“气经-血络”截断动脉粥样硬化斑块形成：降脂化斑方调控小鼠肝脏逆向胆固醇转运途径改善动脉粥样硬化的机制

Disrupting atherosclerotic plaque formation via the "qi meridian-blood channel": mechanism of Jiangzhi Huaban Decoction for regulating hepatic reverse cholesterol transport to improve atherosclerosis

摘要

目的 在“气经-血络”的病理演变路径上，探究降脂化斑方（JZHB）改善动脉粥样硬化（AS）斑块的作用及其机制。 方法 C57BL/6小鼠给予普通饲料作为空白对照组；将ApoE^-/-基因敲除小鼠给予高脂饲料联合喂养8周后随机分为模型组，JZHB低、中、高剂量组及阿托伐他汀钙组，8只/组，药物干预8周。每周记录小鼠体质量及一般情况，干预结束后取材，采用全自动生化分析仪检测小鼠血清中的甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、总胆汁酸、丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶含量；采用油红O染色观察肝脏、主动脉脂质积聚情况；采用苏木素-伊红染色观察小鼠肝脏及主动脉根部的病理变化情况；采用转录组学测序技术分析其核心分子机制，并通过Western blotting、免疫组化检测核心机制靶标蛋白表达情况。 结果 JZHB可降低AS小鼠血脂、总胆汁酸含量水平（P<0.05），改善肝功能损伤、脂肪变性及脂质沉积水平（P<0.05），减少主动脉脂质沉积及斑块面积（P<0.05）。转录组学分析显示，其机制与调控胆固醇逆向转运、炎症信号通路密切相关。动物实验结果显示，JZHB可上调小鼠肝脏中PPARγ、LXRα、ABCA1、ABCG1、CYP7A1蛋白表达（P<0.05），下调肝脏中p-NF-κB/NF-κB磷酸化比值、IL-6、IL-1β蛋白表达（P<0.05），上调肠道中ABCG5、ABCG8蛋白表达（P<0.05），并降低主动根斑块内ICAM-1、VCAM-1蛋白表达（P<0.05）。 结论 JZHB能综合改善AS小鼠病变，其核心机制可能通过调控肝脏PPARγ/LXRα/NF-κB信号通路，改善肝脏胆固醇逆向转运及炎症水平，进而改善AS血管的脂质沉积损伤及斑块形成。

Abstract

Objective To explore the molecular mechanism of Jiangzhi Huaban Decoction (JZHBD) for improving atherosclerosis through the "qi meridian-blood channels" pathway. Methods ApoE^-/- mouse models of atherosclerosis were established by high-fat diet feeding for 8 weeks, with C57BL/6 mice on a normal diet as the controls. Forty ApoE^-/- mouse models were randomized into model group, low-, medium-, and high-dose JZHBD treatment groups, and atorvastatin treatment group (n=8) for their respective treatments for 8 weeks. The changes in body weight and overall condition of the mice were monitored weekly. After the treatments, serum levels of TC, TG, HDL-C, LDL-C, TBA, ALT, and AST of the mice were measured, pathological changes in the liver and aortic root plaques were examined with HE staining, and lipid accumulation in the liver and aortic wall was assessed using Oil Red O staining. The core molecular mechanism was studied through transcriptomics, and the expressions of the key pathway proteins were confirmed using Western blotting and immunohistochemistry. Results Treatment with JZHBD significantly reduced blood lipid and total bile acid levels, improved liver function and hepatic steatosis, and decreased aortic lipid deposition and plaque area in the mouse models of atherosclerosis. Transcriptomic analysis suggested that the therapeutic mechanism of JZHBD involved reverse cholesterol transport, PPAR signaling, and the inflammatory pathways. In atherosclerotic mice, JZHBD treatment obviously up-regulated hepatic expressions of PPARγ, LXRα, ABCA1, ABCG1, and CYP7A1, down-regulated hepatic expressions of p-p65/p65, IL-6, IL1β in the liver, increased ABCG5 and ABCG8 expressions in the intestines, and decreased ICAM-1 and VCAM-1 expressions in the aortic plaques. Conclusion JZHBD improves atherosclerotic vascular damage and plaque formation possibly by regulating hepatic reverse cholesterol transport and inflammation via modulating the hepatic PPARγ/LXRα/NF-κB signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

