2，6-二甲氧基-1，4-苯醌通过抑制NLRP3炎症小体活化改善葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠溃疡性结肠炎

2,6-dimethoxy-1,4-benzoquinone alleviates dextran sulfate sodium-induced ulcerative colitis in mice by suppressing NLRP3 inflammasome activation

摘要

目的 探究2，6-二甲氧基-1，4-苯醌（DMQ）对葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的小鼠溃疡性结肠炎的作用及机制。 方法 将18只雄性C57BL/6J小鼠随机分为3组：WT组、DSS组和DMQ干预组，6只/组。DSS组和DMQ干预组小鼠均采用DSS诱导建立溃疡性结肠炎模型，DMQ干预组小鼠给予20 mg/kg的DMQ腹腔注射，DSS组小鼠给予无菌PBS腹腔注射。监测各组小鼠的体质量变化、疾病活动指数（DAI）、结肠长度、脾脏质量、HE染色、组织学评分，探究DMQ对DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠是否具有缓解作用。流式细胞术检测小鼠肠系膜淋巴结和脾脏组织中Th17细胞和分泌Th1型细胞因子IFN-γ的CD8⁺ T细胞比例变化，Western blotting检测紧密连接蛋白（Occludin、ZO-1）和NLRP3炎症小体活化相关蛋白（成熟的Caspase-1，即p20）以及ELISA检测炎症因子（IL-1β、TNF-α）。小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM）由脂多糖（LPS）预处理、DMQ干预后，应用尼日利亚菌素（Nigericin）活化经典途径NLRP3炎症小体；以及采用人外周血单个核细胞（PBMC），应用尼日利亚菌素（Nigericin）活化经典途径NLRP3炎症小体，LPS活化替代途径NLRP3炎症小体，通过Western blotting、ELISA和流式细胞术等技术，检测了炎症相关蛋白表达、炎性因子分泌及细胞焦亡情况。 结果 与DSS组相比，DMQ治疗可缓解DSS小鼠的体质量下降（P<0.001）、结肠长度缩短（P<0.05）、脾脏质量增加（P<0.001）和结肠炎症（P<0.05）。在DMQ治疗组小鼠肠系膜淋巴结和脾脏组织中，流式细胞术结果显示：T细胞中Th17细胞比例和分泌Th1型细胞因子IFN-γ的CD8⁺T细胞比例降低（P<0.05），Western blotting结果显示：Occludin和ZO-1的蛋白表达升高，而Caspase-1的蛋白表达降低；进一步实验结果显示：DMQ可有效抑制小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM）中经典途径NLRP3炎症小体活化和人外周血单个核细胞（PBMC）中经典途径NLRP3炎症小体和替代途径NLRP3炎症小体活化（P<0.05）以及Caspase-1依赖性细胞焦亡。 结论 DMQ通过抑制NLRP3炎症小体活化发挥对DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎的保护作用。

Abstract

Objective To investigate the therapeutic mechanism of 2,6-dimethoxy-1,4-benzoquinone (DMQ) for alleviating dextran sulfate sodium (DSS)-induced ulcerative colitis (UC) in mice. Methods Eighteen male C57BL/6J mice were equally randomized into control group, DSS group and DMQ treatment group. In DSS and DMQ groups, the mice were treated with DSS in drinking water to induce UC, and received intraperitoneal injections of sterile PBS or DMQ (20 mg/kg) during modeling. The changes in body weight, disease activity index (DAI), colon length, spleen weight, and colon histological scores of the mice were examined, and the percentages of Th17 and IFN-γ⁺ CD8⁺ T cells in the mesenteric lymph nodes and spleen were analyzed using flow cytometry. The expressions of tight junction proteins (Occludin and ZO-1), proteins associated with inflammasome activation (caspase-1 and p20), IL-1β and TNF-α in the colon tissues were detected using Western blotting or ELISA. In the cell experiment, mouse bone marrow-derived macrophages (BMDMs) primed with lipopolysaccharide (LPS) were treated with DMQ, followed by stmulation with nigericin to activate the classical NLRP3 inflammasome pathway. In cultured human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) treated with either LPS alone or LPS plus nigericin, the effects of DMQ on inflammasome activation, pyroptosis, and cytokine release were evaluated via Western blotting, ELISA, and flow cytometry. Results In DSS-treated mice, DMQ treatment significantly alleviated DSS-induced body weight loss, colon shortening, spleen enlargement, and colon inflammation. The DMQ-treated mice showed significantly reduced percentages of Th17 cells and IFN-γ⁺ CD8⁺ T cells in the mesenteric lymph nodes and spleen, with increased occludin and ZO-1 expressions and decreased caspase-1 expression in the colon tissue. DMQ obviously inhibited classical NLRP3 inflammasome activation in mouse BMDMs and both the classical and alternative pathways of NLRP3 activation in human PBMCs, causing also suppression of caspase-1-dependent pyroptosis. Conclusion DMQ ameliorates DSS-induced UC in mice by inhibiting NLRP3 inflammasome activation.

