雨生红球藻抑制肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化改善博来霉素诱导的小鼠肺纤维化

Haematococcus pluvialis alleviates bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice by inhibiting transformation of lung fibroblasts into myofibroblast

摘要

目的 通过博来霉素（BLM）诱导的小鼠肺纤维化模型和TGF-β1诱导的人胚肺成纤维细胞（HFL1）模型探究雨生红球藻（HP）对肺纤维化的影响。 方法 将30只C57BL/6雄性小鼠随机分为5组：对照组（Control）、模型组（BLM）、HP低剂量组（BLM +HP 3 mg/kg）、HP高剂量组（BLM+HP 21 mg/kg）、阳性药物吡非尼酮（PFD）组（BLM + PFD 300 mg/kg），n=6。21 d后检测小鼠呼吸功能、肺组织病理学变化以及纤维化标志物的表达。在5 ng/mL TGF-β1诱导的HFL1模型，分别给予低、中、高剂量的 HP（120、180、240 μg/mL），以PFD（1.85 μg/mL）作为阳性对照药物，培养48 h后，检测纤维化标志物的表达水平。正常组、模型组、HP高剂量组进行mRNA测序和分析。 结果 HP在呼吸功能、肺组织形态结构、炎性浸润、胶原纤维沉积和纤维化蛋白质的表达方面均能减轻BLM引起的肺功能损伤和组织形态结构的纤维化，且高剂量HP表现出与PFD相似的效果。体外实验也显示，与模型组相比，高剂量HP可降低α-SMA（P<0.01）和FN（P<0.05）的蛋白质表达，以及α-SMA（P<0.05）和FN（P<0.01）mRNA表达，进一步转录组分析显示多个可能参与HP调控肺纤维化的关键基因和通路。 结论 HP粉末在体内外均表现出改善肺纤维化的作用，可能通过多种活性物质发挥协同作用，这为肺纤维化疾病的预防和治疗提供了研究基础。

Abstract

Objective To investigate the effect of Haematococcus pluvialis (HP) on bleomycin (BLM)-induced pulmonary fibrosis in mice and on TGF-β1-induced human fetal lung fibroblasts (HFL1). Methods Thirty male C57BL/6 mice were randomly divided into control group, BLM-induced pulmonary fibrosis model group, low- and high-dose HP treatment groups (3 and 21 mg/kg, respectively), and 300 mg/kg pirfenidone (positive control) group. The effects of drug treatment for 21 days were assessed by examining respiratory function, lung histopathology, and expression of fibrosis markers in the lung tissues of the mouse models. In TGF-β1-induced HFL1 cell cultures, the effects of treatment with 120, 180 and 240 μg/mL HP or 1.85 μg/mL pirfenidone for 48 h on expression levels of fibrosis markers were evaluated. Transcriptome analysis was carried out using the control cells and cells treated with TGF-β1 and 240 μg/mL HP. Results HP obviously alleviated BLM-induced lung function damage and fibrotic changes in mice, evidenced by improved respiratory function, lung tissue morphology and structure, inflammatory infiltration, and collagen deposition and reduced expressions of fibrotic proteins. HP at the high dose produced similar effect to PFD. In TGF-β1-induced HFL1 cells, treatment with 240 μg/mL HP significantly reduced the mRNA and protein expression levels of α-SMA and FN. Transcriptome analysis revealed that multiple key genes and pathways mediated the protective effect of HP against pulmonary fibrosis. Conclusion HP alleviates pulmonary fibrosis in both the mouse model and cell model, possibly as the result of the synergistic effects of its multiple active components.

Graphical abstract

关键词

雨生红球藻 / 肺纤维化 / 博来霉素 / 成纤维细胞

Key words

Haematococcus pluvialis / pulmonary fibrosis / bleomycin / fibroblast

肺纤维化是一种进展性的纤维化肺部疾病，主要表现为成纤维细胞异常增殖分化、细胞外基质过度沉积以及间充质转化，导致健康肺组织气体交换功能受损，进而引起呼吸衰竭和死亡，该进程具有不可逆性^{［1， 2］}。目前，肺纤维化的发病机制尚不完全明确，临床上用于治疗肺纤维化的两种药物吡非尼酮和尼达尼布效果并不理想，副作用明显，严重影响患者生活质量^［1，3］。因此，亟需开发新型的、更为安全有效的药物来治疗肺纤维化。

