层状双氢氧化物负载si-NEAT1通过miR-133b/PD-L1轴调控乳腺癌紫杉醇耐药及巨噬细胞极化

Layered double hydroxide-loaded si-NEAT1 regulates paclitaxel resistance and tumor-associated macrophage polarization in breast cancer by targeting miR-133b/PD-L1

摘要

目的 研究层状双氢氧化物（LDH）负载si-NEAT1对乳腺癌紫杉醇耐药及肿瘤相关巨噬细胞极化作用的分子机制。 方法 qRT-PCR、Western blotting检测乳腺癌亲本细胞（SKBR3）和紫杉醇耐药乳腺癌细胞（SKBR3-PR）中LncRNA NEAT1、miR-133b和PD-L1的表达；设置实验分组Control、si-NEAT1、miR-133b mimics，qRT-PCR、Western blotting检测SKBR3-PR中MRP、BCRP和PD-L1的表达，划痕、Transwell检测增殖迁移能力，流式细胞术检测细胞凋亡；采用si-NEAT1和miR-133b inhibitor进行Rescue实验；肿瘤细胞上清（CM）与巨噬细胞共培养，设置实验分组PBS、IL-4、PBS+SKBR3 CM、PBS+SKBR3-PR CM、IL-4+PR si-N CM，qRT-PCR检测M2型巨噬细胞标志物Arg-1、CD163、IL-10与miR-133b、PD-L1的表达，免疫荧光检测CD163与CD206；构建LDH@si-NEAT1纳米载体转染肿瘤细胞，设置分组Control、LDH、游离si-NEAT1、LDH@si-NEAT1，qRT-PCR、Western blotting、免疫荧光检测MRP、BCRP和PD-L1的表达，划痕、Transwell实验检测细胞增殖迁移能力，流式细胞术检测细胞凋亡；LDH@si-NEAT1 CM与巨噬细胞共培养，设置实验分组PBS、IL-4、IL-4+PR@ CM，qRT-PCR、免疫荧光检测Arg-1、CD163、IL-10及miR-133b和PD-L1的表达。 结果 相较于亲本乳腺癌细胞，紫杉醇耐药乳腺癌细胞中NEAT1表达上调、miR-133b下调和PD-L1上调（P<0.05）；si-NEAT1和 miR-133b mimics处理分别抑制了紫杉醇耐药乳腺癌细胞的活性，促进了细胞凋亡（P<0.01），MRP、BCRP表达下调（P<0.05）；敲低NEAT1，miR-133b表达上调，PD-L1表达下调（P<0.01），MRP、BCRP表达下调（P<0.001）；巨噬细胞M2型极化标志物Arg-1、CD163、IL-10在SKBR3-PR CM与巨噬细胞共培养后表达上调（P<0.05），而si-NEAT1 CM与巨噬细胞共培养后下调（P<0.05）；LDH@si-NEAT1作用肿瘤细胞，迁移侵袭能力下调，凋亡增加（P<0.01），MRP和BCRP以及PD-L1蛋白的表达降低（P<0.05），LDH@ si-NEAT1CM作用巨噬细胞Arg-1、CD163、IL-10表达下调，miR-133b上调，PD-L1下调（P<0.01）。 结论 LDH@si-NEAT1通过靶向miR-133b/PD-L1轴，调控乳腺癌细胞紫杉醇耐药与巨噬细胞极化。