Graphical abstract

关键词

2，6-二甲氧基-1，4-苯醌 / NLRP3炎症小体 / 溃疡性结肠炎 / 天然产物

Key words

2,6-dimethoxy-1,4-benzoquinone / NLRP3 inflammasome / ulcerative colitis / natural products

溃疡性结肠炎（UC）是一种临床常见且难以治疗的慢性肠道炎症性疾病（IBD），病变主要累及结直肠，其特征是出血、腹泻和腹痛，并具有临床表现复杂、难诊断、易复发等特点^［1］。流行病学数据显示，UC的发病率在西方国家趋于稳定，但在亚洲、南美洲和非洲等新兴工业化地区呈现显著上升趋势，全球UC患者总数已超680万人，表明该疾病已成为一个日益严重的全球性健康问题^［2］。目前UC的治疗方案通常以药物治疗为主，手术干预主要应用于药物疗效不佳或出现严重并发症的情况^［3］。常用治疗药物包括氨基水杨酸类制剂、糖皮质激素和生物制剂等。其中，氨基水杨酸类药物因其疗效确切、安全性高，成为轻中度患者诱导和维持缓解的首选方案，但需注意其可能引发的肾功能损害以及头痛、消化道不适、过敏反应等不良反应。糖皮质激素在急性期治疗中效果显著，但在缓解期预防复发的作用尚存争议。对于激素治疗效果不理想的患者，可考虑使用免疫抑制剂，但需警惕其潜在的严重不良反应^［4］。然而UC的发病机制尚未完全明确，涉及遗传易感性、环境因素、肠道菌群失衡、免疫系统紊乱及上皮屏障损伤等多重因素^［5］；病理过程中，大量中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞浸润肠粘膜层，引发强烈炎症反应，导致粘膜屏障破坏，进一步影响肠道菌群和免疫稳态^［6］。

NLRP3炎症小体是一种由模式识别受体NLRP3、接头蛋白ASC和前体蛋白Pro-caspase-1共同构成的多聚蛋白复合物^［7］。当病原相关分子模式（PAMPs）或危险相关分子模式（DAMPs）刺激机体时，NLRP3炎症小体活化，促使Pro-caspase-1剪切为活性的caspase-1。进而介导IL-1β和IL-18的成熟分泌，并诱导GSDMD裂解为GSDMD-N，其N端结构域破坏细胞膜启动细胞焦亡，从而清除病原体及危险信号，维持免疫稳态^［8］。NLRP 3炎症小体广泛涉及各种人类疾病，例如神经变性疾病^［9］、代谢紊乱^［10］和自身免疫性疾病^［11］。大量临床数据表明，NLRP3炎症小体在UC的发生发展中起重要作用。UC患者肠粘膜组织中NLRP3炎症小体组分（NLRP3、ASC）的表达上调，疾病的严重程度与结肠组织中巨噬细胞的IL-1β的分泌水平和细胞焦亡程度呈正相关^［12］。目前有研究表明，NLRP3炎症小体抑制剂对DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎模型中展现出显著的预防和治疗作用，提示其可能成为溃疡性结肠炎的新型治疗策略^{［13， 14］}。

近年来，中药及其天然活性成分（如提取物）因其理论框架独特、多靶点多通路、作用温和、毒性低等优点而备受关注，在防治多种病因引起的复杂疾病方面的有效性日益显著^［15］。研究显示，中药复方通过益气养阴、温阳健脾等治法，能够调节免疫功能，改善肠道微循环，减轻黏膜炎症反应^［16］。值得注意的是，近年来从天然产物或草药中提取活性化合物在UC治疗领域取得了突破性进展，相关研究成果为开发新型植物源性药物奠定了理论基础^［17］。本文为开发针对天然产物的疗法提供了基本原理。这些天然产物靶向NLRP3炎症小体，可能减少UC患者的肠道炎症反应。DMQ是从发酵小麦胚芽中提取的主要生物活性化合物，具有抗脂肪形成、抗癌、抗菌、抗疟疾和抗炎的作用^{［18， 19］}，被证实可以抑制NLRP3炎症小体活化进而缓解感染性休克小鼠的症状^［20］。由于NLRP3炎症小体活化在UC发病机制中起关键作用，而目前尚未见DMQ在该领域的研究报道，本研究具有重要的创新价值。同时，从临床转化角度而言，当前UC主流治疗药物存在治疗费用昂贵、不良反应明显等局限性。若本研究能证实DMQ的显著疗效，将为开发兼具良好安全性和经济性的新型UC治疗策略提供重要科学依据，对推动天然药物在炎症性肠病领域的临床应用具有积极意义。因此本研究拟采用葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的C57BL/6小鼠溃疡性结肠炎模型，探讨DMQ对UC样肠炎的治疗效果及其作用途径，旨在为UC的临床治疗提供实验依据和理论支持。