雨生红球藻（HP）是一种淡水绿藻，在氮营养缺乏、高光照和高盐等胁迫条件下能积累大量的虾青素，可达细胞干重的5%，是自然界中天然虾青素的最佳来源^［4，5］。虾青素是一种红色脂溶性的类胡萝卜素，是目前为止发现的抗氧化能力最强的物质，还具有抑制肿瘤、抗炎、提高免疫力的作用，广泛应用于食品、药品、化妆品、水产养殖等领域^［6］。有报道显示，虾青素可以调控TGF-β1/Smad、SIRT1、NF-κB、Nrf 2/ARE、ROS等通路抑制器官纤维化的发生发展^［7］。在肺纤维化中，虾青素通过促进肌成纤维细胞凋亡和抑制肺泡上皮细胞凋亡发挥抗纤维化作用^［7］。然而，在大多数体内外实验中所采用的虾青素剂量是人类普通摄入无法达到的^［8］。作为天然虾青素最佳来源的HP，除了氨基酸种类丰富外，还富含n-3长链多不饱和脂肪酸，同样具有抗氧化、抗肿瘤、降血脂、调节炎症等生理作用^［9］。尽管有研究显示，来自HP的虾青素在多种纤维化疾病中表现出抑制纤维化的作用^{［7， 10-12］}，但HP能否直接抑制肺纤维化的发生暂无报道。HP来源天然、安全、生产成本低，探究其是否具有抗肺纤维化作用意义重大。因此，本研究拟在体内外探究HP是否具有抗肺纤维化的作用以及其潜在的分子作用机制，为HP的进一步开发利用以及肺纤维化的防治提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

SPF级C57BL/6雄性小鼠30只，6~8周龄，体质量20~22 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK（湘）2021-0002，饲养于海南大学药学院实验动物中心，许可证号：SYXK（琼）2023-0031。饲养环境为SPF级，温度为22±2 ℃，标准12 h明暗循环，饲料和饮水充足。动物实验流程经海南大学实验中心动物伦理委员会批准（伦理批号：HPIACUC2025006），所有操作过程均符合实验动物伦理要求。

人胚肺成纤维细胞HFL1（中国科学院细胞库）；培养HFL1所用的Ham's F-12K完全培养基（上海美湾生物科技有限公司）；破壁雨生红球藻粉（云南爱尔发生物技术股份有限公司）；TGF-β1（PeproTech）；CCK-8（AbMole）；RNA提取试剂盒Trizol、BCA蛋白浓度测定试剂盒、Western及IP细胞裂解液、RIPA裂解液（强）和超敏ECL化学发光试剂盒（碧云天）；PrimeScript™ RT Master Mix （Perfect Real Time）、TB Green Premix Ex Taq II（Takara）；纤连蛋白FN、I型胶原蛋白ColI、III型胶原蛋白Col III、β‑actin、α‑Tubulin抗体（Proteintech）；α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体（博士德）。荧光定量PCR所用引物均由上海生工生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 动物模型建立及HP处理

将30只C57BL/6雄性小鼠适应性饲养7 d后，随机分为对照组、模型组、HP低剂量组、HP高剂量组、阳性药物吡非尼酮（PFD）组，6只/组。皮下注射硫酸阿托品（0.1 mg/kg），15 min后肌肉注射舒泰50（60 mg/kg）麻醉小鼠后，采用气管内滴注博来霉素的方法建立肺纤维化模型^［13］，对照组注入等体积的生理盐水。次日起，HP低、高剂量组分别按3、21 mg/kg灌胃给药（参考虾青素在纤维化模型中的给药剂量^［14-16］和HP中虾青素的含量设定给药剂量），阳性对照吡非尼酮组按300 mg/kg灌胃给药，对照组和模型组均灌胃给予等体积的生理盐水，1次/d，连续给药21 d。第22天，麻醉后进行呼吸功能测试，取小鼠肺组织，部分用多聚甲醛固定，剩余部分用液氮速冻后于-80 ℃保存。

1.2.2 肺呼吸功能测定

采用肺功能呼吸仪（DSI Buxco® FinePointe™ Pulmonary Function Test）对小鼠进行呼吸功能测试。PFT系统校准后，麻醉待测小鼠，将其仰卧固定，切开小鼠颈部并进行气管插管，将小鼠放置在PFT系统动物固定仓中，检测小鼠肺功能的各项指标。