Abstract

Objective To study the molecular mechanisms of LDH-loaded si-NEAT1 for regulating paclitaxel resistance and tumor-associated macrophage (TAM) polarization in breast cancer. Methods qRT-PCR and Western blotting were used to detect the expression of lncRNA NEAT1, miR-133b, and PD-L1 in breast cancer SKBR3 cells and paclitaxel-resistant SKBR3 cells (SKBR3-PR). The effects of transfection with si-NEAT1 and miR-133b mimics on MRP, MCRP and PD-L1 expressions and cell proliferation, migration and apoptosis were investigated using qRT-PCR, Western blotting, scratch and Transwell assays, and flow cytometry. Rescue experiments were conducted using si-NEAT1 and miR-133b inhibitor. Human THP-1 macrophages were cultured in the presence of conditioned media (CM) derived from SKBR3 and SKBR3-PR cells with or with si-NEAT1 transfection for comparison of IL-4-induced macrophage polarization by detecting the surface markers. LDH@si-NEAT1 nanocarriers were constructed, and their effects on MRP, MCRP and PD-L1 expressions and cell behaviors of the tumor cells were examined. THP-1 cells were treated with the CM from LDH@si-NEAT1-treated tumor cells, and the changes in their polarization were assessed. Results SKBR3-PR cells showered significantly upregulated NEAT1 and PD-L1 expressions and lowered miR-133b expression as compared with their parental cells. Transfection with si-NEAT1 and miR-133b mimics inhibited viability, promoted apoptosis and enhanced MRP and BCRP expressions in SKBR3-PR cells. NEAT1 knockdown obvious upregulated miR-133b and downregulated PD-L1, MRP and BCRP expressions. The CM from SKBR3-PR cells obviously promoted M2 polarization of THP-1 macrophages, which was significantly inhibited by CM from si-NEAT1-transfected cells. Treatment with LDH@si-NEAT1 effectively inhibited migration and invasion, promoted apoptosis, and reduced MRP, BCRP and PD-L1 expressions in the tumor cells. The CM from LDH@si-NEAT1-treated SKBR3-PR cells significantly downregulated Arg-1, CD163, IL-10, and PD-L1 and upregulated miR-133b expression in THP-1 macrophages. Conclusion LDH@si-NEAT1 reduces paclitaxel resistance of breast cancer cells and inhibits TAM polarization by targeting the miR-133b/PD-L1 axis.

Graphical abstract

关键词

乳腺癌紫杉醇耐药 / 乳腺癌 / LncRNA NEAT1 / miR-133b / PD-L1 / 层状双氢氧化物 / M2型巨噬细胞极化

Key words

paclitaxel resistance / breast cancer / lncRNA NEAT1 / miR-133b / PD-L1 / layered double hydroxide / M2 macrophage polarization

乳腺癌在全球癌症发病率位居第二，占女性癌症死亡率榜首^［1］。紫杉醇（PTX）是乳腺癌的一线治疗药物，但PTX耐药是临床乳腺癌治疗失败相关的主要死亡原因之一^［2］。常见的导致PTX耐药性的因素有ABC-转运蛋白、microRNA或某些基因的突变^［3］。长链非编码RNA （lncRNA）是一段长度大于200个核苷酸的基因片段，调控多个基因的表达，在多种肿瘤中异常表达，因此本文从LncRNA NEAT1基因突变入手，以期实现调控乳腺癌PTX耐药。

核旁斑组装转录本1（LncRNA NEAT1）是长链非编码RNA，在细胞核中的亚细胞结构旁斑中起着重要的结构和功能作用，通过多种机制参与基因表达的调节^［4］，通过调控不同的信号通路和基因表达，在多种细胞应激过程中发挥重要作用^{［5， 6］}，已被证明与癌症的多种化疗耐药性密切相关^{［7， 8］}。因此，NEAT1可能是各种癌症的潜在治疗靶标。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是肿瘤微环境中的重要组成部分，通过创建免疫抑制微环境在肿瘤发展和耐药性中发挥重要作用^［9］。化疗耐药通常与IL-6和前列腺素E2水平升高相关，两者都是导致M2巨噬细胞极化的炎症介质^［10］，认为化疗耐药与肿瘤微环境中巨噬细胞极化状态有关。NEAT1在M2型巨噬细胞极化细胞中上调^［11］，NEAT1作为PTX耐药与巨噬细胞极化的共同调控基因，其相关作用的分子机制尚未有报道，因此，探究NEAT1调控巨噬细胞极化机制对研究PTX耐药的发生和治疗有重要意义。

层状双氢氧化物（LDH）是一类二维结构的阴离子粘土材料，它的层间距可以根据需要进行调整，以适应不同大小的基因分子，从而实现高负载能力，在基因递送系统中具有独特的优势^［12］。目前常见的LDH负载物有化疗药物、抗生素、疫苗等^［13］，但是LDH负载基因药物少有报道。本文首次用LDH负载LncRNA si-NEAT1，探讨LDH@si-NEAT1对乳腺癌紫杉醇耐药和巨噬细胞极化的相互作用，研究LDH负载si- NEAT1对紫杉醇耐药乳腺癌细胞增殖、迁移、凋亡及多药耐药分子表达及TAMs极化的影响及作用机制，为临床上乳腺癌紫杉醇耐药治疗带来新方向。