1 材料和方法

1.1 实验动物及材料

8~9周龄SPF级C57BL/6J雄性小鼠，购自江苏集萃药康生物科技股份技术有限公司。所有小鼠均饲养于无特定病原体（SPF）环境，温度22~24 ℃，光照时间为8∶00~20∶00，保持光照循环12 h光照12 h黑暗，定期观察小鼠生活状态，及时调整饲养条件，实验严格按照实验动物管理规范进行。人外周血单个核细胞（PBMC）从健康成年志愿者采集的全血样本中分离获得。本研究所有动物实验通过蚌埠医科大学第一附属医院动物伦理委员会审查（伦理批号：［2020］ 第57号）。本研究所有参与者在参与之前都被告知了研究的目的，根据赫尔辛基宣言的伦理准则以及蚌埠医科大学第一附属医院伦理委员会审查（伦理批号：［2023］ 第400号）。

DMQ（陶术生物，纯度99.46%）；高糖DMEM培养基、RPMI 1640培养基、OPTI-MEM培养基、胎牛血清（Gibco）；双抗（HyClone®）；红细胞裂解液、NP-40裂解液（Beyotime）；Ficoll分离液（人）（天津灏洋生物）；巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）（Navoprotein）；尼日利亚菌素（Nigericin）（陶术生物）；脂多糖（LPS）、佛波醇（PMA）（Invivogen）；ELISA试剂盒（Human IL-1β、TNF-α ELISA kit）、 BCA蛋白浓度测定试剂盒（R&D）；LDH测定试剂盒（碧云天）；葡聚糖硫酸钠（DSS）（MP Blomedicals）；Anti-mouse caspase-1（p20）（AdipoGen）；Anti-β-actin（Abmart）；Anti-ZO-1（Biodragon）；Anti-Occludin（塞维尔）；Anti-GSDMD（Abcam）；APC-IL-17A、PE-IFN-γ（BioLegend）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及处理

将SPF级8周龄、体质量在 24~26 g的雄性 C57BL/6J小鼠，随机分为3组：对照组（WT组）、模型组（DSS组）和DMQ干预组（20 mg/kg），6只/组。DSS组和DMQ干预组小鼠通过饮用3% DSS溶液6 d建立溃疡性结肠炎模型，随后更换为正常饮用水。DMQ干预组在造模期间连续10 d腹腔注射DMQ（20 mg/kg），而DSS组仅给予等量无菌PBS作为对照。

1.2.2 疾病症状、结肠长度及脾脏质量评估

每日记录各组小鼠体质量，计算小鼠疾病活动度（DAI）；取检时称量小鼠脾脏，量取小鼠结肠长度，并按组别排好顺序进行对比拍照。

1.2.3 结肠病理切片制备及肠炎组织学评估

取下小鼠部分结肠组织，进行常规苏木精-伊红染色，置于显微镜下观察结肠炎性细胞浸润及黏膜破损情况，进行结肠组织病理学评分。该量表评分范围为0~4分，0分表示无炎症；1分表示固有层有少量炎性细胞浸润；2分指单核细胞浸润导致隐窝结构分离，并伴有轻度粘膜增生；3分表现为大量炎症细胞浸润，导致粘膜结构紊乱、杯状细胞减少，以及明显的粘膜增生；4分则代表隐窝脓肿和溃疡形成。分值越高，说明肠炎程度越严重。

1.2.4 评估DMQ对肠屏障功能的影响

Western blotting检测：提取小鼠结肠组织蛋白，进行SDS-PAGE电泳分离，转膜至PVDF膜，封闭后依次孵育一抗（Occludin，1∶500；ZO-1，1∶500；β-actin，1∶5000）和HRP标记的二抗，最后使用超敏发光液显色。通过Image J软件分析目标条带灰度值，计算目标蛋白的相对表达水平。流式细胞术检测：从肠系膜淋巴结和脾脏组织中分离细胞并计数，转移细胞至EP管中，经过细胞因子刺激剂、封闭、外标抗体标记、细胞固定和破膜、内标抗体标记后，使用PBS重悬细胞，过滤至流式管中，使用流式细胞仪检测，并通过FlowJo软件分析Th细胞和Tc细胞亚群的变化。

1.2.5 评估DMQ对NLRP3炎症小体活化的影响

Western blotting检测：Caspase-1（p20）、Pro-caspase-1和β-actin的蛋白表达量，方法同1.2.4； ELISA检测：将捕获抗体附着于固相载体上；次日封闭缓冲液处理后加入待检样本，经过检测抗体孵育；辣根过氧化物酶（HRP）结合；底物TMB反应后，终止液终止反应并于5 min内测量吸光度A_{450 nm}，绘制标准曲线并计算炎性因子IL-1β和TNF-α的分泌水平。