1.2.3 肺组织病理学检测

小鼠肺组织（左肺）经4%多聚甲醛固定、脱水、石蜡包埋后，进行切片（厚度5 μm），再进行HE染色和Masson染色，分别观察肺组织病理情况和纤维化情况。

1.2.4 HFL1细胞培养

将人胚肺成纤维细胞HFL1置于37 ℃、5% CO₂培养箱进行培养，所用培养基为含有10%胎牛血清的Ham's F-12K完全培养基，加入青霉素-链霉素溶液（1%）减少培养基污染。当细胞融合度达80%~90%时，用0.25%胰蛋白酶消化约3 min，按1∶2传代。将HFL1细胞以1×10⁵/孔均匀接种于六孔板，先经无血清处理24 h，然后在对应组加入相应的TGF-β1、HP、PFD，具体分组如下：对照组（Control）、模型组（5 ng/mL TGF-β1）、HP低、中、高浓度组（5 ng/mL TGF-β1+120、180、240 μg/mL HP）和阳性药物对照组吡非尼酮组（5 ng/mL TGF-β1+1.85 μg/mL PFD），继续培养48 h，收集细胞用于后续RNA或蛋白质的提取。

1.2.5 CCK-8实验

将处于对数生长期的HFL1细胞以5×10³/孔的密度均匀接种于96孔板（100 μL），用1% FBS的Ham's F-12K在培养箱中过夜培养，加入10 μL不同浓度的HP（5、10、20、40、80、160、320 μg/mL），无细胞无HP的孔为空白组（Blank）、有细胞无HP的孔为对照组（Control），在37 ℃、5% CO₂培养箱继续孵育48 h后，加入10 μL CCK-8溶液（AbMole），再孵育2 h后，用酶标仪测定样品吸光度A_{450 nm}，并进行数据处理。

1.2.6 蛋白质免疫印迹法

从HFL1细胞或小鼠肺组织提取蛋白，并用BCA方法对样品进行定量。适量蛋白样品先经8%SDS-PAGE电泳分离，再转至PVDF膜上，经5%的脱脂牛奶在室温下封闭1 h，TBST缓冲液清洗3次后，将其与一抗在4 ℃过夜孵育，TBST缓冲液清洗3次后，再与二抗在室温孵育1 h，TBST洗涤后，通过ECL发光试剂盒在成像系统显影，采用Image J分析灰度值，计算目的蛋白的相对表达量。

1.2.7 免疫荧光检测

在六孔板提前放置盖玻片，接入细胞1×10⁵/孔，放置在5% CO₂培养箱中培养24 h，待细胞贴壁后，按照对照组（Control）、模型组（Model；5 ng/mL TGF-β1）、HP组（5 ng/mL TGF-β1+240 μg/mL HP）给药，继续培养48 h，经4%多聚甲醛固定15 min和0.5% triton处理15 min后，再加入10%山羊血清封闭30 min，加入Col1抗体（1∶500稀释）、Col3抗体（1∶200稀释）、FN抗体（1∶200稀释）、α-SMA抗体（1∶200稀释）4 ℃过夜孵育，再加入荧光二抗（1∶100稀释）避光室温孵育1 h，最后加入DAPI避光孵育15 min后封片，在荧光显微镜下观察。

1.2.8 荧光定量PCR

从小鼠肺组织或HFL1细胞用Trizol法提取总RNA。用PrimeScript™ RT Master Mix试剂盒将mRNA反转录为cDNA，并将其用于荧光定量PCR反应的模板，以检测目的基因的相对表达情况。荧光定量PCR所用试剂盒为TB Green Premix Ex Taq II，引物序列如表1。以GAPDH或β-actin为内参基因，通过2^-ΔΔCt相对定量法来计算目的基因的表达水平。

1.2.9 转录组测序分析

本研究委托北京诺禾致源科技股份有限公司进行细胞样品RNA提取和标准化转录组测序分析。使用Agilent 2100 bioanalyzer （Agilent Technologies）检测样品RNA完整性和总量，以确保其满足建库要求。然后，通过Oligo dT磁珠从总RNA中富集mRNA，用于文库的构建和测序。采用Illumina测序，经数据质控和对比参考基因组后，做基因表达水平定量分析、差异基因表达分析和富集分析（GO、KEGG和GSEA）等。检测样本为HFL1细胞，分别为对照组（Control）、模型组（5 ng/mL TGF-β1）、HP组（5 ng/mL TGF-β1 + 240 μg/mL HP）。