1 材料和方法

1.1 主要材料与试剂

人HER2阳性乳腺癌细胞株SKBR3、人急性白血病单核细胞Thp-1（中国科学院上海细胞生物学研究所）；SKBR3-PR紫杉醇耐药细胞株为课题组前期构建。转染试剂si-NEAT1、miR-133b mimics及inhibitor（吉玛）；多药耐药蛋白（MRP）、PD-L1（proteintech）；乳腺癌耐药蛋白（BCRP）（abclonal）；IL-4（Bio-techne）。

1.2 细胞培养与条件培养基的收集

乳腺癌SKBR3、SKBR3-PR、Thp-1细胞均置于细胞培养箱（37 ℃，5% CO₂）中。将人单核细胞Thp-1通过200 ng/mL的佛波酯（PMA）诱导24 h后贴壁分化成M0型巨噬细胞，再加入20 ng/mL的IL-4使M0型巨噬细胞诱导为M2型巨噬细胞。进行巨噬细胞相关实验时，需在2 mL适当密度的Thp-1细胞悬浮液中加入200 ng/mL PMA，共培养24 h 细胞贴壁生长后继续后续实验。肿瘤细胞接种在10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，并在细胞培养箱中培养至70%~90%的密度，收集细胞培养基后用1000 r/5 min离心后去除细胞碎片和死细胞就得到细胞上清，构成完全培养基即SKBR3-PR CM。

1.3 荧光定量PCR实验

根据实验步骤提取细胞总RNA，用逆转录试剂盒（GeneCopoeia）逆转录cDNA，采用 SYBR Green PCR Master Mix进行qPCR扩增，引物由上海生工公司合成，序列见表1。

1.4 Western blotting实验

将六孔板中的细胞收集起来后离心，弃上清后用裂解液在冰上裂解30 min，离心后吸取上清，按照比例加入上样缓冲液混匀，在100 ℃下煮蛋白15 min。经过蛋白定量后进行上样，在120 V条件下电泳90 min，然后在冰盒中200 mA条件下转膜2 h将蛋白转印到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，转膜结束后用TBST缓冲液清洗，用5%胎牛血清封闭2h，经TBST缓冲液清洗10min ×3次后将PVDF膜转移到提前配置的一抗抗体盒中，4℃过夜，抗体按照推荐比例稀释MRP（Mouse 1∶5000），BCRP（Rabbit 1∶1000），PD-L1（Mouse 1∶5000），GAPDH（Mouse 1∶50000）（Rabbit 1∶50000），次日将PVDF膜经TBST缓冲液清洗10 min×3次后，用相应的二抗37 ℃孵育2 h后显影，使用ImageJ软件分析蛋白表达水平。

1.5 划痕愈合和Transwell实验

划痕愈合实验：将SKBR3-PR细胞均匀接种于六孔板中，待细胞密度至80%~100%时，用无菌10 μL白色枪头受力均匀地在每孔中做“十”字划痕，用PBS清洗后加低浓度血清培养基继续培养，显微镜下在不同时间段（0、24、48 h）拍照，根据划痕面积变化计算细胞迁移率。Transwell实验：将细胞悬液加入上室，下室加入高血清浓度培养基，培养24h后统计穿过膜的细胞数。

1.6 流式细胞仪检测凋亡实验

收集细胞后用PBS重悬，然后分别在每管中先加入5 μL Annexin V-FITC染液，再加入3 μL PI。常温下避光孵育30 min，上机，用flowJo软件分析细胞凋亡率。

1.7 免疫荧光

用共聚焦小皿将细胞培养至适宜密度后，首先用4%多聚甲醛溶液固定10 min，PBS缓冲液洗涤后室温下使用2%胎牛血清封闭液封闭1 h，PBS洗涤后接着在4 ℃下孵育相应一抗BCRP（Rabbit 1∶100）、CD163（1∶100）、CD206（1∶100）过夜，经过PBS洗涤后，室温下孵育用异硫氰酸荧光素（FITC）荧光标记的二抗1 h，再次洗涤，使用DAPI对细胞核进行染色，并在避光条件下孵育10 min，用PBS洗涤液清洗。最终，样本通过蔡司高级倒置荧光显微镜成像，并分析结果。

