芪黄健脾滋肾颗粒通过抑制MyD88/NF-κB通路减轻MRL/lpr小鼠肾损害

Qihuang Jianpi Zishen Granules ameliorate renal damage in MRL/lpr mice by inhibiting the MyD88/NF-κB pathway

摘要

目的 基于MyD88/NF-κB通路探讨芪黄健脾滋肾颗粒（QJZ）改善MRL/lpr小鼠肾损害的作用机制。 方法 6只雌性C57BL/6小鼠为正常对照组（Control组），将30只雌性MRL/lpr小鼠随机分为模型组（Model组）、芪黄健脾滋肾颗粒低剂量组（QJZ-L组）、芪黄健脾滋肾颗粒中剂量组（QJZ-M组）、芪黄健脾滋肾颗粒高剂量组（QJZ-H组）、泼尼松组（Pred组），6只/组。干预8周后取各组小鼠的尿液、全血及肾脏组织，生化试剂盒检测肾损害指标：24 h尿蛋白定量（24 h PRO）、尿总蛋白肌酐比值（UTPCR）、尿蛋白肌酐比（UACR）。ELISA法检测血清中免疫球蛋白G（IgG）、补体3（C3）、补体4（C4）、抗双链DNA抗体（anti-dsDNA）、干扰素γ（IFN-γ）、白细胞介素17（IL-17）。肾脏组织进行HE染色和透射电镜观察肾小球超微结构。采用RT-qPCR、Western blotting和免疫组化法检测肾组织中MyD88/NF-κB通路相关分子的表达。 结果 与Model组相比，QJZ-L、QJZ-M、QJZ-H和Pred组24 h PRO、UTPCR、UACR、IgG、anti-dsDNA、IFN-γ、IL-17降低（P<0.01），C3、C4水平升高（P<0.01）。HE染色结果显示，与Model组比较，各组肾小球内皮细胞增生、系膜增厚减轻。透射电镜显示，各组肾小球电子致密物沉积、炎性细胞浸润较Model组减轻。RT-qPCR和免疫组化结果显示，与Model组相比，QJZ-L、QJZ-M、QJZ-H和Pred组肾脏中MyD88、NF-κB表达下降（P<0.05）。Western blotting结果显示，各组肾脏中p65、p52蛋白水平低于Model组（P<0.01）。 结论 芪黄健脾滋肾颗粒能够改善MRL/lpr小鼠肾损害，其机制可能与抑制MyD88/NF-κB通路过度激活有关。

Abstract

Objective To investigate the mechanism of Qihuang Jianpi Zishen Granules (QJZ) for ameliorating renal damage in MRL/lpr mice. Methods With 6 female C57BL/6 mice as the normal control group, 30 female MRL/lpr mice were randomized into model group, QJZ treatment groups at low, moderate and high doses, and prednisone treatment group (n=6). After 8 weeks of treatment, the mice were examined for 24-h urine protein, creatinine and albumin levels, serum levels of IgG, complement 3 (C3), C4, anti-dsDNA, interferon γ (IFN‑γ) and interleukin 17 (IL-17). Kidney tissues were sampled for histopathological examination with HE staining and observation of glomerular ultrastructure changes using transmission electron microscopy (TEM). The expressions of MyD88/NF-κB pathway-related molecules in the kidney tissue were detected using RT-qPCR, Western blotting and immunohistochemistry. Results Compared with those in the model group, the mice treated with QJZ at the 3 doses and prednisone showed significant reductions in the renal injury biomarkers and serum IgG, anti-dsDNA, IFN‑γ and IL-17 levels and elevation of serum C3 and C4 levels. HE staining revealed lessened glomerular endothelial cell proliferation and mesangial thickening in all the treatment groups. TEM observation further demonstrated reduced electron-dense deposits and diminished inflammatory cell infiltration in the glomeruli in the intervention groups. QJZ at the 3 doses and prednisone treatment all significantly lowered renal expression levels of MyD88, NF-κB, p65 and p52 in the mouse models. Conclusion QJZ can improve renal damage in MRL/lpr mice possibly by inhibiting overactivation of the MyD88/NF-κB pathway.