1.3 统计学分析

采用SPSS23软件进行统计处理，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用最小显著差异（LSD）t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 雨生红球藻对小鼠呼吸功能的影响

与正常组相比，模型组小鼠在100 ms用力呼气量（FEV100）、用力肺活量（FVC）、深吸气量（IC）、肺活量（VC）、肺顺应性降低（P<0.05，P<0.01），而高剂量HP组小鼠FEV100、FVC、IC、VC、肺顺应性提高（P<0.05，P<0.01）；在气道阻力（RI）方面，与正常组相比，模型组小鼠RI增加（P<0.01），高剂量HP小鼠RI降低（P<0.05，图1）。高剂量HP表现出与阳性药物吡非尼酮类似的呼吸功能影响效果；低剂量HP治疗效果无统计学意义，但其各参数指标均介于模型组和高剂量HP组之间。

2.2 雨生红球藻对小鼠肺组织形态的影响

HE染色结果显示，与正常对照组相比，模型组小鼠肺泡结构被破坏，且肺组织有大量炎性浸润；而在接受不同剂量的HP处理后，肺组织的损伤相较于模型组有不同程度的减轻，高剂量HP组则表现出与正常组相似的肺组织结构；阳性药物PFD组小鼠也表现出与正常组相似的肺组织结构（图2）。

Masson染色显示，正常对照组小鼠的肺组织未表现出纤维化，而模型组小鼠的肺组织显示有大量胶原沉积、纤维细胞增加，肺泡结构被破坏；不同剂量的HP处理后，与模型组小鼠肺组织相比，肺组织胶原纤维沉积的情况有不同程度的缓解，肺泡结构紊乱程度降低，特别是高剂量HP组小鼠表现出很少的胶原沉积，肺泡结构也较为完整，与正常对照组相似；阳性药物PFD组小鼠也无明显的胶原纤维沉积，与正常对照组相似（图2）。

2.3 雨生红球藻对小鼠肺组织纤维化蛋白表达的影响

Western blotting和qRT-PCR结果显示，与正常组相比，模型组小鼠肺组织中Col1、Col3、α-SMA和FN的蛋白质（P<0.01，图3A）以及mRNA（P<0.01，P<0.05，图3B）表达水平均升高；与模型组相比，HP高剂量组肺组织的Col1、Col3、α-SMA和FN的蛋白质（P<0.01，图3A）以及mRNA（P<0.01，P<0.05，图3B）水平均降低，与阳性药物对照PFD组的表现相近；但HP低剂量组中肺组织纤维化相关蛋白与模型组的差异无统计学意义，总体趋势有一定降低。

2.4 雨生红球藻对HFL1细胞纤维化蛋白表达的影响

CCK-8结果显示，培养48 h后，与对照组相比，5~160 μg/mL的HP对HFL1增殖无毒性，且细胞活力略有增加；当HP处于320 μg/mL时，HLF1细胞活力为92.8%。与正常对照组相比，模型组中Col1、Col3、α-SMA和FN的蛋白表达均升高（P<0.01）；与模型组相比，HP高剂量处理组（240 μg/mL）和中剂量处理组（180 μg/mL）中α-SMA和FN的蛋白表达水平降低（P<0.05，P<0.01），HP低剂量处理组（120 μg/mL）中FN（P<0.05）蛋白表达水平也降低；所有HP处理组均不能减少HFL1细胞中Col1和Col3在TGF-β1诱导下产生的过量沉积；与模型组相比，PFD组中Col1、Col3、α-SMA和FN的蛋白表达水平均降低（P<0.05，P<0.01，图4）。

免疫荧光结果显示（图5A），与正常对照组相比，模型组中4种纤维化标志物Col1、Col3、α-SMA和FN的免疫荧光强度增加（P<0.05），而高剂量HP处理后免疫荧光强度降低（P<0.05）。qRT-PCR结果显示（图5B），与正常组相比，模型组Col1、Col3、Col5、α-SMA和FN的表达水平均上调（P<0.01）；高剂量的HP（240 μg/mL）处理后，α-SMA、FN和Col5的mRNA表达水平降低（P<0.05），而Col1和Col3的mRNA表达水平在HP组与模型组的差异无统计学意义。

