Avitinib抑制NLRP3炎症小体活化并改善小鼠感染性休克

Avitinib suppresses NLRP3 inflammasome activation and ameliorates septic shock in mice

摘要

目的 探究Avitinib抑制NLRP3炎症小体活化并缓解感染性休克的作用及其机制。 方法 预先给药Avitinib作用小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM）、人单核细胞白血病细胞系（THP-1）、健康志愿者外周血分离提取的单个核细胞（PBMC），后加入多种NLRP3炎症小体激动剂如尼日利亚菌素（Nigericin），单钠尿酸盐（MSU）结晶，三磷酸腺苷（ATP）活化经典NLRP3炎症小体，或在细胞内转染脂多糖（LPS）活化非经典形式NLRP3炎症小体（Western blotting）检测NLRP3炎症小体活化的分泌蛋白指征及细胞焦亡情况。利用酶联免疫吸附技术（ELISA）测定细胞上清中相关炎症因子的水平。构建小鼠感染性休克模型，采取随机分组的方法，将8周龄雄性C57BL/6J小鼠分为空白对照组（Control组），感染性休克模型组（LPS组），给药组（LPS+Avitinib组），6只/组。ELISA测定各组眼球血和腹腔灌洗液中的相关炎症因子水平，并记录小鼠的存活情况，采用Kaplan-Meier法进行生存分析。 结果 Avitinib在多种细胞类型中抑制NLRP3炎症小体活化，剂量依赖性地抑制IL-1β分泌和caspase-1剪切，同时抑制GSDMD介导的细胞焦亡（P<0.05），但对炎症早期预警因子白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的分泌并无影响（P>0.05）。动物实验结果表明，在LPS诱导的感染性休克模型中，给予Avitinib干预后小鼠血清和腹腔液中IL-1β的水平降低（P<0.05），并延长小鼠生存时间（P<0.05）。 结论 Avitinib可抑制NLRP3炎症小体活化并改善感染性休克。

Abstract

Objective To investigate the effect of avitinib for suppressing NLRP3 inflammasome activation and alleviating septic shock and explore the underlying mechanism. Methods Mouse bone marrow-derived macrophages (BMDM), human monocytic leukemia cell line THP-1, and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) isolated from healthy volunteers were pre-treated with avitinib, followed by activation of the canonical NLRP3 inflammasome using agonists including nigericin, monosodium urate (MSU) crystals, or adenosine triphosphate (ATP). Non-canonical NLRP3 inflammasome activation was induced via intracellular transfection of lipopolysaccharide (LPS). Western blotting was used to detect the secretory protein markers of NLRP3 inflammasome activation and assess pyroptosis, and the levels of inflammatory cytokines in cell culture supernatant were determined with ELISA. In a mouse model of LPS-induced septic shock, the effect of avitinib treatment on the levels of inflammatory cytokines in serum and peritoneal lavage fluid were examined with ELISA, and survival curves of the mice were plotted using the Kaplan-Meier method. Results Avitinib significantly inhibited NLRP3 inflammasome activation in multiple cell types, and dose-dependently reduced IL-1β secretion and caspase-1 cleavage while suppressing GSDMD-mediated pyroptosis without obviously affecting IL-6 or TNF-α levels. In the mouse models of LPS-induced septic shock, avitinib significantly lowered IL-1β levels in serum and peritoneal fluid and extended survival time of the mice. Conclusion Avitinib suppresses NLRP3 inflammasome activation and alleviates septic shock in mice.

