4。分别加入兔抗IL-38（稀释比1∶2000）、兔抗Bcl-2（稀释比1∶2000）、兔抗Bax（稀释比1∶1000）、兔抗p-PI3K（稀释比1∶1000）、兔抗p-AKT（稀释比1∶1000）和兔抗GAPDH（稀释比1∶1000），室温孵育1 h。洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，室温孵育1 h。洗膜后加入化学发光试剂，曝光显影后，读取6、12和48 h时的蛋白条带灰度值。

1.11 统计学分析

采用统计学软件SPSS 19.0进行数据分析，数据采用均数±标准差表示。多组间比较采用单因素方差分析，符合方差齐性的两组间数据比较采用SNK检验，不符合方差齐性的两组间数据比较采用Dunnett's T₃检验。P<0.05提示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 LPS诱导构建心肌细胞损伤模型

经LPS诱导的心肌细胞来源外泌体中检测到6种miRNA（miR-4795、miR-5089、miR-4319、miR-1275、miR-556和miR-1255），其中miR-1275的表达量最高（图1）。

与正常的心肌细胞相比，LPS诱导后心肌细胞增殖能力下降（P<0.05，图2A）。火山图和热图表明LPS诱导后心肌细胞中的miR-1275均上调，因此选择miR-1275作为后续研究对象（图2B、C）。

2.2 LPS诱导的心肌细胞来源外泌体通过上调IL-38促进淋巴细胞增殖

培养液中未检测到CD63和TSG101的表达，而正常心肌细胞和LPS诱导的心肌细胞损伤模型来源外泌体均检测到外泌体标志物CD63和TSG101蛋白表达（图3A）。LPS-exosome组淋巴细胞增殖活力高于对照组和Exosome组（P<0.05，图3B）。而对照组与exosome组之间淋巴细胞增殖活力差异无统计学意义（P>0.05）。LPS-exosome组淋巴细胞IL-38的 mRNA和蛋白表达水平高于对照组（P<0.05，图3C、D）。与对照组比较，miR-1275 mimics增加WT-IL-38的荧光素酶活性（P<0.05）；miR-1275抑制剂能够显著降低WT-IL-38的荧光素酶活性（P<0.05，图3E）。

2.3 LPS诱导的心肌细胞来源外泌体和淋巴细胞混合培养抑制心肌细胞凋亡

与对照组相比，LPS-exosome组心肌细胞在共培养12 h和48 h后细胞凋亡率降低（P<0.05，图4）。

2.4 IL-38介导PI3K/AKT通路参与外泌体对心肌细胞凋亡的影响

与对照组相比，Re-IL-38组心肌细胞在培养6、12和48 h后细胞凋亡率均降低（P<0.05，图5）。促凋亡蛋白Bax相对表达量均降低（P<0.05），抗凋亡蛋白Bcl-2相对表达量均升高（P<0.05，图6A）。与对照组比较，Re-IL-38组心肌细胞在培养6、12和48 h后，PI3K/AKT通路蛋白p-PI3K和p-AKT相对表达量均升高（P<0.05，图6B）。

3 讨论

外泌体与免疫应答、病毒致病性、妊娠、心血管疾病、中枢神经系统相关疾病和癌症进展有关，是细胞间通讯的主要媒介^［16］。研究表明，外泌体释放的miRNAs可通过抑制心肌细胞凋亡、促进线粒体功能和保持心脏收缩力对心肌细胞产生保护作用^［17-19］。据查阅文献，已发表的研究主要集中在利用含有miRNAs的干细胞外泌体治疗心肌损伤^［18］，而当心肌细胞受到损伤时，它们自身是否释放外泌体却一直被忽视。Gupta等^［20］成功地从大鼠原代心肌细胞中分离出外泌体，其数量不均，直径在40~300 nm。本研究用LPS心肌细胞的增殖能力显著下降，说明成功诱导建立了脓毒症心肌损伤模型。随后，从LPS诱导的脓毒症心肌损伤细胞模型中分离得到外泌体。