2.5 雨生红球藻对HFL1细胞调控纤维化分子通路的影响

PCA结果显示，同组的3个生物学重复样品均聚在一起，不同组的样品之间保持一定的距离，组间样品差异大（图6A）。进一步差异基因分析，以P<0.05和|log2FC|>1为筛选条件，当模型组与正常组相比时，共筛选出1218个mRNA水平有显著性变化的基因，其中上调和下调的分别为524个和694个（图6B）；当HP组和模型组相比时，共筛选出588个差异表达基因，其中上调和下调的基因个数分别为231个和357个（图6B）。韦恩分析显示，这两个差异基因集的共有基因后（图6C），再筛选出呈现在正常组和HP组mRNA水平类似而在模型组表达水平有差异的基因集合，富集分析也在此基因集合基础上进行；其中，与正常组相比，在模型组上调而在HP组又下调至正常组水平的基因有40个，在模型组下调而在HP组又上调至正常组水平的基因有11个。本研究筛选出与纤维化相关的一些基因（表2），包括促纤维化发生的或者在模型组表达上调的有：ANKRD1、HAPLN1、POSTN、ADAMTS4、PLK1、HHIP、KCNN4、CDK1和CMKLR1；和抑制纤维化发生的或者在模型组表达下调的有：GPRC5A、CCL2、SLIT2和VSIR；这些基因在正常组、模型组和给药组的表达情况（图6D）。GO、KEGG、GSEA富集分析显示，主要涉及相关的生物学过程有钾离子运输、Wnt信号通路、蛋白质磷酸化等，在细胞组分方面主要涉及细胞外基质；分子功能方面主要有钾离子通道活性、蛋白激酶活性等；差异基因KEGG富集的关键通路有：IL-17信号通路、p53信号通路、TNF信号通路、TGF-β信号通路和Wnt信号通路以及趋化因子信号通路等；CCL2参与IL-17信号通路、TNF信号通路；GSEA富集的相关通路有：TGF-β信号通路、ECM受体相互作用和Notch信号通路等（图6E）。

3 讨论

本研究显示，HP（21 mg/kg）日常服用可以改善由BLM诱导的小鼠肺纤维化，缓解BLM造成的肺呼吸功能损伤，减少BLM造成的肺组织中炎症细胞浸润，以及胶原纤维等细胞外基质的沉积，抑制α-SMA、FN、Col1、Col3的mRNA和蛋白表达水平，发挥抗肺纤维化作用，且与临床治疗肺纤维化药物吡非尼酮（300 mg/kg）表现出类似的药效。本研究进一步在体外TGF-β诱导的细胞模型（人胚肺成纤维细胞HFL1）检验HP是否具有缓解肺纤维化效果；首先通过CCK-8实验和预实验来选择HP在HFL1实验上的剂量，发现5、20、80 μg/mL的HP均未表现出降低纤维化蛋白表达的作用，将HP剂量增加至180或240 μg/mL时，能抑制纤维化标志物的mRNA或蛋白质表达水平。因此，HP在体内外均表现出显著的抗肺纤维化活性。

与临床上用于治疗肺纤维化药物相比，可食用的藻类之一HP来源于大自然，生产工艺简单、成本低、产量大，且不会引起严重的副作用，是天然来源的治疗肺纤维化选择之一。本研究体内外实验结果显示，低剂量的HP未能表现出明显的治疗肺纤维化作用，而增加至高剂量后表现出与临床药物PFD类似的治疗作用，推测可能是HP中发挥抗肺纤维化的主要有效成分是虾青素，约占总质量的3%^［35］，本研究动物实验中高剂量为21 mg/kg，其中所含虾青素的用量约为0.63 mg/kg，该用量远低于以往文献报道的虾青素在抗肺纤维化中的用量^［8］。主要原因可能为：天然虾青素和合成虾青素手性不一样^［9］，所以表现的药效活性也不一样；目前，市场上纯度为98%以上的虾青素为化学合成虾青素，人不能直接食用，多用于饲料添加，而从HP或其他原料物质提纯的虾青素不超过10%，现有技术难以达到更高纯度天然虾青素的要求，且生产成本非常高。其次，HP中除了含有虾青素外，还含有丰富的n-3长链多不饱和脂肪酸和各种氨基酸等^［9］，这些物质可能与虾青素一起发挥协同作用，因此表现出更好的抗肺纤维化药效。总的来说，HP可以开发对应功效的保健食品或药物，具有来源广、成本低、无副作用等优点。