1.8 LDH@si-NEAT1的制备及表征验证

在充满氮气的三颈烧瓶中37 ℃下加入用4 mL的脱碳去离子水溶解混匀的NaOH搅拌5 min，再加入用10 mL脱碳去离子水溶解的摩尔比为3∶1的MgCl₂·6H₂O与AlCl₃·6H₂O的金属盐溶液并混匀，于37 ℃下剧烈搅拌 30 min，倒入高速离心管中，4 ℃，4000 r/10 min离心3次，弃去上清后使用脱碳水清洗。将清洗后的产物置于反应釜。100 ℃下反应16 h，待冷却后12 000 r/min，4 ℃离心1 h，弃去上清，所得沉淀即为 LDH 纳米载体。取制备的LDH纳米载体进行称量后置于干燥箱中烘干，用适量焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解后超声1 h，按比例与si-NEAT1在室温下用涡旋振荡器振荡孵育1 h混匀，即可得到LDH@si-NEAT1。制备2%琼脂糖凝胶和LDH@si-NEAT1复合物，LDH与si-NEAT1比例1∶1至40∶1，100V电泳20 min后用Chemidoc XRS+采集图像系统成像分析。DEPC水分别溶解LDH与LDH@ si-NEAT1，马尔文粒度电位测定仪测定平均粒径与Zeta电位；使用Tensor 27光谱仪和D8 Advance设备进行X射线衍射分析；将LDH与LDH@si-NEAT1的悬浊液超声20 min左右分散后风干，在80 kV加速电压下，在HT7700 透射电子显微镜上采集二者透射电镜（TEM）图像。

1.9 LDH@ si-NEAT1细胞摄取、溶酶体逃逸及溶酶体通透性实验

使用终浓度为100 nmol/L的游离si-NEAT1-Cy3或100 nmol/L LDH@ si-NEAT1-Cy3 的加药工作液，避光孵育，检测细胞摄取LDH@ si-NEAT；溶酶体逃逸实验用完全培养基配制的终浓度为2 μmol/L的Lyso-tracker探针加药工作液，并避光孵育3h。每个皿加入400 μL 4%多聚甲醛固定15 min后PBS清洗细胞，加入10 μg/mL DAPI溶液避光孵育10~15 min，PBS清洗细胞。在激光共聚焦显微镜下拍摄分析。使用Acridine Orange染色液测定溶酶体膜通透性，在激光共聚焦显微镜下，通过绿色（Em=488 nm、Ex=520 nm）和红色（Em=543 nm、Ex=603 nm）荧光通道观察并拍摄细胞。

1.10 统计学分析

所有实验均进行了3次独立重复。使用Graph Pad prism7.0进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用两独立样本t检验，多组间的比较采用单因素方差分析。P<0.05时认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 LncRNA NEAT1调控乳腺癌细胞紫杉醇耐药

Western blotting和免疫荧光实验表明，SKBR3-PR中MRP与BCRP表达上调（P<0.05，图1A、B）；qRT-PCR检测NEAT1表达上调（P<0.01，图1C）；Western blotting显示si-NEAT1 后MRP和BCRP的表达降低（P<0.001，图1D）；流式细胞术检测si-NEAT1，细胞凋亡率升高（P<0.01，图1E）；划痕实验显示si-NEAT1组的伤口愈合率降低（P<0.001，图1F）；Trnswell实验显示穿膜细胞数减少（P<0.001，图1G）。

2.2 LncRNA NEAT1通过调控miR-133b影响乳腺癌细胞紫杉醇耐药性

qRT-PCR显示在SKBR3-PR细胞中miR-133b表达下调，si-NEAT1后miR-133b表达上调（P<0.001，图2A、B）；Western blotting实验表明MRP、BCRP表达明显降低（P<0.05，图2C），免疫荧光显示耐药蛋白荧光强度减弱（图2D），划痕实验和Transwell实验结果表明，伤口愈合率和穿孔细胞数降低（P<0.001，图2E、F），流式细胞术结果显示凋亡率升高（P<0.01，图2G）。

2.3 LncRNA NEAT1调控miR-133b靶向PD-L1影响乳腺癌紫杉醇耐药

SKBR3-PR中PD-L1表达上调（P<0.05，图3A），干扰NEAT1表达后，PD-L1表达下调P<0.001，图3B）；StarBase网站预测结果表明miR-133b与PD-L1直接结合（图3C）；Western blotting 检测PD-L1在si-NEAT1组和miR-133b mimics组表达下调（P<0.01，图3D、E）；在si-NEAT1的SKBR3-PR细胞内转入miR-133b inhibitor，Western blotting（图3F）、qRT-PCR（图4A）、免疫荧光（图4B）结果显示MRP、BCRP以及PD-L1蛋白、PD-L1 mRNA表达上调（P<0.05），耐药蛋白的免疫荧光强度增强，划痕（图4C）、Transwell（图4D）和流式细胞术（图4E）结果显示细胞伤口愈合率和穿孔数回升（P<0.001）、凋亡率下调（P<0.05）。