动脉粥样硬化 / 气经-血络 / 降脂化斑方 / 胆固醇逆向转运 / 血管细胞黏附分子

Key words

atherosclerosis / qi meridian-blood channels / Jiangzhi Huaban Decoction / reverse cholesterol transport / vascular cell adhesion molecules

动脉粥样硬化（AS）是由于脂质在中、大动脉内壁的逐渐累积，引起血流减少或血管堵塞，其病理状态进展缓慢且持续。动脉斑块的形成是心脑血管等诸多疾病的共同病理基础^［1］。其确切病因尚不明确，研究显示^［2］，甚至在婴儿血管中发现AS的存在，而随着年龄的增长，AS会逐渐加重，病理演变从内膜损伤到泡沫细胞、脂质条纹出现、动脉粥样硬化的演变、复杂纤维斑块形成及破裂等一系列进程。

AS病理演变全过程中，血脂异常是其发生发展的核心病理驱动力。血液中的脂质成分，如胆固醇、游离脂肪酸和甘油三酯水平的上升，都是导致AS疾病发展的重要病理因素^［3］。肝脏是机体胆固醇代谢及炎症反应调控的中心器官，当因饮食及外界环境因素导致肝脏功能紊乱，会导致胆固醇等代谢异常并诱发肝脏炎性病变，病理性胆固醇随血液循环沉积动脉壁及管腔，此为AS及斑块产生的核心病理途径，人工合成胆固醇逆向转运（RCT）激动剂在AS防治中表现出诸多不确定性，且存在多种毒副作用。遂基于中医药理论指导下，研发可以抑制及改善AS有效方药是医药行业研究的新思路和前沿领域^［4］。

根据AS临床表现，中医历史上将其主要归为“脉痹”、“中风”、“眩晕”等病症范畴^［5］。中医药干预AS具有独特的优势，如既往研究表明，大柴胡汤具有改善机体脂代谢水平、降低炎症因子活性、重塑肠道菌群分布、抑制斑块形成，多层次协同调控发挥抗AS的作用^［6-8］。课题组前期成功挖掘曾荣修老中医临床经验方，曾老以“大柴胡汤”为源，在“三焦气化失司，湿热-痰淤-络阻”病理演变路径下拓展开发治疗动脉粥样硬化有效方剂降脂化斑方（JZHB），多年临床应用安全有效，并获得国家发明专利授权（ZL 2020101219666）。复方源于《伤寒论》经典方剂，拓展结合叶天士“气经-血络”理论，以“和”为法调畅三焦气机，分消走泄，以复三焦气化之常，除湿热痰浊扰经，养阴通络，调血络热瘀虚，还血脉调和之机，实现复方在辨治AS斑块治疗上的普效性和安全性，但其基于中医学理论应用指导下的现代药理学机制尚未阐明。本研究在“气经-血络”的病理演变路径上，应用高通量测序技术结合动物实验，针对JZHB改善AS核心分子机制调控途径进行探索，以揭示复方药效基础和靶器官分子效应，为中医药改善AS提供安全有效药物做基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物

40只6~8周龄SPF级雄性Apo E^-/-基因敲除小鼠，8只雄性C57BL/6小鼠，体质量22~28 g，小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司，生产许可证编号为SCXK（京）2019-0008。小鼠均饲养于浙江中医药大学实验动物中心，遵循动物伦理规范（伦理批号：IACUC-202311-06）。小鼠在实验期间自由饮水进食，室内温度22~24 ℃，相对湿度50%~60%，12 h明暗交替。