Graphical abstract

关键词

MRL/lpr小鼠 / MyD88/NF-κB通路 / 系统性红斑狼疮 / 肾损害 / 芪黄健脾滋肾颗粒

Key words

MRL/lpr mice / MyD88/NF‑κB pathway / systemic lupus erythematosus / renal damage / Qihuang Jianpi Zishen Granules

系统性红斑狼疮（SLE）是一种难治性自身免疫性疾病，可造成多器官损害，约60%患者出现肾损害，进展为狼疮性肾炎（LN），临床表现为蛋白尿、血尿和肾功能衰竭等，甚至危及生命^{［1， 2］}。SLE的发病机制复杂多样，目前研究认为与环境、遗传、表观遗传失调及T、B细胞功能紊乱等有关^［3］。SLE目前无法根治，主要依赖糖皮质激素、免疫抑制剂和生物制剂等控制进展^［4］。现临床研究热点聚焦在TLR/IFN、BAFF/APRIL关键通路的靶向治疗策略^［5］。而中医药在SLE肾损害的防治方面具有独特优势，可发挥多成分、多靶点的调节作用，其具体作用机制值得深入研究^［6］。本课题组基于SLE“脾肾亏虚”核心证候，依托新安医学“固本培元”理论研创院内制剂芪黄健脾滋肾颗粒。前期多项临床随机对照研究表明，芪黄健脾滋肾颗粒对改善SLE疾病活动、尿蛋白水平、免疫炎症反应等方面具有确切的疗效^［7-9］。但具体机制仍不明确，前期通过狼疮小鼠模型发现，芪黄健脾滋肾颗粒可能抑制JAK1/STAT1通路改善肾足细胞凋亡^［10］。

研究发现，髓样分化因子88（MyD88）/核因子-κB（NF-κB）信号通路的过度激活是SLE肾损害的关键途径^［11］。MyD88是Toll样受体通路的核心适配蛋白，可传递信号至下游NF-κB通路，驱动免疫细胞活化和多种促炎因子的产生，自身抗体增多，加剧免疫复合物沉积和肾小球硬化^{［12， 13］}。在小鼠模型体内，敲除MyD88基因可显著减小鼠尿蛋白水平及炎症反应，MyD88可能是SLE肾损害的潜在干预靶点^［14］。芪黄健脾滋肾颗粒作为特色院内制剂，黄芪甲苷是其主要活性成分之一，有研究表明，黄芪甲苷可调控NF-κB通路改善大鼠急性肾损害^［15］。因此，芪黄健脾滋肾颗粒改善SLE肾损害的机制是否与调节MyD88/NF-κB信号通路有关，值得进一步研究。MRL/lpr小鼠作为经典的自发性狼疮模型，广泛应用于SLE的体内研究^［16］。因此，本研究基于MRL/lpr小鼠模型，探讨芪黄健脾滋肾颗粒是否通过抑制MyD88/NF-κB通路的激活改善SLE肾损害作用机制，为其干预SLE肾损害的理论创新提供科学支撑。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级6~8周龄雌性MRL/lpr狼疮小鼠和C57BL/6小鼠，体质量18~22 g；购于上海斯莱克实验动物有限责任公司［SCXK（沪）2022-0004］，饲养于合肥综合性国家科学中心人工智能研究院动物实验平台SPF级条件下，保持适宜温度和湿度，并提供自由饮用水和食物，保持12 h光照与黑暗循环。所有小鼠适应性喂养1周后进行实验。本研究经安徽中医药大学实验动物伦理委员会审批通过（伦理批号：AHUCM-mouse-2022130）。

1.1.2 药物与试剂

芪黄健脾滋肾颗粒（皖药制备字：20220041000，批号：20240610）是由黄芪、盐菟丝子、熟地黄、山药、麸炒白术、茯苓、覆盆子、金樱子组成，10 g/袋。将芪黄健脾滋肾颗粒加入生理盐水制备成QJZ混悬液。依据人与小鼠的等效剂量法折算成小鼠的低剂量为3.9 g/（kg·d）、中剂量为7.8 g/（kg·d）、高剂量为15.6 g/（kg·d）。泼尼松片（天津天药药业有限公司，国药准字：H12020689），5 mg/片，将泼尼松片研磨成粉末后，加入生理盐水制备成浓度为泼尼松混悬液，折算成小鼠药物剂量为5 mg/（kg·d）。