2.4 LncRNA NEAT1调控TAMs 极化

在高倍显微镜下观察Thp-1细胞和经过PMA刺激24 h后的Thp-1细胞（图5A）可见Thp-1细胞经过PMA刺激后由悬浮变成贴壁状态，且细胞形态不规则并可见少量突起；qRT-PCR检测M0型巨噬细胞标志物CD68在Thp-1+PMA中上调（图5B，P<0.05）；qRT-PCR检测M0型巨噬细胞与SKBR3共培养后M2型巨噬细胞标志物Arg-1、CD163和IL-10的表达低于IL-4刺激组（P<0.001），而与SKBR3-PR细胞共培养后Arg-1、CD163和IL-10上调（P<0.01）（图5C、D）；免疫荧光结果显示M0型巨噬细胞与SKBR3细胞CM共培养，CD163与CD206免疫荧光强度无影响，而与SKBR3-PR细胞CM共培养后CD163与CD206免疫荧光强度增加（图5E）；Timer2.0数据库分析发现在乳腺癌中NEAT1的表达水平与巨噬细胞浸润呈正相关（P<0.01，图5F）；在Thp-1中加PMA刺激后，分别与PBS、IL-4和SKBR3-PR细胞CM共培养，qRT-PCR结果显示与SKBR3-PR上清共培养后NEAT1表达上调（P<0.05，图6A）；随后将经PMA刺激后与再经IL-4刺激的Thp-1与si-NEAT1的紫杉醇耐药乳腺癌细胞CM共培养，经qRT-PCR检测结果显示Arg-1、CD163和IL-10的表达下调（P<0.05，图6B），免疫荧光结果显示CD163与CD206荧光强度减弱（图6C），qRT-PCR结果显示miR-133b表达上调而PD-L1表达下调（P<0.01、P<0.001，图6D），Western blotting结果显示PD-L1的表达下调（P<0.05，图6E）。

2.5 层状双氢氧化物LDH负载si-NEAT1纳米材料的构建

LDH的合成与LDH@si-NEAT1的搭载过程如图7A所示；琼脂糖凝胶电泳筛选LDH与si-NEAT1的最佳质量搭载比为30∶1（图7B）；马尔文粒度仪分析LDH@ si-NEAT1的粒径分布为292 nm，分散系数（PDI）为 0.193，zeta电位为+27.2 mV（图7C、D）；透射电镜结果显示，LDH与LDH@si-NEAT1均呈现规则的六边形片状结构（图7E）；X-射线衍射仪实验结果显示LDH@NEAT1表现出与 LDH 相似的特征衍射图谱（图7F）；UV实验结果表明LDH@si-NEAT1在240 nm左右处有特征峰（图7G）；细胞摄取实验显示单独的si-NEAT1-Cy3进入SKBR3-PR细胞2 h后荧光淬灭，而LDH@si-NEAT1-Cy3处理2 h后即可被细胞摄取，且24 h仍有橙色荧光信号被检测出（图8A）；溶酶体逃逸实验结果显示LDH@si-NEAT1被SKBR3-PR细胞摄取后，在4 h时即可在SKBR3-PR细胞内部显示出明显的橙色荧光，并与溶酶体的绿色荧光重叠（图8B）；吖啶橙染色检测溶酶体膜通透性，共聚焦拍摄结果显示用LDH孵育的SKBR3-PR细胞显示出微弱红色荧光与清晰的绿色荧光，即溶酶体膜通透性增加，部分吖啶橙染液进入，而未经LDH处理的细胞溶酶体膜通透性不变（图8C）。