Graphical abstract

关键词

Avitinib / NLRP3炎症小体 / EGFR抑制剂 / 感染性休克

Key words

avitinib / NLRP3 inflammasome / EGFR inhibitor / septic shock

NLRP3炎症小体是一种检测外源性致病性侵袭和内源性细胞损伤的重要传感器，由3个主要成分组成，分别是NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）、凋亡相关斑点样蛋白 ASC（PYCARD）、以及效应器caspase-1构成^［1］。NLRP3炎症小体可识别整合多样化的危险信号，成为连接免疫异常与慢性疾病的重要“分子枢纽”^{［2， 3］}。当检测到宿主来源或病原体来源的危险信号时，炎症小体就会在细胞质开始组装。这种组装导致caspase-1的激活，促进炎症细胞因子IL-1β和IL-18的成熟和释放，促进GSDMD剪切，诱导细胞焦亡^［4］。NLRP3炎症小体的异常激活与多种疾病的病理进程密切相关。如2型糖尿病^［5］、阿尔茨海默症^［6］、肺癌^［7］等。目前，针对NLRP3炎症小体的治疗策略主要包括抑制其激活、阻断相关细胞因子的作用等。较为熟知的抑制剂有MCC950^［8］、CY-09^［9］、Anakinra^［10］、姜黄素^［11］等。但现有NLRP3抑制剂的核心矛盾在于：抑制病理炎症的同时，不可避免地削弱宿主防御和组织修复能力，目前尚无临床药物直接靶向NLRP3炎症小体，因此寻找有效的靶向NLRP3炎症小体候选药物成为重中之重。

肺癌是全球发病率和死亡率最高的癌症之一，其中非小细胞肺癌（NSCLC）占所有肺癌病例的85%左右^［12］。只有15.9%的患者在诊断后存活5年或更长时间^［13］。非小细胞肺癌（NSCLC）的发生发展与NLRP3炎症小体的异常激活密切相关，抑制NLRP3炎性小体激活已被证明具有减少NSCLC细胞增殖和转移的潜力^{［14， 15］}，这提示靶向NLRP3可能成为NSCLC治疗的新策略。

Avitinib是中国自主研发的第3代EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI），主要针对非小细胞肺癌（NSCLC）中EGFR敏感突变（如L858R、外显子19缺失）及耐药突变（T790M）^［16］。目前，Avitinib的临床研发聚焦于EGFR T790M阳性晚期NSCLC的二线治疗，已完成多项I/II期临床试验，数据显示其对T790M突变的客观缓解率（ORR）达50%~60%，具有高效的抗肿瘤活性^［17］，但其在NLRP3炎症小体中的作用未见报道，基于NLRP3在NSCLC中的潜在作用及Avitinib对NSCLC良好的治疗效果，我们猜测Avitinib在治疗NSCLC的疾病进程中可能通过抑制NLRP3炎症小体的活化起到一定的抗肿瘤效果。本研究拟通过在细胞分子水平和动物模型水平探究Avitinib对NLRP3炎症小体活化的作用，以期为NLRP3炎症小体相关疾病的治疗提供新的候选药物。此外，本研究还提示Avitinib在NSCLC治疗中可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物与细胞

实验动物：实验选用6~10周龄、无特定病原体（SPF级）的雄性C57BL/6J 小鼠，均购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，饲养于22±2 ℃屏障环境，12 h光照/黑暗循环条件下，自由摄食灭菌饲料及饮水。THP-1细胞系，购自武汉普诺赛生命科技有限公司。人PBMC细胞在征得健康志愿者知情同意且充分了解研究内容及潜在风险情况下采集分离获得。实验实施全程符合人体医学研究伦理规范要求。伦理批号：伦科批字［2023］400号。所有动物实验严格按照实验动物管理规范进行，充分保证动物福利，本研究经蚌埠医科大学伦理委员会审核并批准（伦理批号：伦动科批字［2023］第435号）。

1.2 主要试剂

Avitinib、尼日利亚菌素（Nigericin）（杭州陶术生物）；巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）（Novoprotein）；红细胞裂解液（Beyotime）；脂多糖（LPS）、Pam3CSK4（Invitrogen）；尿酸单钠晶体（MSU）、三磷酸腺苷（ATP）（Sigma）；Lipofectamine2000（Invitrogen）；RPMI 1640培养基、高糖DMEM培养基、OPTI-MEM培养基、胎牛血清（Gibco）；人外周血淋巴细胞分离液（灏洋生物）；Mouse IL-1β ELISA KIT、Mouse IL-6 ELISA KIT、Mouse TNF-α ELISA KIT、Human IL-1β ELISA KIT、Human TNF-α ELISA KIT、anti-Mouse IL-1β（R&D）；anti-Mouse caspase-1（AdipoGen）；anti-Human caspase-1（Cell Signaling Technology）；β-actin（Abmart）；GSDMD（Abcam）。