生化试剂盒：尿白蛋白、尿肌酐、尿蛋白定量（南京建成生物），ELISA试剂盒：anti-dsDNA、IgG、C3、C4、IFN-γ、IL-17（武汉基因美）；p65抗体（abcam），p52抗体（CST），GAPDH抗体、山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG（Zsbio）；ECL超敏发光试剂盒（Biosharp）；MyD88、NF-κB引物合成（Sangon Biotech）；苏木素染液、中性树胶（ebiogo），二甲苯（天津凯通化学）；DAB染色液（福州迈新）；PBS缓冲液粉末、柠檬酸盐修复液（北京中杉）。

1.1.3 主要仪器

电泳仪，转膜仪（上海天能）；荧光定量PCR仪（Thermo Scientific）；离心机（安徽嘉文）；生物组织包埋机（湖北亚光）；PAP Pen免疫组化笔（ebiogo）；显微镜（OLYMPUS）；透射电镜（JEOL）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及给药

将30只雌性MRL/lpr小鼠随机分为模型组（Model组）、芪黄健脾滋肾颗粒低剂量组（QJZ-L组）、芪黄健脾滋肾颗粒中剂量组（QJZ-M组）、芪黄健脾滋肾颗粒高剂量组（QJZ-H组）、泼尼松组（Pred组），6只/组。6只雌性C57BL/6小鼠为正常对照组（Control组）。QJZ低、中、高剂量组分别予以剂量3.9 g/（kg·d）、7.8 g/（kg·d）、15.6 g/（kg·d）的QJZ混悬液灌胃，1次/d；Pred组予以剂量5 mg/（kg·d）混悬液灌胃，1次/d；Model组及Control组予等量生理盐水灌胃，1次/d。各组均持续干预8周。每日观察小鼠精神状态、毛发脱落情况、皮损情况，每周记录小鼠体质量。

1.2.2 生化试剂盒检测小鼠肾损害指标

留取各组小鼠的尿液，利用尿蛋白定量试剂盒检测24 h尿蛋白定量（PRO），尿蛋白试剂盒检测尿总蛋白含量，尿白蛋白试剂盒检测尿白蛋白，尿肌酐试剂盒检测尿肌酐含量，计算尿总蛋白肌酐比值（UTPCR）和尿白蛋白肌酐比（UACR）。具体操作流程参照试剂盒说明书。

1.2.3 ELISA检测小鼠免疫炎症指标

取小鼠全血，经离心后得到血清，采用ELISA试剂盒检测血清中免疫球蛋白G（IgG）、补体3（C3）、补体4（C4）、抗双链DNA抗体（anti-dsDNA）、干扰素γ（IFN-γ）、白细胞介素17（IL-17）水平，具体操作流程参考试剂盒说明书。

1.2.4 肾脏组织的HE染色

肾脏组织在4%多聚甲醛中固定48 h后用流水冲洗，依次使用75%、85%、90%、95%的乙醇进行脱水，放入二甲苯中进行透明，石蜡包埋，后进行切片和脱蜡程序。将肾脏组织切片浸没在苏木素中染5 min，蒸馏水清洗；再使用含1%盐酸的酒精分化5 s，再次清洗；使用饱和碳酸锂溶液返蓝，再次清洗。切片放入95%乙醇脱水2 min，浸没在伊红溶液中染色3 min，再次清洗。清洗后的切片置于无水乙醇5 min进行脱水，重复3次，放入二甲苯5 min进行透明，重复2次，中性树胶封片。在显微镜下观察结果和记录，并对肾小球进行组织病理学评分^［17］。

1.2.5 透射电镜观察肾小球超微结构

将肾脏组织进行一次固定（2.5%戊乙醛）、二次固定（1%四氧化锇溶液）、梯度乙醇脱水、树脂渗透、包埋，制备超薄切片。用醋酸铀酰水溶液染色30 min，枸橼酸铅染色5 min，后用蒸馏水彻底漂洗，避免染色剂结晶，用透射电子显微镜观察肾小球结构及记录。