本研究通过数据库搜索发现在心肌炎中miR-1275的表达上调。已有研究发现，miR-1275在心力衰竭患者和缺氧/复氧处理的AC16细胞中高表达，抑制miR-1275可以缓解损伤造成的细胞活力下降^［21］。对心肌梗塞患者而言，miR-1275可作为心肌梗塞的生物标志物^［22］。通常，miRNA通过抑制下游靶基因的转录后表达来调控细胞功能，本研究的实验数据也证实IL-38在淋巴细胞中受到miR-1275的正向调控，在心肌细胞中的发挥抗凋亡功能，提示IL-38通过激活抗炎反应参与miR-1275减轻脓毒症心肌损伤的保护机制。

脓毒症是对局部严重感染的全身炎症反应，过度炎症会导致不良的左心室重塑和心力衰竭，决定心肌损伤的程度和疾病的后续进程^［23］。但心肌细胞来源外泌体对炎症反应的调控机制还尚待研究。白细胞介素家族是调节炎症反应的关键介质，IL-38是该家族的细胞因子之一，在体内外均具有广泛的抗炎作用。IL-38可通过促进M1巨噬细胞分化为M2巨噬细胞、抑制炎症小体的活化、增加抗炎细胞因子的分泌来缓解心肌损伤^［24］。IL-38可以降低脓毒症小鼠的死亡率，控制有害的炎症联级反应，减少心肌损伤和心肌纤维化^［25］。Song等^［26］报道小鼠心肌细胞释放的外泌体携带整合素αvβ6，且αvβ6将LPS刺激下B淋巴细胞表达的潜在转化生长因子β转化为活性形式。这些研究表明，心肌细胞来源的外泌体可能具有利于B淋巴细胞生成的功能。本研究中，心肌细胞与淋巴细胞共培养时，外泌体miR-1275与淋巴细胞相互作用，参与免疫应答，导致下游IL-38表达增加和LPS诱导的心肌凋亡细胞百分比下降。这说明心肌来源的外泌体可以通过促进淋巴细胞增殖和免疫调节抗炎因子的释放来保护脓毒症中受损的心肌细胞。

PI3K是真核生物内一类催化肌醇与磷酯酰肌醇的重要激酶，可参与调控心肌细胞的生长发育，对心脏病理重塑和衰竭至关重要^［27］。AKT是PI3K下游的关键靶点，是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，主要参与细胞的生长和抗凋亡，与心血管功能调节密切相关^{［28， 29］}。PI3K/AKT信号通路是一种典型的心脏保护通路，激活该通路可延缓炎症反应^{［30， 31］}。本研究结果显示，Re-IL-38处理后，促凋亡蛋白Bax表达降低，抗凋亡蛋白Bcl-2表达升高，且心肌细胞凋亡率明显降低，PI3K和AKT磷酸化蛋白表达显著升高。这表明IL-38可通过激活PI3K/AKT通路，对LPS诱导的心肌细胞损伤产生保护作用，从而抑制凋亡。Wei等^［32］研究发现，IL-38通过抑制巨噬细胞炎症减轻心肌缺血/再灌注损伤。也有研究证明，IL-38通过影响树突状细胞来减弱炎症反应，以此在心肌梗死后的心室重塑中起保护作用^［33］。而我们的结果证明了外泌体来源的miR-1275通过介导IL-38的表达保护脓毒症心肌细胞损伤。这为心肌细胞来源外泌体在脓毒症心肌损伤治疗中提供了新的理论依据。

综上所述，经LPS诱导的心肌细胞来源外泌体可通过其包含的miR-1275作用于淋巴细胞，进而调控淋巴细胞IL-38的表达，抑制LPS诱导的心肌细胞凋亡。因此，心肌细胞来源外泌体可作为脓毒症心肌损伤的潜在治疗策略。

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基金资助

河北省2024年政府资助临床医学优秀人才培养项目(ZF2024198)

2022年度河北省“三三人才工程”资助项目(C20221091)

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