1.3 细胞准备

BMDM细胞获取：颈椎脱臼法处死小鼠，小心剥离腿骨，以无菌PBS涮洗。用注射器吸取培养基反复冲洗腿骨髓腔收集细胞，离心弃上清，加适量红细胞裂解液裂解红细胞。将所得细胞置于含M-CSF的完全培养基中诱导分化。镜下贴壁细胞较密且多呈细长梭形，即可用于后续实验。复苏THP-1细胞，待细胞状态良好，密度适宜，镜下呈悬浮圆润透亮，收集细胞，用含有佛波酯（PMA）的完全1640培养基重悬铺板。抽取健康志愿者新鲜外周血按人外周血淋巴细胞分离液试剂说明书分离出PBMC，种板培养。

1.4 炎症小体刺激活化

BMDM细胞：待BMDM细胞诱导培养分化完成后，将细胞按预先设计孔位种板过夜培养，待细胞贴壁且状态良好，弃去孔中旧培养基，更换为含有LPS（100 ng/mL）和1%血清的预刺激液，预刺激3 h，加入经典NLRP3炎症小体激活剂，激活经典NLRP3炎症小体。使用含Pam3CSK4（200 ng/mL）预刺激细胞3 h后，通过胞内转染的方式激活非经典NLRP3炎症小体。THP-1细胞和PBMC：预先1 d铺板，次日更换旧培养基用含LPS（500 ng/mL）的培养基预刺激3 h，加入Nigericin（3 μmol/L）刺激细胞30 min。

1.5 Western blotting实验

待炎症小体活化后取细胞上清，离心弃去细胞碎片后利用甲醇氯仿法提取蛋白，对于细胞内的蛋白如炎症小体前体蛋白与内参蛋白则直接加入裂解液裂解细胞后获得，蛋白样本准备完毕后金属浴100 ℃加热10 min。按PAGE凝胶快速制备试剂盒说明书制备合适浓度的胶，上样后80 V电泳30 min，而后转为120 V电泳1 h，电泳结束，90 V恒压转膜90 min，使用快速封闭液封闭15 min，加入相应一抗（1∶500），4 ℃摇床慢摇过夜。加入PBST快摇洗膜3次，15 min/次，弃去PBST，加入二抗（1∶5000）抗体室温摇床孵育90 min，时间到弃去二抗再次加入PBST洗膜3次使用凝胶成像仪显影。

1.6 酶联免疫吸附测定（ELISA）

预包被抗体过夜，次日弃去板中液体，用PBST缓冲液洗涤3次；随后以含10%血清的PBS封闭酶标板1 h，弃液后重复洗涤3次；按说明书梯度稀释标准品，与待测样本同步加入板孔，室温孵育2 h后弃液并洗涤；加入检测抗体反应1 h，弃液洗涤后避光加入HRP孵育20 min，彻底洗涤5次；加入TMB等待显色，终止反应后测定吸光度A_{450 nm}，结合标准曲线计算样本目标因子浓度。

1.7 模型构建及给药

1.7.1 感染性休克模型构建

将SPF级雄性C57BL/6小鼠随机分成3组，6只/组，分组如下：空白组（Control组）、感染性休克模型组（LPS组）和Avitinib给药组（LPS+Avitinib组）。提前1晚分笼，避免小鼠应激干扰实验结果。第2天早上预先给予Avitinib给药组小鼠腹腔注射Avitinib（10 mg/kg），空白组小鼠注射等体积的PBS。50 min后除空白组小鼠，其余小鼠同时注射LPS溶液（20 mg/kg）。4 h后，眼球取血，颈椎脱臼牺牲小鼠收集腹腔灌洗液，用ELISA测定相关炎性因子的分泌水平。