1.2.6 RT-qPCR

肾组织加入1 mL TRIzol裂解，进行分层和RNA沉淀，完成RNA的提取。进行RT反应，反应程序：65 ℃ 5 min（RNA变性），冷却2 min，42 ℃ 30 min（逆转录），70 ℃ 5 min（灭活酶），获取cDNA，-80 ℃保存备用。利用PCR仪进行RT-qPCR反应检测，mRNA相对表达量使用2^-△△Ct法进行计算，以GAPDH作为内参。引物由安徽中抗生物技术有限公司合成（表1）。

1.2.7 Western blotting

肾组织加入RIPA细胞裂解液600 µL进行裂解，12 000 r/min离心15 min，收集上清液，得到组织总蛋白。按照1∶4加入5× SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，沸水浴加热15 min，冷却后的蛋白样品放入SDS-PAGE凝胶加样孔内，恒压80 V，蛋白电泳1 h；转膜1 h将蛋白转印至PVDF膜，室温摇床封闭2 h。孵育一抗：加入兔源p65（1∶5000）、p52（1∶1000）及鼠源GAPDH（1∶1000），4 ℃缓慢摇动孵育过夜，TBST漂洗3次；加入HRP标记的对应兔、鼠二抗（1∶20 000）室温孵育1.2 h，TBST漂洗3次；利用ECL发光试剂盒用化学发光成像系统拍照留存，使用Image J软件进行灰度分析。

1.2.8 免疫组化

肾组织切片放入3%H₂O₂中室温孵育10 min，PBS冲洗3次；滴加5%BSA，室温密封30 min。滴加一抗：兔抗人MyD88抗体（1∶200）、鼠抗人NF-κB抗体（1∶100），37 ℃孵育60 min。滴加二抗：HRP标记的山羊抗兔/鼠IgG，37 ℃孵育30 min。PBS冲洗3次，滴加DAB显色液，显微镜下控制显色时间，有阳性终止显色，蒸馏水冲洗干净；苏木素复染2 min，1%盐酸酒精分化数秒，碳酸锂溶液蓝化30 s，脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察结果。

1.3 统计学分析

应用GraphPad Prism 9.0和SPSS 23.0软件进行数据统计分析。符合正态分布的数据以均数±标准差表示，多组比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 芪黄健脾滋肾颗粒对小鼠尿蛋白的影响

与Control组相比，Model组24 h PRO、UTPCR、UACR均升高（P<0.01）；与Model组相比，QJZ-L、QJZ-M、QJZ-H、Pred组24 h PRO、UACR降低，QJZ-H、Pred组UTPCR降低（P<0.01，图1）。

2.2 芪黄健脾滋肾颗粒对小鼠免疫炎症的影响

与Control组相比，Model组血清中IgG、anti-dsDNA、IFN-γ、IL-17水平升高，C3、C4水平降低（P<0.01）；与Model组相比，QJZ-L、QJZ-M、QJZ-H、Pred组IgG、anti-dsDNA、IFN-γ、IL-17水平降低，C3、C4水平升高（P<0.01，图2）。

2.3 芪黄健脾滋肾颗粒对小鼠肾损害的影响

HE染色结果显示，Control组肾小球毛细血管袢结构完整，内皮细胞及系膜细胞无增生，基底膜无增厚，无炎性细胞浸润、水肿或纤维化。Model组出现明显的毛细血管内皮细胞增生和系膜增生，基底膜增厚，伴有淋巴细胞大量浸润；而QJZ-L、QJZ-M、QJZ-H和Pred组的内皮细胞增生、系膜增厚较Model组减轻，淋巴细胞浸润减少，且肾小球病理学评分低于Model组（P<0.05，图3）。

在透射电镜下观察肾小球的超微结构，Control组肾小球超微结构层次清晰，无病理改变。Model组肾小球基底膜表面、系膜区和毛细血管袢内皮细胞可见电子致密物的沉积，伴随着系膜细胞增生、炎性细胞浸润和基质增多。而QJZ-L、QJZ-M、QJZ-H和Pred组的肾小球电子致密物沉积和系膜细胞增生、炎性细胞浸润较Model组减轻（图4）。