1.2.6 细胞提取与培养和细胞刺激

鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM）的提取与培养：将SPF级8周龄小鼠采用颈椎脱臼法处死，取小鼠完整腿骨后转移至超净台；使用DMEM培养基的注射器反复冲洗腿骨髓腔，收集细胞离心，经红细胞裂解液裂解后，加入含有M-CSF的DMEM完全培养基，转移至细胞培养箱培养、分化细胞，及时观察细胞生长状态（BMDM细胞呈细长梭形贴壁生长）。BMDM细胞刺激：利用含EDTA的DMEM培养基消化，离心后用DMEM完全培养基重悬细胞，转移至所需孔板中，37 ℃培养箱培养过夜，次日使用LPS预处理细胞，3 h后加入不同剂量DMQ、经典NLRP3炎症小体的激活剂（Nigericin），镜下观察细胞活化状态。人外周血单个核细胞（PBMC）的分离培养与刺激：取5 mL人全血至50 mL离心管中，1∶1加入生理盐水，将两者轻柔混匀。将混合液加入Ficoll溶液上方，离心后吸取中间白色层的细胞，转移至15 mL离心管，离心，加入红细胞裂解液裂解细胞。生理盐水重悬并清洗细胞，用1640完全培养基重悬，转移至所需孔板中，37 ℃培养箱培养4~6 h备用。PBMC细胞刺激：经典途径NLRP3炎症小体活化：由LPS预处理细胞，3 h后加入不同剂量DMQ、经典NLRP3炎症小体抑制剂（Nigericin）刺激细胞；替代途径NLRP3炎症小体活化：加入不同浓度DMQ处理后用LPS（100 ng/ mL）刺激细胞16 h。

1.2.7 评估DMQ体外干预对NLRP3炎症小体的影响

ELISA检测：将捕获抗体附着于固相载体上；次日加入封闭缓冲液封闭、待检样本结合、检测抗体孵育、辣根过氧化物酶（HRP）、底物TMB反应；终止液终止反应并于5 min内测量吸光度A_{450 nm}，绘制标准曲线并计算炎性因子IL-1β和TNF-α的分泌水平。

1.2.8 评估DMQ体外干预对Caspase-1依赖性经典细胞焦亡的影响

流式细胞术检测：分析PI染色阳性细胞的比例，方法同1.2.4。Western blotting检测：GSDMD-FL、GSDMD-N和β-actin的蛋白表达量，方法同1.2.4。ELISA检测：LDH的释放水平，方法同1.2.5。

1.2.9 统计学分析

使用GraphPad Prism 8.0软件进行数据分析，数据均以均数±标准差表示。两组间比较采用独立样本t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 DMQ干预可缓解DSS模型小鼠的疾病症状

与DSS模型组相比，DMQ干预组改善了小鼠的体质量减轻情况（P<0.001，图1A），同时疾病活动指数（DAI）也降低（P<0.01，图1B）。通过20 mg/kg剂量的DMQ干预，有效缓解了DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎症状（图1）。

2.2 DMQ干预可缓解DSS模型小鼠的肠道炎症反应

与DSS模型组相比，DMQ干预组小鼠的结肠长度恢复，脾脏质量明显减轻（P<0.05，图2A~C）。HE染色结果显示，经DMQ干预后，小鼠结肠组织的炎症浸润程度减轻，肠黏膜损伤得到改善（图2D）。组织学评分显示，DMQ治疗组小鼠的炎症评分降低（P<0.05，图2E）。通过20 mg/kg剂量的DMQ干预，有效缓解了DSS模型小鼠的肠道炎症及相关病理特征（图2）。

2.3 DMQ干预可缓解DSS模型小鼠的肠道免疫反应

流式细胞术分析显示，DMQ（20 mg/kg）干预后降低肠系膜淋巴结和脾脏T细胞中 Th17 细胞比例和分泌IFN-γ的CD8⁺T细胞比例（P<0.05，图3A~D）。通过20 mg/kg剂量的DMQ干预，能够有效调节DSS模型小鼠肠道相关免疫器官的细胞免疫平衡，抑制促炎性细胞亚群的过度活化，从而改善肠道免疫稳态。因此，DMQ对DSS诱导的肠道免疫异常具有缓解作用（图3）。

2.4 DMQ干预可缓解DSS模型小鼠的肠道屏障结构受损

Western blotting结果显示，与DSS模型组相比，DMQ干预组小鼠结肠组织中紧密连接蛋白Occludin和ZO-1的表达量上调（P<0.01，图4A~C）。结果显示，20 mg/kg的DMQ能够通过促进肠道上皮细胞间连接蛋白的表达，有效改善DSS诱导的小鼠肠道屏障结构损伤（图4）。