1.7.2 绘制生存曲线

预先给药Avitinib（10 mg/kg），50 min后注射LPS溶液（20 mg/kg），随后密切观察并记录小鼠死亡情况，使用GraphPad Prism 8.0.2软件绘制生存曲线。

1.8 统计学分析

统计分析与生存曲线绘制均采用 GraphPad Prism 8.0软件完成。数据以均数±标准差表示，两组间差异比较采用独立样本t检验方法。生存分析通过Log-rank检验进行生存曲线差异评估，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Avitinib抑制鼠BMDM细胞Nigericin诱导的经典NLRP3炎症小体活化与焦亡

Western blotting检测显示，Avitinib剂量依赖性降低小鼠BMDM细胞中IL-1β（P<0.001）和p20蛋白表达（P<0.001），而Pro-IL-1β和Pro-caspase-1蛋白水平无变化（P>0.05，图1A）。通过ELISA分析，IL-1β分泌量随药物浓度增加呈剂量依赖性减少（P<0.001，图1B），但IL-6（P>0.05）和TNF-α（P>0.05）的分泌未受影响（图1C、D）。Western blotting结果显示，在Nigericin作用下Avitinib预处理与不加药组相比抑制Nigericin诱导的GSDMD剪切，减少其N端片段生成，（P<0.001，图1E）。

2.2 Avitinib抑制THP-1细胞、人PBMC细胞Nigericin诱导的经典NLRP3炎症小体活化

Western blotting 结果表明，在THP-1细胞中，Avitinib剂量依赖性抑制p20蛋白表达（P<0.001），而Pro-caspase-1水平变化无统计学意义（P>0.05，图2A）。ELISA检测结果显示，IL-1β分泌量随药物浓度升高呈剂量依赖性减少（P<0.001，图2B）。此外，在人PBMC细胞中，ELISA结果显示Avitinib同样剂量依赖性地抑制IL-1β分泌（P<0.001，图2C）。

2.3 Avitinib抑制鼠BMDM细胞ATP、MSU诱导的经典NLRP3炎症小体活化

Western blotting分析显示，在ATP诱导的经典NLRP3炎症小体活化中，Avitinib剂量依赖性抑制IL-1β（P<0.001）及p20（P<0.001）蛋白表达，而Pro-IL-1β和Pro-caspase-1表达差异无统计学意义（P>0.05，图3A）。在MSU诱导的炎症小体活化中，IL-1β（P<0.001）和p20（P<0.001）表达同样随Avitinib浓度升高呈剂量依赖性下降（图3B）。ELISA检测进一步证实，ATP（P<0.001）和MSU（P<0.001）激活的炎症小体中，IL-1β分泌量均被Avitinib剂量依赖性抑制（图3C、D）。

2.4 Avitinib抑制鼠BMDM细胞非经典NLRP3炎症小体活化

Western blotting分析表明，Avitinib以剂量依赖性方式抑制胞内转染LPS引起的非经典途径活化产生的IL-1β（P<0.001）和p20（P<0.001）蛋白表达，而Pro-IL-1β及Pro-caspase-1表达水平未发生改变（P>0.05）（图4A）。ELISA检测进一步显示，IL-1β分泌量随药物浓度升高呈剂量依赖性减少（P<0.001，图4B）。

2.5 Avitinib缓解小鼠感染性休克

ELISA检测显示，LPS腹腔注射诱导的感染性休克模型中，与空白对照组相比，模型组小鼠血清及腹腔灌洗液中IL-1β、IL-6和TNF-α分泌升高（P<0.01）。Avitinib治疗组中，血清和腹腔灌洗液的IL-1β分泌水平均下降（P<0.01，图5A、B），而IL-6（P>0.05）和TNF-α（P>0.05）分泌未受影响（图5C~F）。生存曲线分析显示，感染性休克组小鼠在LPS注射后14 h开始死亡，22 h内全部死亡；Avitinib 10 mg/kg给药组小鼠在LPS注射后20 h开始死亡（P<0.01，图5G）。