2.4 芪黄健脾滋肾颗粒对小鼠肾组织中MyD88、NF-κB表达的影响

与Control组相比，Model组肾组织中MyD88、NF-κB mRNA的表达升高（P<0.01）；与Model组相比，QJZ-L、QJZ-M、QJZ-H和Pred组MyD88、NF-κB mRNA的表达降低（P<0.01，图5A、B）。免疫组化结果显示，Model组MyD88、NF-κB在肾组织中有较强的染色，处于广泛表达状态；QJZ-L、QJZ-M、QJZ-H和Pred组MyD88、NF-κB在肾组织中的染色较Model组减轻，表达水平下降（P<0.05，图5C~E）。

2.5 芪黄健脾滋肾颗粒对小鼠肾组织中p65、p52蛋白水平的影响

与Control组相比，Model组肾组织中p65、p52蛋白水平升高（P<0.01）；与Model组相比，QJZ-L、QJZ-M、QJZ-H和Pred组p65、p52蛋白水平降低（P<0.01，图6）。

3 讨论

肾损害是SLE最常见的系统损害，可导致严重的肾功能衰竭，早期干预对SLE的进展和预后起到关键作用^［18］。在中医认识中，SLE归属于“阴阳毒”、“红蝴蝶疮”等范畴，出现肾损害表现又称为“肾痹”，总体核心病机呈现“脾肾亏虚为本、瘀毒湿热为标”的特点^{［19， 20］}。芪黄健脾滋肾颗粒具有健脾滋肾、益气固元的功效，在临床应用中疗效明显。方中黄芪、菟丝子为君药。黄芪有益气固表，健脾升阳之效，菟丝子滋补肾精。黄芪的主要成分是多糖、黄酮类及皂苷等，黄芪多糖具有抗炎、抗氧化作用，能抑制NF-κB通路的活化来减轻小鼠体内炎症反应^［21］。黄芪多糖可抑制TGF-β1/Smad/AP-1通路激活抑制慢性肾衰竭大鼠肾纤维化^［22］。菟丝子含有黄酮类、木脂素类等化学成分，具有免疫调节、抗肿瘤等作用^［23］。臣药以熟地黄补肾益精，山药健脾益肾。地黄提取物能调节Nrf2/NF-κB信号通路，抑制IL-6、TGF-β1的表达，改善小鼠肾纤维化，对肾脏具有保护作用^［24］。山药多糖具有抗氧化、清除自由基等药理作用。佐使以白术、茯苓健脾利湿，金樱子、覆盆子益肾固精。现代研究发现，白术内酯调节NF-κB和Nrf2的信号通路，减少TNF-α、IL-6的产生，起到抗炎、抗氧化作用^［25］。茯苓提取物可抑制PI3K/AKT通路，促进血管生成和降低炎症水平^［26］。覆盆子含有萜类、脂肪酸类等成分，具有抗炎、抗骨质疏松等药理活性^［27］。金樱子含有维生素C、花青素、黄酮类化合物等。金樱子提取物可降低NLRP3信号通路活化抑制肾小管上皮细胞间质化从而改善糖尿病肾病^［28］。诸药合用，健脾滋肾，温而不燥，引邪下行。本研究中HE染色和透射电镜结果显示，芪黄健脾滋肾颗粒改善MRL/lpr小鼠肾脏肾小球系膜增生、免疫复合物沉积和炎症细胞浸润，这表明芪黄健脾滋肾颗粒具有一定的肾脏保护作用，与既往研究结果一致。另一方面，本研究结果也进一步验证了芪黄健脾滋肾颗粒的干预肾损害的临床有效性。