基于HFL1细胞实验转录组分析，本研究也提出了可能与HP发挥抗肺纤维化作用相关的关键基因或分子通路。ANKRD1在TGF-β1诱导的肺成纤维细胞模型中上调^［36］，而且其在癌症相关的纤维化激活中作为一个间充质特异性的转录辅助调节因子^［34］；趋化因子CCL2在HFL1细胞中介导抗肺纤维化作用^［21］；GPRC5A的减少会导致胶原沉积和肌成纤维细胞激活增加进而引起肺纤维化加重^［18］；CDK1在心肌纤维化中通过TGF-β途径正向调控成纤维细胞向肌成纤维细胞转化^［32］；KCNN4在肾纤维化和肝纤维化中均上调^{［29， 30］}。参与调控肺纤维化的分子机制非常复杂，而本研究转录组分析的KEGG富集通路显示TNF信号通路、TGF-β信号通路和Wnt信号通路等可能参与HP在成纤维细胞中调控纤维化。GSEA分析显示，HP可能通过TGF-β信号通路、ECM受体相互作用和Notch信号通路等抑制HFL1细胞发生纤维化。肺纤维化发病机制复杂，目前报道的主要信号通路有：MAPK信号通路、PI3K/Akt信号通路、TGF-β/Smad信号通路、Notch信号通路、P53信号通路、Wnt信号通路、C-Jun信号通路等，与上述富集分析结果一致^［37-39］。但HP调控肺纤维化具体的分子机制，需要进一步的实验验证与探究。

综上所述，口服HP粉末可以改善BLM诱导的肺纤维化，减少胶原蛋白及细胞外基质的沉积，从而缓解肺纤维化。HP本身作为高营养价值和药用价值的可食用藻类之一，本研究进一步探讨了HP的潜在药用价值，其能积累大量的虾青素、n-3长链多不饱和脂肪酸和丰富的氨基酸，可能是HP治疗肺纤维化的具体活性物质，能显著抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，与阳性药物PFD的治疗效果类似，为天然药食同源食物治疗肺纤维化和临床用药提供了理论基础。但具体延缓肺纤维化的分子作用机制，以及是否有调控其他类细胞（如上皮细胞、巨噬细胞）的作用需进一步的探索。

参考文献

[1] Hewlett JC, Kropski JA, Blackwell TS. Idiopathic pulmonary fibrosis: Epithelial-mesenchymal interactions and emerging therapeutic targets[J]. Matrix Biol, 2018, 71: 112-27. doi：10.1016/j.matbio.2018.03.021

[2] Richeldi L, Collard HR, Jones MG. Idiopathic pulmonary fibrosis[J]. Lancet, 2017, 389(10082): 1941-52. doi：10.1016/s0140-6736(17)30866-8

[3] Cruwys S, Hein P, Humphries B, et al. Drug discovery and development in idiopathic pulmonary fibrosis: challenges and opportunities[J]. Drug Discov Today, 2020, 25(12): 2277-83. doi：10.1016/j.drudis.2020.09.019

[4] 丛晓梅, 臧晓南, 王振东, 等. 雨生红球藻虾青素合成关键酶的原核表达及纯化[J]. 海洋湖沼通报, 2022, 44(6): 49-56. doi：10.13984/j.cnki.cn37-1141.2022.06.007

[5] Lorenz RT, Cysewski GR. Commercial potential for Haematococcus microalgae as a natural source of astaxanthin[J]. Trends Biotechnol, 2000, 18(4): 160-7. doi：10.1016/s0167-7799(00)01433-5

[6] 李文学, 白慧颖, 赵宏晶, 等. 雨生红球藻虾青素积累条件优化研究[J]. 食品研究与开发, 2021, 42(16): 152-6. doi：10.12161/j.issn.1005-6521.2021.16.022

[7] Li K, Wang W, Xiao W. Astaxanthin: a promising therapeutic agent for organ fibrosis[J]. Pharmacol Res, 2023, 188: 106657. doi：10.1016/j.phrs.2023.106657

[8] Cheng J, Eroglu A. The promising effects of astaxanthin on lung diseases[J]. Adv Nutr, 2021, 12(3): 850-64. doi：10.1093/advances/nmaa143

[9] 王裕玉, 宋庆辉, 贾 晶, 等. 雨生红球藻的营养价值及其在鱼类饲料中的应用[J]. 饲料研究, 2023, 46(17): 167-72. doi：10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.033