3 讨论

炎症是恶性肿瘤演进的关键特征之一^［18］。有研究表明，炎症微环境与肿瘤发生发展存在多维度交互作用，其分子机制涉及细胞增殖、侵袭迁移、血管生成及远处转移等多个关键环节^［19］，且在肿瘤微环境中各种促炎细胞因子的释放也极大的影响肿瘤进展^［20］。NLRP3炎症小体作为具有代表性且研究最为深入的炎症小体，在肿瘤中扮演着双重角色。有数据表明在部分恶性肿瘤中NLRP3的表达和激活与正常组织存在差异^［21］，如非小细胞肺癌^［22］、胰腺癌^［23］、恶性黑色素瘤^［24］等。但在结直肠癌^［25］和肝癌^［26］中NLRP3炎症小体表现出一定的保护作用。这提示在肿瘤相关疾病的治疗过程中，靶向NLRP3炎症小体或将成为一种可行的诊疗方向。目前对于Avitinib的研究主要聚焦于其优异的抗肿瘤效果，但是对于其抗炎潜力未见相关报道。鉴于NLRP3炎症小体在肿瘤中的重要作用及Avitinib在NSCLC中良好的治疗效果，设计体内和体外实验研究Avitinib对NLRP3炎症小体的抑制作用。

本研究利用Nigericin活化经典NLRP3炎症小体，通过Western blotting技术检测NLRP3炎症小体活化后细胞上清中炎症相关分泌蛋白水平（p20和IL-1β）和ELISA技术检测上清中的IL-1β水平，首次发现Avitinib可显著抑制Nigericin诱导的经典NLRP3炎症小体活化，但其作用浓度下不影响前体物质Pro-IL-1β和Pro-caspase-1蛋白的表达水平，且在THP-1细胞系和健康人PBMC中也显示出对NLRP3炎症小体活化具有良好的抑制效果，这些结果表明Avitinib在人和鼠中均能有效抑制NLRP3炎症小体活化，进一步支持其临床转化潜力。GSDMD是细胞焦亡的关键执行蛋白，其N端结构域（GSDMD-N）在激活后可寡聚化形成质膜孔道，导致细胞渗透性肿胀和死亡^［27］。本实验通过Western blotting检测发现加入Avitinib后可以显著抑制GSDMD通过剪切从全长（FL-GSDMD）形式转变为N端活性形式（p30），Avitinib对NLRP3炎症小体的抑制作用具有多路径调控特性，Avitinib抑制NLRP3炎症小体的具体作用机制还需后续进一步研究去阐明。目前较为熟知的NLRP3抑制剂有MCC950，曲尼斯特等，然而，MCC950因Ⅱ 期临床中或因高剂量引发的脱靶效应及肝脏毒性问题终止研发^［28］，曲尼斯特虽可特异性抑制NLRP3炎症小体活化，但存在细胞水平抑制浓度高（100 μmol/L）^［29］，而Avitinib相对于MCC950具有良好的耐受性和安全性，对比于曲尼斯特表现出更低的剂量优势（20 μmol/L），具有一定研发价值。

除Nigericin外，普遍认可的经典NLRP3炎症小体激活剂还有ATP与MSU，二者往往存在协同作用，共同调控NLRP3炎症小体相关疾病如急性痛风性关节炎^［30］等，本研究结果表明Avitinib也可抑制ATP和MSU引起的NLRP3炎症小体活化，具有广谱性。除NLRP3炎症小体的经典激活途径外，当革兰氏阴性菌突破细胞膜进入胞内时，其LPS可被caspase-11（小鼠）^［31］或caspase-4（人类）^［32］直接识别，触发非经典激活通路，这种对胞内病原体的响应机制也越来越得到重视，而我们的研究结果表明Avitinib也以剂量依赖地方式抑制该种途径，Avitinib对NLRP3经典与非经典激活途径的双重抑制作用使其在复杂炎症性疾病中具备广谱干预潜力，但需警惕过度抑制引发的宿主防御失衡及感染风险。