1.1.2 药品与试剂

JZHB（柴胡、黄芩、生大黄、干姜、党参、白术、枳实、白芍、水蛭、生牡蛎、甘草），应用均符合2020年版《中国药典》规定，饮片购自广东省第二中医院，并经广东省第二中医院中药制剂室制备及质量控制。阿托伐他汀钙片（辉瑞，10 mg/片）。高脂饲料（常州鼠一鼠二生物科技有限公司）；维持饲料（执行标准：Q/3201 XT04-2018，江苏省协同医药生物工程有限责任公司）。

油红O染色试剂盒、苏木素-伊红染色液（北京索莱宝科技有限公司）；PPARγ抗体、LXRα抗体、ABCA1抗体、ABCG1抗体、NF-κB p65抗体、Phospho-NF-κB p65抗体、IL-6抗体、IL-1β抗体、ICAM-1 抗体、VCAM-1抗体，CYP7A1抗体 、ABCG5抗体 、ABCG8 抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）。

1.1.3 仪器

数字病理切片扫描系统（日本滨松），全自动包埋机、切片机、染色机（赛默飞），分析天平（梅特勒-托利），恒温电热箱（上海博迅实业有限公司），电泳和转膜仪器、蛋白质印迹成像仪及定量检测系统（Bio-Rad），全波长酶标仪（Thermo Fisher）。

1.2 方法

1.2.1 AS小鼠模型建立、分组与给药

8只C57BL/6小鼠予普通维持饲料喂养，作为空白对照组；40只ApoE^-/-小鼠予高脂饲料喂养8周，诱导AS小鼠模型^［6］，随机分为模型组、JZHB低剂量（JZHB-L）组、中剂量（JZHB-M）组、高剂量（JZHB-H）及阿托伐他汀钙组（ATO），8只/组。根据《中药药理研究方法学》“人和动物体表面积折算等效剂量比率”换算复方干预剂量分别为：1.32 g/（kg·d）、2.64 g/（kg·d）、5.28 g/（kg·d）；阿托伐他汀钙片3.75 mg/（kg·d）。各组灌胃给药1次/d，空白组给予同体积0.9%氯化钠溶液，连续给药8周。

1.2.2 一般状态监测

在实验过程中，评估各组小鼠的生存状态，包括毛发、精神状态、灵活度、饮食饮水摄入以及体质量。

1.2.3 血清生化检测

在实验结束后，经过12 h的禁食，对小鼠进行麻醉处理，并从其眼窝中采集血液样本。血液被放置于抗凝管中，静置3 h后，再以3000 r/min离心15 min，分离出血清。应用全自动生化分析仪对各组小鼠血清中甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、总胆汁酸（TBA）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）含量进行检测。

1.2.4 油红-O染色

PBS缓冲液灌注冲洗组织，在体式显微镜下切割并固定，异丙醇（60%）中浸泡后，置于油红工作染液30 min避光染色至斑块红染，异丙醇漂洗背景透明，拍照，照片在IPP6.0图像分析软件中分析，测量肝脏及血管组织染成红色的面积和总面积，评估脂质沉积病变程度。

1.2.5 苏木素-伊红（HE）染色

取样时对主动脉弓、动脉根部和肝脏组织进行固定，使用4%多聚甲醛溶液进行处理。取主动脉弓+动脉根、肝脏组织进行梯度乙醇脱水，接着依次进行二甲苯透明与石蜡包埋后切片（厚度为4 μm）接着贴片、烘片、脱蜡、梯度复水，以备HE染色。采用数字切片扫描仪扫描成像，利用滨松 NDP.View 浏览分析软件，评估每张切片肝脏及动脉根斑块组织病变损伤情况。