[10] Zhao J, Meng M, Zhang J, et al. Astaxanthin ameliorates renal interstitial fibrosis and peritubular capillary rarefaction in unilateral ureteral obstruction[J]. Mol Med Rep, 2019, 19(4): 3168-78. doi：10.3892/mmr.2019.9970

[11] Ma HT, Chen SH, Xiong HY, et al. Astaxanthin from Haematococcus pluvialis ameliorates the chemotherapeutic drug (doxorubicin) induced liver injury through the Keap1/Nrf2/HO-1 pathway in mice[J]. Food Funct, 2020, 11(5): 4659-71. doi：10.1039/c9fo02429h

[12] Sarker M, Chowdhury N, Bristy AT, et al. Astaxanthin protects fludrocortisone acetate-induced cardiac injury by attenuating oxidative stress, fibrosis, and inflammation through TGF-β/Smad signaling pathway[J]. Biomed Pharmacother, 2024, 181: 117703. doi：10.1016/j.biopha.2024.117703

[13] 权博文, 吴 桐, 刘 庆, 等. 蒙古扁桃种仁不同极性部位对博来霉素致大鼠肺纤维化的保护作用[J]. 食品工业科技, 2020, 41(22): 305-9. doi：10.13386/j.issn1002-0306.2020050143

[14] Zhang J, Xu P, Wang Y, et al. Astaxanthin prevents pulmonary fibrosis by promoting myofibroblast apoptosis dependent on Drp1-mediated mitochondrial fission[J]. J Cell Mol Med, 2015, 19(9): 2215-31. doi：10.1111/jcmm.12609

[15] Wang MR, Zhang JJ, Song XD, et al. Astaxanthin ameliorates lung fibrosis in vivo and in vitro by preventing transdifferentiation, inhibiting proliferation, and promoting apoptosis of activated cells[J]. Food Chem Toxicol, 2013, 56: 450-8. doi：10.1016/j.fct.2013.03.004

[16] Song X, Wang B, Lin S, et al. Astaxanthin inhibits apoptosis in alveolar epithelial cells type II in vivo and in vitro through the ROS-dependent mitochondrial signalling pathway[J]. J Cell Mol Med, 2014, 18(11): 2198-212. doi：10.1111/jcmm.12347

[17] Mazzeo L, Ghosh S, Di Cicco E, et al. ANKRD1 is a mesenchymal-specific driver of cancer-associated fibroblast activation bridging androgen receptor loss to AP-1 activation[J]. Nat Commun, 2024, 15(1): 1038. doi：10.1038/s41467-024-45308-w

[18] Huang ZL, Wang SQ, Liu YT, et al. GPRC5A reduction contributes to pollutant benzo [a] Pyrene injury via aggravating murine fibrosis, leading to poor prognosis of IIP patients[J]. Sci Total Environ, 2020, 739: 139923. doi：10.1016/j.scitotenv.2020.139923

[19] Evanko SP, Gooden MD, Kang I, et al. A role for HAPLN1 during phenotypic modulation of human lung fibroblasts in vitro [J]. J Histochem Cytochem, 2020, 68(11): 797-811. doi：10.1369/0022155420966663

[20] Wu S, Liu M, Zhang M, et al. The gene expression of CALD1 CDH2 and POSTN in fibroblast are related to idiopathic pulmonary fibrosis[J]. Front Immunol, 2024, 15: 1275064. doi：10.3389/fimmu.2024.1275064

[21] Kalderén C, Stadler C, Forsgren M, et al. CCL2 mediates anti-fibrotic effects in human fibroblasts independently of CCR2[J]. Int Immunopharmacol, 2014, 20(1): 66-73. doi：10.1016/j.intimp.2014.02.020

[22] He CY, Gu L, Li AM, et al. Recombinant Slit2 attenuates tracheal fibroblast activation in benign central airway obstruction by inhibiting the TGF-β1/Smad3 signaling pathway[J]. Mol Cell Probes, 2024, 73: 101947. doi：10.1016/j.mcp.2023.101947

[23] Kim MG, Yun D, Kang CL, et al. Kidney VISTA prevents IFN-γ/IL-9 axis-mediated tubulointerstitial fibrosis after acute glomerular injury[J]. J Clin Investig, 2022, 132(1): e151189. doi：10.1172/JCI151189

[24] Boyd DF, Allen EK, Randolph AG, et al. Exuberant fibroblast activity compromises lung function via ADAMTS4[J]. Nature, 2020, 587(7834): 466-71. doi：10.1038/s41586-020-2877-5

[25] Maria V, Murugan E P, Athiramol S, et al. Inhibition of the extracellular enzyme ADAMTS4 prevents cardiac fibrosis and dysfunction[J]. Cardiovascular Res, 2023, 119(10): 1915-27.