2.5 DMQ干预可抑制DSS模型小鼠的肠道中NLRP3炎症小体活化

Western blotting结果显示，DMQ（20 mg/kg）干预后，抑制了肠道炎症细胞中caspase-1活化片段p20的表达，但未影响Pro-caspase-1的蛋白水平（P<0.001，图5A）。ELISA结果显示，DMQ（20 mg/kg）干预后，降低肠道细胞中IL-1β的分泌（P<0.01，图5B），而对TNF-α的生成无影响（P>0.05，图5C）。结果显示，20 mg/kg的DMQ能够特异性抑制NLRP3炎症小体的活化，从而减轻DSS模型小鼠肠道炎症反应（图5）。

2.6 DMQ干预可抑制体外NLRP3炎症小体活化

ELISA结果显示，DMQ在鼠BMDM细胞中抑制IL-1β分泌的半最大抑制浓度为7.548 μmol/L（图6A）。在人PBMC细胞中，ELISA结果显示，在经典NLRP3炎症小体活化途径中，与尼日利亚菌素组相比，经过不同浓度的DMQ干预后，IL-1β的分泌水平随DMQ浓度的增加而降低（P<0.01，图6B），对NF-κB信号通路产生的促炎细胞因子TNF-α分泌水平影响差异无统计学意义（P>0.05，图6C）；在替代性NLRP3炎症小体活化途径中，与LPS组相比，经过不同浓度的DMQ干预后，IL-1β的分泌水平随DMQ浓度的增加而降低（P<0.001，图6D），对NF-κB信号通路产生的促炎细胞因子TNF-α分泌水平影响差异无统计学意义（P>0.05，图6E）。

2.7 DMQ干预抑制体外细胞Caspase-1依赖性经典细胞焦亡

流式细胞术分析显示，尼日利亚菌素组PI染色阳性细胞比例增高，炎症细胞发生焦亡的比例增加，经过DMQ干预后炎症细胞焦亡的比例明显降低（P<0.001，图7A）。Western blotting结果显示，与尼日利亚菌素组相比，经过DMQ干预后，GSDMD蛋白的裂解过程受到明显抑制，其N末端结构域的释放被有效阻断（P<0.01，图7B）。ELISA结果显示，与尼日利亚菌素组相比，经过不同浓度的DMQ干预后，LDH释放水平随DMQ浓度的增加而降低（P<0.01，图7C）。

3 讨论

UC是一种普遍的炎症性肠病，病程长且缺乏有效的治疗，即使新疗法和治疗方案可以缓解临床症状，患者依然不能完全康复^［21］，因此寻找安全高效的药物仍是当前探索UC治疗的主要策略。本文通过体内动物模型与体外细胞实验研究，证实DMQ通过抑制NLRP3炎症小体活化和细胞焦亡进而保护肠屏障和发挥抗肠炎的作用。

中药及其天然活性成分（提取物）作为我国传统的优势资源，因其具有多靶点、安全系数高等优点，在预防和治疗多种慢性疾病方面应用广泛。中草药天然产物具有调节免疫细胞分化、减轻炎症反应及氧化应激损伤、调节肠道菌群、恢复肠黏膜屏障功能等多种作用^［22］，在减少不良反应、预防复发等方面具有显著优势，能够有效地控制UC的发生和发展^［23］。例如，三黄熟艾汤通过抑制炎症和氧化应激缓解DSS诱导的溃疡性结肠炎^［24］，色钽菊酯通过抑制TNF-α/NF-κB和IL-6/STAT3通路缓解DSS诱导的结肠炎侵害^［25］。天然发酵小麦胚芽提取物的关键活性成分DMQ具有多重生物活性，包括抗炎、抗肿瘤及抑制脂质合成等作用。基于这些发现，本研究旨在探讨DMQ对DSS诱导的UC的潜在治疗作用。在本次研究中，我们发现DMQ处理显著改善了UC模型小鼠的体质量变化、疾病活动指数（DAI）、结肠缩短及脾脏肿大等症状。同时降低了炎症相关免疫细胞的浸润水平和炎症评分，抑制了促炎性Th1/Th17细胞亚群的活化，这些数据表明DMQ可以通过调控免疫细胞亚群平衡，重建肠道免疫微环境稳态，从而缓解UC样结肠炎。

研究表明，饮食、环境因素、炎症损伤和免疫反应参与UC样肠炎，共同诱导对肠粘膜屏障、神经内分泌和免疫系统的损害，其中免疫异常被认为是UC发病机制中最关键的因素^［26］。人们普遍认为，肠道抗原通过受损的黏膜屏障渗透，引发抗炎与促炎细胞因子之间的平衡失调^［27］。基于这一机制，本研究采用DSS诱导的UC模型，验证了DMQ能够显著上调结肠组织中紧密连接蛋白Occludin和ZO-1的表达水平。这一发现为DMQ修复肠道屏障功能提供了实验依据。以上结果表明DMQ具有缓解肠炎和保护肠屏障结构的作用，但具体调控机制需进一步研究。