1.2.6 转录组学检测

转录组测序由北京诺禾致源科技股份有限公司进行。使用标准化的流程从整个主动脉中获取RNA样本，随后通过Agilent 2100生物分析仪对RNA进行质量控制，评估其完整性。使用NEB普通建库方案或链特异性建库方案进行文库构建，文库完成后通过Qubit2.0荧光测定仪进行初步浓度测量，将文库稀释至1.5 ng/μL，随后借助Agilent 2100 bioanalyzer检验文库的插入片段大小，并利用qRT-PCR对文库的有效浓度进行精准测定；在文库质量合格的前提下，根据有效浓度与计划测序数据量的要求进行文库的混合，随后执行Illumina平台的测序。通过高通量测序仪获取的图像数据经过 CASAVA 软件进行碱基识别，从而转变为测序序列（reads）；利用 featureCounts（1.5.0-p3）工具对每个基因进行读数的统计，以计算映射到这些基因的读取数。对处理后数据进行全面系统整理，以|log2差异倍数|>1、P<0.05为筛选参数，进一步筛选差异表达基因。利用 DESeq2 软件（1.20.0）执行不同组合间的差异表达分析，通过火山图可视化差异基因分布情况，基于lg（FPKM+1）标准化数据及加权基因共表达网络分析差异基因功能表达模块，对差异基因进行基因本体GO功能注释及KEGG通路富集，采用超几何检验筛选显著富集的生物学条目，以Rich factor评估差异基因通路富集程度。

1.2.7 Western blotting检测

取各组小鼠肝脏、小肠组织，加入裂解液提取蛋白，配置BCA工作液，计算蛋白的纯度和浓度，加入上样缓冲液，95 ℃恒温加热10 min，分装样本，制备分离胶、浓缩胶，依次上样进行电泳、转膜、封闭。以1∶1000的比例稀释抗体，4 ℃过夜孵育一抗，将二抗以1∶5000的比例稀释，37 ℃孵育1 h，ECL显影液进行成像，所得到的图像将通过Image J进行分析。

1.2.8 免疫组化检测

对小鼠主动脉组织进行固定处理后，经过脱水、包埋以及切片，接着进行脱蜡，利用柠檬酸钠进行抗原修复，冷却后再用非特异性染色的阻断剂5%BSA封闭处理，最后在4 ℃下过夜孵育一抗、后二抗孵育、DAB染色，自然晾干封片，在光学显微镜下成像观察动脉根部，随机选取5~6个视野进行拍照，Image J软件计算各组阳性面积的表达情况。

1.3 统计学分析

采用SPSS 23.0软件进行统计学分析，计量资料用均数±标准误表示，数据在满足正态分布和方差齐性的前提下，两组比较采用两独立样本t检验；多组比较采用单因素方差分析，应用Dunnett's多重比较进行后检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 JZHB对AS小鼠一般生存状态的影响

空白组小鼠精神状态佳，饮食、饮水正常，运动较为灵活；与空白组相比，模型组小鼠精神疲惫，体质量增加（P<0.01），运动欠灵活；与模型组相比，JZHB组小鼠精神状态、运动、体质量、肝质量均有一定改善（P<0.05），高剂量组小鼠体质量、肝质量改善（P<0.01，图1）。

2.2 JZHB对AS小鼠血脂、总胆汁酸、肝功能指标的影响

与空白组相比，模型组小鼠血清TC、TG、LDL-C、TBA、ALT、AST的含量升高，HDL-C含量降低（P<0.01）。与模型组相比，JZHB在不同剂量下对TC、TG和LDL-C水平均有改善（P<0.05），中、高剂量对HDL-C和TBA水平均有改善（P<0.05），但低剂量组对HDL-C、TBA的影响未见明显差异，中、高剂量组的降脂效果与阳性药组相近，JZHB降低AS小鼠血清中ALT、AST水平（P<0.05，图2）。

2.3 JZHB对AS小鼠主动脉转录组学测序及DEGs数据分析

本研究产生的可用性原始测序数据已存入NCBI生物技术信息中心：PRJNA1180738（SRA）。与空白组相比，模型组内基因上调2442个，下调941个，总体产生3383个DEGs的基因表达差异。与模型组相比，JZHB组的基因上调464个，下调515个，总体产生979个DEGs的基因表达差异。经JZHB干预后回调513个DEGs基因，在此基础上，采用加权基因共表达网络分析及聚类分析对回调基因划分为功能相关的共表达模块，结果显示，其与炎症反应、PPAR信号通路及其相关差异基因密切相关（图3）。