[26] Chen Y, Chen X, Ji YR, et al. PLK1 regulates hepatic stellate cell activation and liver fibrosis through Wnt/β-catenin signalling pathway[J]. J Cell Mol Med, 2020, 24(13): 7405-16. doi：10.1111/jcmm.15356

[27] Du Y, Shang Y, Qian Y, et al. Plk1 promotes renal tubulointerstitial fibrosis by targeting autophagy/lysosome axis[J]. Cell Death Dis, 2023, 14(8): 571. doi：10.1038/s41419-023-06093-4

[28] Zhao XP, Chang SY, Liao MC, et al. Hedgehog interacting protein promotes fibrosis and apoptosis in glomerular endothelial cells in murine diabetes[J]. Sci Rep, 2018, 8(1): 5958. doi：10.1038/s41598-018-24220-6

[29] Mann C, Kaistha BP, Kacik M, et al. Downregulation of miR-503 in activated kidney fibroblasts disinhibits KCNN4 in an in vitro model of kidney fibrosis[J]. Kidney Blood Press Res, 2019, 44(1): 113-22. doi：10.1159/000498875

[30] Yang L, Han B, Zhang M, et al. Activation of BK channels prevents hepatic stellate cell activation and liver fibrosis through the suppression of TGFβ1/SMAD3 and JAK/STAT3 profibrotic signaling pathways[J]. Front Pharmacol, 2020, 11: 165. doi：10.3389/fphar.2020.00165

[31] Sai C, Yunhan J, Zhao J, et al. Cyclin dependent kinase 1 (CDK1) activates cardiac fibroblasts via directly phosphorylating paxillin at Ser244[J]. Int Heart J, 2019, 60(2): 374-83. doi：10.1536/ihj.18-073

[32] Yamamoto T, Matsushima S, Okabe K, et al. Cyclin dependent kinase 1 (CDK1) positively regulates cardiac hypertrophy and fibrosis via TGF-beta pathway[J]. Eur Heart J, 2020, 41(): ehaa946.3743. doi：10.1093/ehjci/ehaa946.3743

[33] Cai R, Cao R, Liu Y, et al. Chemerin promotes proliferation of cardiac fibroblasts via CMKLR1/PI3k/Akt/NF‑κB signaling pathway[DB/OL]. 2024-04-01. doi：10.21203/rs.3.rs-4142000/v1

[34] Mannes PZ, Adams TS, Farsijani S, et al. Noninvasive assessment of the lung inflammation-fibrosis axis by targeted imaging of CMKLR1[J]. Sci Adv, 2024, 10(25): 9817. doi：10.1126/sciadv.adm9817

[35] 唐海南, 柏 月, 许金震, 等. 雨生红球藻粉对斑节对虾肝胰腺免疫性能及甲醛胁迫下相关基因表达的影响[J]. 厦门大学学报(自然科学版), 2024, 64(8): 1-11.

[36] Zhang T, He X, Caldwell L, et al. NUAK1 promotes organ fibrosis via YAP and TGF-β/SMAD signaling[J]. Sci Transl Med, 2022, 14(637): eaaz4028. doi：10.1126/scitranslmed.aaz4028

[37] Yan Z, Kui Z, Ping Z. Reviews and prospectives of signaling pathway analysis in idiopathic pulmonary fibrosis[J]. Autoimmun Rev, 2014, 13(10): 1020-5. doi：10.1016/j.autrev.2014.08.028

[38] Suri GS, Kaur G, Jha CK, et al. Understanding idiopathic pulmonary fibrosis-Clinical features, molecular mechanism and therapies[J]. Exp Gerontol, 2021, 153: 111473. doi：10.1016/j.exger.2021.111473

[39] 李斯宇, 庞立健, 吕晓东, 等. 特发性肺纤维化复杂网络发病机制与络病理论[J]. 中华中医药杂志, 2022, 37(2): 640-5.

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