NLRP3炎症小体不仅可以作为宿主防御的关键因素，还可以通过控制肠上皮细胞的完整性作为肠道稳态的有效调节剂，从而调节肠道对微生物群的免疫反应^［28］。然而NLRP3炎症小体的过度激活在UC的病理过程中扮演着关键角色^［29］。研究表明，在DSS诱导UC模型中，NLRP3基因敲除小鼠对比野生型小鼠肠炎症状较轻，包括体质量下降幅度减少、腹泻和便血症状减轻、结肠长度缩短较小，以及炎症细胞浸润、隐窝结构破坏、溃疡形成等病理改变明显减轻^［30］。NLRP3炎症小体基因敲除后，通过阻断Pro-caspase-1的活化，减少IL-1β和IL-18的成熟释放，同时抑制细胞焦亡过程，进而减轻肠道屏障损伤，最终延缓UC的病理进展。因此，靶向调控NLRP3炎症小体活化可能成为修复UC肠粘膜屏障功能障碍的新型治疗策略。本研究旨在阐明DMQ通过调控NLRP3炎症小体活化减轻DSS诱导的小鼠UC。通过Western blotting和ELISA检测表明，在DSS诱导的UC模型中，DMQ干预后降低结肠组织中p20蛋白表达及IL-1β分泌，而对Pro-caspase-1蛋白的表达和TNF-α的分泌无显著影响；体外细胞实验中，DMQ同样以剂量依赖的形式抑制NLRP3炎症小体的活化。以上结果表明，DMQ可能通过选择性抑制NLRP3炎症小体活化，而非影响其他相关炎性因子来发挥对肠粘膜屏障的保护作用。

NLRP3炎症小体活化可以触发caspase-1依赖性细胞焦亡，导致IL-1β和IL-18的成熟形式大量释放，从而加重炎症级联反应^［31］。相关研究表明，UC患者的结肠黏膜内NLRP3及IL-1β表达水平明显升高，且这些分子主要分布于中性粒细胞聚集的固有层区域^［32］。这一现象表明，NLRP3炎症小体通路的过度激活及其引发的焦亡过程可能参与UC的疾病进展。因此，本研究进一步在细胞学水平多参数检测评估DMQ的干预效果。检测结果显示，DMQ阻断GSDMD蛋白的剪切并减少LDH的释放，从而降低焦亡细胞比例。以上结果表明DMQ通过抑制NLRP3炎症小体的活化和Caspase-1依赖性细胞焦亡发挥对DSS模型小鼠UC和肠屏障结构的保护作用。根据研究表明，其他NLRP3炎症小体的抑制剂如甘草查尔酮B对Nigericin抑制浓度为40 μmol/L^［33］，没食子酸对Nigericin抑制浓度为80 μmol/L^［34］，对比于DMQ在10 μmol/L浓度就表现出显著的抑制效果。此外，单独LPS刺激可以诱导人PBMC细胞中Caspase-1和IL-1β的成熟和分泌，为NLRP3炎症小体活化的替代途径^［35］，研究结果表明，DMQ可以抑制在替代途径NLRP3炎症小体的活化中同样具有良好的在抑制效果。我们团队的前期研究结果发现^［14］，Rosthornin B能够显著抑制NLRP3炎症小体并缓解DSS诱导的小鼠UC。基于相同实验条件（C57BL/6J小鼠，8~9周龄，25±2 g；MP Biomedicals DSS；标准化造模），对比评估Rosthornin B（10 mg/kg）与DMQ（20 mg/kg）对UC的治疗效果，本研究的结果确定Rosthornin B为高效的NLRP3抑制剂，能有效缓解DSS诱导的UC症状，适合作为本研究的阳性对照药；与Rosthornin B治疗组相比，DMQ显示出相当的NLRP3通路阻断潜力，且表现出类似的缓解DSS诱导的UC的药效作用，表明其具有开发为UC治疗药物的潜力，并提供了实验依据。

本研究还存在一些不足之处：在该研究中，实验结果表明DMQ通过抑制NLRP3炎症小体活化发挥肠屏障保护作用，但在小鼠体内模型中，也不能排除有非NLRP3炎症小体依赖的因素，例如可能会通过抑制IL-6分泌^［36］、影响TLR样受体信号通路^［37］等，需要进一步研究。

综上所述，DMQ通过抑制NLRP3炎症小体的活化保护肠道屏障结构完整性，有效减轻DSS诱导的小鼠UC。

参考文献

[1] Conrad K, Roggenbuck D, Laass MW. Diagnosis and classification of ulcerative colitis[J]. Autoimmun Rev, 2014, 13(4/5): 463-6. doi：10.1016/j.autrev.2014.01.028

[2] Xue JC, Yuan S, Hou XT, et al. Natural products modulate NLRP3 in ulcerative colitis[J]. Front Pharmacol, 2023, 14: 1265825. doi：10.3389/fphar.2023.1265825

[3] Adams SM, Close ED, Shreenath AP. Ulcerative colitis: rapid evidence review[J]. Am Fam Physician, 2022, 105(4): 406-11.