2.4 JZHB对AS小鼠主动脉转录组学测序数据富集分析

依托于513个回调DEGs，经基因富集分析，GO分析结果显示其生物学过程主要涵盖细胞过程的调节、生物过程的调控及代谢过程的调节等；KEGG通路的富集分析表明，与胆固醇代谢、PPAR信号通路及胰岛素调节等途径密切相关（图4）。

2.5 JZHB对AS小鼠肝脏、主动脉脂质含量的影响

与空白组相比，模型组小鼠肝脏、主动脉组织红染区域广泛分布，脂肪沉积病理面积增加（P<0.01）；与模型组相比，阿托伐他汀钙组小鼠肝脏、主动脉组织红染区域缩小，脂肪沉积面积减少（P<0.05），JZHB中、高剂量组改善（P<0.01），低剂量未见明显差异（图5）。

2.6 JZHB对AS小鼠肝脏、主动脉组织病理形态的影响

结合小鼠肝组织病理分级分布特点，与空白组相比，模型组肝脏呈显著大泡样脂肪病变，伴有脂质异常沉积、炎性细胞浸润等表现；与模型组相比，JZHB中、高剂量组与阳性药组肝脏脂肪变性明显减轻，脂质沉积减少，炎性细胞浸润减轻。HE染色显示，与空白组相比，模型组动脉内膜明显增厚，斑块增生明显，胆固醇结晶病变显著，管腔狭窄；与模型组相比，JZHB组与阳性组均有一定的改善，此外JZHB中、高剂量组在一定程度上改善斑块内泡沫化病变向胆固醇结晶病变的演变（图6）。

2.7 JZHB对AS小鼠肝脏PPARγ/LXRα/NF-κB信号通路、肠组织ABCG5/G8相关蛋白表达变化

与空白组比较，模型组肝组织中PPARγ、LXRα、ABCA1、ABCG1、CYP7A1蛋白表达降低（P<0.01）；与模型组相比，JZHB组PPARγ、LXRα、ABCA1、ABCG1、CYP7A1蛋白表达升高（P<0.05）。与空白组比较，模型组肝组织中p-p65/p65、IL-6、IL-1β蛋白表达升高（P<0.01）；与模型组相比，JZHB组p-p65/p65、IL-6、IL-1β蛋白表达降低（P<0.05，图7）。

与空白组比较，模型组小肠组织中ABCG5、ABCG8蛋白表达降低（P<0.01）；与模型组相比，JZHB组ABCG5、ABCG8蛋白表达升高（P<0.05，图8）。

2.8 JZHB对AS小鼠主动脉根免疫组化ICAM-1、VCAM-1蛋白表达变化

与空白组相比，模型组主动脉根斑块中ICAM-1、VCAM-1的蛋白表达升高（P<0.01）；JZHB干预后，除低剂量对ICAM-1未见明显表达差异，中、高剂量组降低了ICAM-1、VCAM-1的蛋白表达（P<0.05），且呈剂量依赖性（图9）。

3 讨论

目前临床上治疗AS主要采用的措施仍是他汀类药物，但接受他汀类药物治疗的患者在心血管事件导致的死亡风险上未有明显改善，同时他汀类药物长期、大量运用会带来肝肾损伤、横纹肌溶解等副作用，甚至增加肿瘤的风险。大柴胡汤为中医经典方剂，对糖脂代谢紊乱诱发的AS相关疾病临床效果显著^{［9， 10］}，本研究基于老中医临床经验方，以大柴胡汤为源，拓展叶天士“气经-血络”经典理论学说^{［11， 12］}，循经络之径，合气血之质，立足中医学复合证候观，以“湿热”为核心病机，以“三焦气化失司，湿热-痰瘀-络阻”为基本病理演变路径下，以“气血同治、上下分消、消瘀透热通络”为基本治则，以“调畅三焦，分消走泄”为核心治法的中医经典理论体系，循“气经－血络”人体路径下，顺疾病进退之势分消走泄湿热、痰浊、瘀血等病理产物，调畅三焦兼通血络，合以虫类药，佐以温通、润通之品开发JZHB辨治动脉粥样硬化斑块，临床应用效果显著。