SLE补体系统缺陷，释放自身抗原，导致体内anti-dsDNA升高。免疫复合物沉积于SLE肾脏中，炎症相关通路被激活，导致促炎因子IFN-γ、IL-17分泌增多，肾小球滤过屏障的通透性增加，导致24 h PRO、UTPCR、UACR升高，24 h PRO、UTPCR、UACR用于评估肾脏损害和尿蛋白程度。IFN-γ可调节SLE体内pSTAT1信号，促进ISGs基因表达，进而加剧炎症反应^［29］。既往研究表明，IL-17调节SLE体内B细胞STAT3信号，促进B细胞分化和TGF-β、COL1A1等纤维化因子的表达，加快肾小球系膜细胞增殖，累及肾脏系统^［30］。本研究结果表明，芪黄健脾滋肾颗粒可降低MRL/lpr小鼠anti-dsDNA、IgG、肾损害指标和促炎因子水平，升高C3、C4。说明芪黄健脾滋肾颗粒能够有效地改善SLE免疫炎症紊乱，减轻肾损害。

本研究通过RT-qPCR和免疫组化验证了芪黄健脾滋肾颗粒对MyD88/NF-κB信号通路的影响，结果显示芪黄健脾滋肾颗粒可降低MRL/lpr小鼠肾脏中MyD88、NF-κB的表达水平。MyD88/NF-κB通路在SLE肾损害的炎症调控机制中发挥重要作用，可介导机体免疫细胞产生促炎因子。MyD88是一种胞质可溶性适配器蛋白，由N端的死亡域、中间区域及C端的TIR结构域构成，是先天免疫信号转导的核心枢纽^［31］。MyD88的TIR结构域识别被激活的受体，调控下游基因IRAK、NF-κB和MAPK等，分泌促炎因子，加快免疫炎症反应^［32］。研究表明，狼疮性肾炎中TLR4/MyD88信号通路的激活可诱导肾小球内皮细胞损伤^［33］。与本研究结果比较，进一步验证了MyD88在SLE肾损害中的作用，同时提示芪黄健脾滋肾颗粒可干预MyD88的表达。TLR2可通过激活MyD88/NF-κB通路，加剧肾小球系膜基质沉积，敲低MyD88后，MRL/lpr小鼠尿蛋白和肾脏病理情况得到改善^［34］。

NF-κB是一类转录因子家族，主要由p65、p52、RelB、c-Rel和p50构成，调控着机体免疫稳态、细胞增殖、分化和凋亡等过程^［35］。而在狼疮性肾炎中，NF-κB处于高表达状态^［36］。本研究Western blotting结果显示，芪黄健脾滋肾颗粒降低MRL/lpr小鼠肾脏中p65、p52蛋白的表达，提示MyD88/NF-κB通路参与介导SLE肾损害分子机制。既往研究发现，在MRL/lpr小鼠模型中，激活NF-κB信号通路可调控铁死亡相关因子GPX4、SLC7A1的表达，进而加重肾脏损害^［37］。在中医药干预机制方面，冬虫夏草可调节STAT3/mTOR/NF-кB信号通路减轻MRL/lpr小鼠蛋白尿和肾脏炎症浸润，改善肾纤维化程度^［38］。而本研究发现，芪黄健脾滋肾颗粒能够减低NF-кB的表达，发挥抗炎作用，与其研究结果对应。淫羊藿苷能抑制MRL/lpr小鼠NF-κB和NLRP3 炎性小体活化，减少趋化因子CCL2的产生和巨噬细胞浸润，缓解狼疮性肾炎^［39］。这进一步证实了NF-κB在狼疮性肾炎中占据重要地位。

综上所述，芪黄健脾滋肾颗粒可下调MRL/lpr小鼠MyD88、p65、p52、免疫学和肾损害指标，上调C3、C4水平，改善MRL/lpr小鼠免疫炎症紊乱及肾损害，其机制可能与抑制MyD88/NF-κB通路有关。本研究为中医药干预SLE提供一定的科学依据，但也存在不足。由于中药组方存在多成分、多靶点的特点，在机制研究上需要较多的实验验证。课题组后续将补充细胞功能验证，探讨芪黄健脾滋肾颗粒的潜在干预核心靶点，为今后临床广泛应用奠定理论基础。

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基金资助

国家自然科学基金(82104782)

安徽省临床医学研究转化专项(202304295107020114)

安徽省临床医学研究转化专项(202304295107020115)

大健康研究院新安医学与中医药现代化研究所专项(2023CXMMTCM004)

大健康研究院新安医学与中医药现代化研究所专项(2023CXMMTCM015)

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