2.6 LDH@si-NEAT1调控乳腺癌细胞耐药与M2型巨噬细胞极化

将LDH@si-NEAT1转入SKBR3-PR细胞，划痕、Transwell和流式细胞术实验结果显示，SKBR3-PR细胞的伤口愈合率和穿孔数降低，凋亡率增加（P<0.001，图9A~C），qRT-PCR实验结果显示miR-133b表达上调，PD-L1表达下调（P<0.001，图9D），Western blotting结果显示MRP和BCRP以及PD-L1蛋白的表达下调（P<0.05，图9E），免疫荧光结果显示耐药蛋白荧光减弱（图10A）；然后将LDH@si-NEAT1的紫杉醇耐药乳腺癌细胞CM与经PMA和IL-4刺激后的Thp-1细胞共培养，qRT-PCR检测结果显示Arg-1、CD163、IL-10表达下调（P<0.01，图10B），免疫荧光结果显示CD163、CD206的荧光强度减弱（图10C），qRT-PCR（图10D）和Western blotting（图10E）实验结果表明miR-133b表达上调（P<0.001），而PD-L1表达下调（P<0.05）。

3 讨论

癌症化疗耐药性已成为临床肿瘤治疗一大难题，而在TME中细胞耐药性通常与TAMs极化状态有关。在乳腺癌的免疫微环境中，TAMs通常呈现出M2型极化状态，这种状态与免疫抑制效应相关，能够促进肿瘤细胞的增殖和逃逸免疫系统的监视^［14］。因此，针对TAMs的极化状态进行干预，可能成为克服乳腺癌耐药性的一种潜在策略。LncRNA NEAT1已被证明与癌症的化疗耐药性密切相关^［15］。实验室前期研究发现NEAT1在紫杉醇耐药乳腺癌细胞中显著升高^［16］，本研究结果显示NEAT1在SKBR3-PR细胞中高表达。NEAT1通过调节细胞凋亡、细胞周期、药物转运和代谢、DNA损伤修复、上皮-间充质转化、自噬、癌症干细胞特性和代谢重编程来诱导癌细胞对化疗药物的耐药性^［17］。有研究表明异质核糖核蛋白A2B1和NEAT1协同作用，通过Wnt/β-catenin信号通路增强胃癌细胞的干性，并加剧胃癌中的化疗耐药性^［18］；在p53野生型乳腺癌细胞中，敲低NEAT1可部分挽救MED12缺失引起的5-氟尿嘧啶化疗耐药^［19］；在晚期肺腺癌细胞中NEAT1通过miR-338-3p靶向AKR1C1抑制细胞铁死亡进而促进晚期肺腺癌细胞吉非替尼耐药性、增殖、迁移和侵袭^［20］；本研究通过实验发现在SKBR3-PR中si-NEAT1后，MRP、BCRP水平下调，伤口愈合率和穿孔数降低，凋亡率增加，提示si-NEAT1可抑制紫杉醇耐药乳腺癌细胞的耐药性和生物学活性，这与Wang等^［21］的研究结果相一致。NEAT1与巨噬细胞极化也有关。将小鼠骨髓单核细胞向巨噬细胞M1和M2a方向极化，结果发现NEAT1和IL-33在M2a巨噬细胞中的表达水平显著上调^［11］，这提示NEAT1的表达与巨噬细胞极化成正相关。本研究发现NEAT1在经PMA和IL-4刺激后的Thp-1细胞中显著上调，并且将转染si-NEAT1的紫杉醇耐药乳腺癌细胞上清收集起来与经PMA和IL-4刺激后的Thp-1细胞共培养，M2-TAMs标志物Arg-1、CD163和IL-10的表达下降，说明沉默乳腺癌细胞中NEAT1表达，可抑制M2-TAMs极化，此结果也与前人研究结果一致^［22］。因此作者认为NEAT1是乳腺癌紫杉醇耐药和TAMs极化的治疗靶点，但是具体机制仍未有研究报道。