JZHB中核心药味及其有效成分现代药理研究对于AS的预防和治疗已有诸多论述。柴胡核心活性成分柴胡皂苷可较好地改善肝脏及主动脉组织炎症、脂代谢水平，及减少ICAM-1和VCAM-1等因子表达，从而减少单核细胞对血管内皮细胞的黏附损伤，揭示其“肝主疏泄”视角下的科学内涵，从而防治AS^［13］。野黄芩素可阻断NF-κB和MAPK等炎性通路，减少血小板的黏附聚集， 调控胆固醇外流途径减轻巨噬细胞泡沫化^［14］。水蛭及其活性成分可较好改善血脂水平、抑制炎症反应、改善血流动力学及保护血管内皮损伤等诸多途径预防治疗AS^［15］。大黄及其活性成分大黄素、大黄酚具有显著抗炎、调控巨噬细胞极化、抑制巨噬细胞泡沫化、降低血脂、促进胆固醇逆向转运等作用 ^［16］。此外复方中白芍、牡蛎、干姜、白术、枳实等中药均具有一定的降脂、抗炎、改善AS及其斑块发生发展的药理活性。JZHB基于中医理论指导下组方配伍，是中医学“整体观念”核心思维下，体现协同增效、拓展中医药于当代疾病防治中的独特体现。

“初病湿热在经”路径下澄其源：通过转录组学测序分析发现JZHB与机体胆固醇代谢途径、炎症因子的调控高度相关。已知肝脏是机体胆固醇代谢及炎症反应调控中核心靶器官之一，其作为“中焦”气机升降及气血运行的枢纽，是全身糖脂代谢紊乱病起之源^［17］。已有研究表明胆固醇在肝脏代谢异常并诱发肝脏炎症级联反应激活，病理性胆固醇会随着血液循环沉积在动脉壁中，胆固醇在胞内过度蓄积，促进泡沫细胞的形成是动脉粥样硬化形成的重要标志，进而促使斑块形成的一系列进程^［18］。研究表明，胆固醇外排是将泡沫细胞中蓄积的胆固醇酯水解为游离胆固醇后，通过扩散或膜转运体介导的方式将游离胆固醇外排到胞外的过程，机体外排的胆固醇会通过胆固醇逆向转运至肝脏完成降解^［19］。遂胆固醇逆向转运途径已然成为治疗动脉粥样硬化及药物研发的重要方向。