[4] 林轩永. 溃疡性结肠炎治疗现状及进展[J]. 临床医药文献电子杂志, 2020, 7(12): 191-3.

[5] Le Berre C, Honap S, Peyrin-Biroulet L. Ulcerative colitis[J]. Lancet, 2023, 402(10401): 571-84. doi：10.1016/s0140-6736(23)00966-2

[6] Zhao N, Liu CG, Li N, et al. Role of interleukin-22 in ulcerative colitis[J]. Biomed Pharmacother, 2023, 159: 114273. doi：10.1016/j.biopha.2023.114273

[7] Yuan Z, Yu DK, Gou TT, et al. Research progress of NLRP3 inflammasome and its inhibitors with aging diseases[J]. Eur J Pharmacol, 2023, 957: 175931. doi：10.1016/j.ejphar.2023.175931

[8] Li JY, Wang YY, Shao T, et al. The zebrafish NLRP3 inflammasome has functional roles in ASC-dependent interleukin-1β maturation and gasdermin E-mediated pyroptosis[J]. J Biol Chem, 2020, 295(4): 1120-41. doi：10.1016/s0021-9258(17)49920-0

[9] Tastan B, Arioz BI, Genc S. Targeting NLRP3 inflammasome with Nrf2 inducers in central nervous system disorders[J]. Front Immunol, 2022, 13: 865772. doi：10.3389/fimmu.2022.865772

[10] Lv SY, Wang HG, Li XT. The role of the interplay between autophagy and NLRP3 inflammasome in metabolic disorders[J]. Front Cell Dev Biol, 2021, 9: 634118. doi：10.3389/fcell.2021.634118

[11] Guan YL, Gu YY, Li H, et al. NLRP3 inflammasome activation mechanism and its role in autoimmune liver disease[J]. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai), 2022, 54(11): 1577-86. doi：10.3724/abbs.2022137

[12] Zhang FR, Zhao W, Zhou J, et al. Heat shock transcription factor 2 reduces the secretion of IL-1β by inhibiting NLRP3 inflammasome activation in ulcerative colitis[J]. Gene, 2021, 768: 145299. doi：10.1016/j.gene.2020.145299

[13] Sun LH, Ouyang J, Zeng F, et al. An AIEgen-based oral-administration nanosystem for detection and therapy of ulcerative colitis via 3D-MSOT/NIR-II fluorescent imaging and inhibiting NLRP3 inflammasome[J]. Biomaterials, 2022, 283: 121468. doi：10.1016/j.biomaterials.2022.121468

[14] Yang YQ, Liu DD, Cao HR, et al. Rosthornin B alleviates inflammatory diseases via directly targeting NLRP3[J]. FASEB J, 2024, 38(24): e70248. doi：10.1096/fj.202401198r

[15] 曹海若, 张 玮, 李明远, 等. 川藏香茶菜丙素抑制NLRP3炎症小体活化并缓解小鼠脓毒性休克[J]. 南方医科大学学报, 2023, 43(9): 1476-84. doi：10.12122/j.issn.1673-4254.2023.09.04

[16] Liu Y, Li BG, Su YH, et al. Potential activity of traditional Chinese medicine against ulcerative colitis: a review[J]. J Ethnopharmacol, 2022, 289: 115084. doi：10.1016/j.jep.2022.115084

[17] Cao SY, Ye SJ, Wang WW, et al. Progress in active compounds effective on ulcerative colitis from Chinese medicines[J]. Chin J Nat Med, 2019, 17(2): 81-102. doi：10.1016/s1875-5364(19)30012-3

[18] Otto C, Hahlbrock T, Eich K, et al. Antiproliferative and antimetabolic effects behind the anticancer property of fermented wheat germ extract[J]. BMC Complement Altern Med, 2016, 16: 160. doi：10.1186/s12906-016-1138-5

[19] Boros LG, Nichelatti M, Shoenfeld Y. Fermented wheat germ extract (Avemar) in the treatment of cancer and autoimmune diseases[J]. Ann N Y Acad Sci, 2005, 1051: 529-42. doi：10.1196/annals.1361.097

[20] 张 玮, 邓蒙蒙, 曾 尧, 等. 2, 6-二甲氧基-1, 4-苯醌通过抑制NLRP3炎症小体活化缓解小鼠的感染性休克[J]. 南方医科大学学报, 2024, 44(6): 1024-32. doi：10.12122/j.issn.1673-4254.2024.06.02

[21] Ran ZH, Wu KC, Matsuoka K, et al. Asian Organization for Crohn's and Colitis and Asia Pacific Association of Gastroenterology practice recommendations for medical management and monitoring of inflammatory bowel disease in Asia[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2021, 36(3): 637-45. doi：10.1111/jgh.15185