NEAT1也可作为针对许多microRNA的海绵或竞争性抑制剂，它还通过捕获含有副斑点的NEAT1中的蛋白质发挥作用，从而调节转录。在胰腺癌细胞内敲低NEAT1可通过上调miR-146b-5p/TRAF6水平抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭^［23］；在宫颈癌细胞中，NEAT1通过调节miR-377/FGFR1轴抑制Hela细胞活力和迁移，促进细胞凋亡^［24］。以上报道表明NEAT1可以调控microRNA靶向蛋白调控细胞生物学活性与功能。有文献报道NEAT1与miR-133b有结合位点^［16］，在SKBR3-PR中si-NEAT1后，miR-133b的表达升高。本研究发现过表达miR-133b后PD-L1表达降低，提示二者可能有调控关系，且生物信息学发现miR-133b与PD-L1有结合位点。在舌鳞状细胞癌中，沉默CXCR4抑制了细胞顺铂耐药性，而敲低miR-133b则逆转了这种耐药性^［25］，说明miR-133b与细胞耐药性有关；本研究在过表达miR-133b后，SKBR3-PR细胞的MRP和BCRP表达水平下调，说明miR-133b抑制SKBR3-PR细胞耐药性。在非小细胞肺癌中，A549细胞经双硫仑（DSF）处理后PD-L1表达增加，因此抗PD-L1和DSF的联合处理后，导致A549细胞发生铜死亡从而抑制了细胞活力^［26］。本实验发现PD-L1在SKBR3-PR细胞中上调，提示PD-L1与癌细胞化疗后耐药性也有关，且si-NEAT1后miR-133b表达水平上调而PD-L1下调，过表达miR-133b后PD-L1下调，说明NEAT1、miR-133b与PD-L1之间存在调控关系。目前未有研究报道NEAT1通过miR-133b靶向PD-L1调控细胞耐药性与TAMs极化。本实验研究发现在SKBR3-PR细胞中si-NEAT1后miR-133b上调，PD-L1下调，过表达miR-133b后PD-L1下调，提示NEAT1靶向miR-133b调控PD-L1，并通过在沉默NEAT1的耐药细胞中转入miR-133b inhibitor进行的回复实验进一步证明了此结论。si-NEAT1的CM与M2-TAMs共培养后，miR-133b上调和PD-L1的表达下调，巨噬细胞Arg-1、CD163和CD206表达下调，说明在巨噬细胞中通过si-NEAT1/miR-133b/PD-L1通路可以抑制巨噬细胞极化。综上，实验结果表明在SKBR3-PR细胞中，通过沉默NEAT1释放miR-133b，可以降低PD-L1的表达水平，从而抑制紫杉醇耐药乳腺癌细胞的活性，并降低紫杉醇耐药性，释放到M2型巨噬细胞中又可抑制M2型巨噬细胞极化。

二维纳米结构的层状双氢氧化物（LDH）是一种无机材料，因其出色的生物相容性、高负载能力、pH敏感的释放特性、易于表面修饰、细胞内运输能力、安全性以及在癌症免疫治疗和基因编辑技术中的潜力而受到关注^［27］，因此适用于治疗性生物应用。自从DNA分子嵌入LDH材料中以来，已经开发了各种LDH纳米杂交体用于生物医学药物递送系统。目前常见的以LDH为载体的搭载药物应用于基因治疗、化疗、免疫疗法和联合治疗等方面^［28］。在乳腺癌细胞SKBR3中，LDH负载miR-30a将癌细胞阻滞在G0/G1期抑制了癌细胞增殖并抑制了上皮-间充质转化进程^［29］；在结直肠癌中，LDH通过负载化疗药5-氟尿嘧啶和与白蛋白结合的PTX增加了结直肠癌细胞的凋亡率，用于治疗结直肠癌^［30］；LDH负载双氢青蒿素（DHA）可作为一种癌症纳米疫苗，在肿瘤微环境中降解，释放铁离子、铝离子和DHA，加重肿瘤内氧化应激损伤，导致癌细胞凋亡、铁凋亡和免疫原性细胞死亡，随后释放的肿瘤相关抗原与铝佐剂形成癌症纳米疫苗，产生强大的和长期的免疫反应^［31］。在本实验中，通过材料表征实验表明LDH和LDH@si-NEAT1已被成功制备，且能被细胞摄取，并增加了溶酶体膜的通透性和从溶酶体中逃逸从而不被降解。在SKBR3-PR中LDH负载si-NEAT1后，miR-133b的表达上调，PD-L1及耐药蛋白MRP、BCRP的表达下调，同时下调M2型巨噬细胞极化标志物Arg-1、CD163、IL-10表达，说明LDH@si-NEAT1通过miR-133b靶向PD-L1从而调控乳腺癌紫杉醇耐药性，抑制 M2-TAMs极化。

综上所述，本研究揭示了LDH作为si-NEAT1的载体在药物递送系统中显示出潜力，LDH@si-NEAT1通过靶向miR-133b/PD-L1轴，调控乳腺癌紫杉醇耐药性和M2-TAMs巨噬细胞极化，为临床乳腺癌治疗揭示了一种新的分子机制。

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