值得注意的是，Avitinib作为中国自主研发的第3代EGFR酪氨酸激酶抑制剂，目前主要是应用于非小细胞肺癌（NSCLC）患者。由于此类患者常伴随肿瘤相关全身炎症反应或感染并发症^［33］，本研究发现的NLRP3抑制作用可能为其临床疗效提供额外机制支持。NLRP3炎症小体的过度激活在感染性休克的疾病进展中起着重要的作用^［34］，本研究通过构建LPS诱导的感染性休克模型后牺牲小鼠，利用ELISA技术检测发现预先给药Avitinib（10 mg/kg）可以显著降低血清和腹腔灌洗液中IL-1β水平，但对IL-6和TNF-α无明显影响，而且在生存曲线模型中相对于模型组延长了小鼠的生存时间与数量，揭示了Avitinib在感染性休克中的抗炎新机制，但其意义不仅局限于脓毒症治疗。Avitinib可能成为同时靶向EGFR突变和NLRP3炎症小体的双功能药物，具有双重靶向潜力，尤其适用于EGFR突变阳性且伴随全身性炎症（如感染、恶病质）的肺癌患者，但还需进一步实验研究。本研究证实Avitinib通过抑制NLRP3炎症小体活化缓解感染性休克，但其作用机制需结合其已知的EGFR-TKI特性深入解析。既往肿瘤研究表明，Avitinib通过不可逆结合EGFR ATP口袋中的Cys797位点，显著抑制Tyr1068磷酸化及其下游Akt和ERK1/2信号通路^［35］。鉴于该通路已被证实参与调控NLRP3的转录激活与组装过程^［36-38］，在后续研究中需重点关注给药前后，Akt和ERK1/2相关信号通路主要蛋白在本体系中的表达变化情况。若Avitinib对NLRP3的抑制作用不依赖于EGFR信号通路，则需进一步探究其是否通过影响NLRP3炎症小体活化的上游信号如钾离子外流，线粒体损伤活性氧的产生等，若不影响则需考虑Avitinib是否与NLRP3炎症小体组分特异性结合，进而干预组装过程，最终实现抑制作用。实验结果表明Avitinib在小鼠感染性休克模型中的作用浓度为10 mg/kg，工作浓度较小，相比于第2代酪氨酸激酶抑制剂阿法替尼（15 mg/kg）^［39］具有一定优越性。本研究发现Avitinib能有效抑制NLRP3活化，提示其可能通过调控肿瘤-免疫-炎症相关通路，在EGFR突变型肺癌中实现“双靶点协同”——既直接抑制肿瘤生长，又改善免疫微环境。未来需系统性研究EGFR-TKI类药物与NLRP3炎症小体活化之间的关系，并在荷瘤模型中验证这一假设，并探索其与免疫治疗的联合潜力。

综上所述，本研究证实第3代EGFR酪氨酸激酶抑制剂Avitinib可抑制多种激活剂诱导的NLRP3炎症小体活化，抑制细胞焦亡，且在鼠源细胞与人源细胞中，均展现出对NLRP3炎症小体活化的显著抑制作用。在感染性休克模型中Avitinib有效缓解了LPS诱导产生的感染性休克症状，充分证实了该药物在相关炎症反应调控中的关键作用。这一发现不仅为解析Avitinib抑制NLRP3的分子机制提供了实验依据，同时强化了NLRP3在恶性肿瘤中的病理地位，并为感染性休克等NLRP3相关疾病的治疗策略开发指明新方向。

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基金资助

安徽省科研编制计划优秀青年科研项目(2022AH030140)

蚌埠医科大学2024年度研究生科研创新计划项目(Byycx24010)

蚌埠医科大学2024年度研究生科研创新计划项目(Byycx24030)

2025年大学生创新创业训练计划项目

慢性病免疫学基础与临床安徽省重点实验室开放课题基金(AHIAI2022K01)

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