[22] Wang M, Fu RJ, Xu DQ, et al. Traditional Chinese Medicine: a promising strategy to regulate the imbalance of bacterial flora, impaired intestinal barrier and immune function attributed to ulcerative colitis through intestinal microecology[J]. J Ethno-pharmacol, 2024, 318(Pt A): 116879. doi：10.1016/j.jep.2023.116879

[23] Cai JP, Liu JX, Fan P, et al. Dioscin prevents DSS-induced colitis in mice with enhancing intestinal barrier function and reducing colon inflammation[J]. Int Immunopharmacol, 2021, 99: 108015. doi：10.1016/j.intimp.2021.108015

[24] Wu ZC, Zhao ZL, Deng JP, et al. Sanhuang Shu’ai decoction alleviates DSS-induced ulcerative colitis via regulation of gut microbiota, inflammatory mediators and cytokines[J]. Biomed Pharmacother, 2020, 125: 109934. doi：10.1016/j.biopha.2020.109934

[25] Wang Z, Wu X, Wang CL, et al. Tryptanthrin protects mice against dextran sulfate sodium-induced colitis through inhibition of TNF-α/NF-κB and IL-6/STAT3 pathways[J]. Molecules, 2018, 23(5): 1062. doi：10.3390/molecules23051062

[26] Zhang W, Zou ML, Fu J, et al. Autophagy: a potential target for natural products in the treatment of ulcerative colitis[J]. Biomed Pharmacother, 2024, 176: 116891. doi：10.1016/j.biopha.2024.116891

[27] Dai NN, Yang XT, Pan PL, et al. Bacillus paralicheniformis, an acetate-producing probiotic, alleviates ulcerative colitis via protecting the intestinal barrier and regulating the NLRP3 inflammasome[J]. Microbiol Res, 2024, 287: 127856. doi：10.1016/j.micres.2024.127856

[28] Zhen Y, Zhang H. NLRP3 inflammasome and inflammatory bowel disease[J]. Front Immunol, 2019, 10: 276. doi：10.3389/fimmu.2019.00276

[29] Yuan YY, Wang F, Liu XX, et al. The role of AMPK signaling in ulcerative colitis[J]. Drug Des Devel Ther, 2023, 17: 3855-75. doi：10.2147/dddt.s442154

[30] Li JH, Xu J, Huang C, et al. Houttuynia cordata-derived exosome-like nanoparticles mitigate colitis in mice via inhibition of the NLRP3 signaling pathway and modulation of the gut microbiota[J]. Int J Nanomedicine, 2024, 19: 13991-4018. doi：10.2147/ijn.s493434

[31] Sun J, Wang S, Zhao ZT, et al. Oxymatrine attenuates ulcerative colitis through inhibiting pyroptosis mediated by the NLRP3 inflammasome[J]. Molecules, 2024, 29(12): 2897. doi：10.3390/molecules29122897

[32] Ma ZR, Li ZL, Zhang N, et al. Inhibition of GSDMD-mediated pyroptosis triggered by Trichinella spiralis intervention contributes to the alleviation of DSS-induced ulcerative colitis in mice[J]. Parasit Vectors, 2023, 16(1): 280. doi：10.1186/s13071-023-05857-3

[33] Li Q, Feng H, Wang HB, et al. Licochalcone B specifically inhibits the NLRP3 inflammasome by disrupting NEK7-NLRP3 interaction[J]. EMBO Rep, 2022, 23(2): e53499. doi：10.15252/embr.202153499

[34] Lin YQ, Luo TY, Weng AL, et al. Gallic acid alleviates gouty arthritis by inhibiting NLRP3 inflammasome activation and pyroptosis through enhancing Nrf2 signaling[J]. Front Immunol, 2020, 11: 580593. doi：10.3389/fimmu.2020.580593

[35] Gaidt MM, Ebert TS, Chauhan D, et al. Human monocytes engage an alternative inflammasome pathway[J]. Immunity, 2016, 44(4): 833-46. doi：10.1016/j.immuni.2016.01.012

[36] Liu C, Gong QM, Liu WN, et al. Berberine-loaded PLGA nanoparticles alleviate ulcerative colitis by targeting IL-6/IL-6R axis[J]. J Transl Med, 2024, 22(1): 963. doi：10.1186/s12967-024-05682-x

[37] Thapa B, Pak S, Chung D, et al. Cell-penetrating TLR inhibitor peptide alleviates ulcerative colitis by the functional modulation of macrophages[J]. Front Immunol, 2023, 14: 1165667. doi：10.3389/fimmu.2023.1165667

基金资助

国家自然科学基金(82071775)

安徽省科研编制计划优秀青年科研项目(2022AH030140)

蚌埠医学院2024年度研究生科研创新计划项目(Byycx24101)

蚌埠医学院2024年度研究生科研创新计划项目(Byycx24030)

2023年国家级大学生创新创业训练计划项目(202310367020)

蚌医一附院高水平科技创新团队资助(BYYFY2022TD001)

RIGHTS & PERMISSIONS

版权所有©《南方医科大学学报》编辑部2021