PPARγ来源于PPAR核受体超家族，其可加强肝脏对脂质等代谢产物的摄取和存储，是介导胆固醇从细胞内流向细胞外的关键受体^［20］。研究表明^{［21，22］}，其表达激活可上调下游肝X受体关键的核受体转录因子LXRα，进而影响ABC转运蛋白超家族成员ABCA1、ABCG1的表达上调，ABCA1、ABCG1其在胆固醇外排中发挥着重要的协同作用，调节细胞内游离胆固醇的外流，在机体代谢异常时，可抑制LXRα的表达，同时受LXRα调控的CYP7A1也会被抑制表达，从而导致TC分解或合成胆汁酸的过程受到阻碍，加重脂质代谢紊乱，这些关键蛋白的协同调控，是肝脏胆固醇逆向转运完成的重要节点；此外PPARγ与视黄醇 X 受体形成异源二聚体调控LXRα的表达亦是改善肝脏炎症反应的关键节点，其表达抑制会诱导NF-κB通路的激活，诱发炎症因子级联反应，加重肝脏脂肪病变及炎症水平，加快AS进程。值得注意的是，胆固醇逆转运途径中肠肝循环也是重要的环节之一，高脂饮食可下调ABCG5/G8基因在小肠组织上的表达，ABCG5/G8表达激活可导致肠内胆固醇吸收减少，肝脏、肠道共同参与影响着机体胆固醇摄取、代谢，调控RCT途径功能的执行。湿热、痰浊、瘀血等病理产物与机体脂质代谢、炎症细胞因子水平关系密切，中焦为气机升降之枢，肝失疏泄，中焦气化失司延及三焦，三焦气化能力减弱，“阳化气”受损，湿热痰浊病理产物弥漫三焦，上述病理过程与中医“气经-血络”理论指导下，以“湿热”为核心病机，“初病湿热在经” 路径下的病理演变高度相似。《素问·六元正纪大论篇》中曰“必折其郁气，资其化源，赞其运气，无使邪胜”。基于已有研究基础，本文通过体内实验进一步研究发现，JZHB可改善AS小鼠血脂异常、总胆汁酸代谢，减轻肝脏脂质沉积及炎症损伤，促进肠道内脂质外排过程，并通过转录组学测序联合动物实验发现其核心机制通过调控PPARγ/ LXRα/ NF-κB信号通路，改善肝脏胆固醇逆向转运及炎性水平，体现其分消走泄中焦湿热，阻断“初病湿热在经”路径下AS斑块的病理演变进程之效。

“久则血伤入络”路径下截其流：在“木郁土壅”的病理状态下，中焦气化失司延及三焦，三焦气化能力减弱，“阳化气受损”，脂质不能有效流通、脂质堆积形成“痰浊”，湿热痰浊病理产物弥漫三焦，诱导全身血管内皮广泛受损，脂肪异常沉积在受损的广泛血管内皮下，膏浊沉积，阻塞脉道，日久延及血络，“阴成形”，致AS血管内斑块形成与发展，由气入血一定之理也，体现了JZHB于中医经典指导下，多层协同调控AS预防及治疗的创新路径^{［23， 24］}。已知作为黏附分子免疫球蛋白家族成员的ICAM-1和VCAM-1，是评估AS血管损伤的核心靶标分子^{［25， 26］}。当肝脏胆固醇及脂质代谢异常情况下，通过血液循环微环境传递，动脉血管内皮细胞中ICAM-1、VCAM-1表达增加，进而促使单核细胞黏附动脉管壁，进一步迁移及分化为成熟的巨噬细胞，同时增加LDL的氧化修饰，加重损伤的血管内皮脂质沉积、巨噬细胞泡沫化、炎性细胞浸、血管平滑肌细胞增生的病变反馈循环，导致血管壁局部粥样斑块进一步形成及加重^{［27， 28］}。本研究发现JZHB可改善主动脉组织脂肪变性及脂质沉积，降低炎性浸润，改善斑块面积及斑块内泡沫化向胆固醇结晶转变的病理进程，并且可调控主动脉内皮下及斑块内ICAM-1、VCAM-1蛋白表达。这表明JZHB既可调控“初病湿热在经”路径下肝脏胆固醇逆转运途径及炎症级联反应的病理损伤，又可截断“久则血伤入络”路径下AS血管的脂质沉积损伤及斑块的形成及进展。此外，本研究表明降脂化斑可改善巨噬细胞相关促炎因子的表达水平，在一定程度上降低三焦路径上湿热、痰瘀等病理产物的传递，提示复方是否可改善血管内皮下斑块内巨噬细胞的吞噬功能和极化水平，巨噬细胞极化重塑直接影响斑块的炎症状态、胆固醇代谢及纤维帽稳定性，本研究针对此部分的论证尚存不足，亦是未来对复方药效机制进一步研究的方向。

综上所述，本研究利用高脂饮食联合ApoE^-/-基因敲除小鼠建立经典AS模式动物，ApoE基因缺失导致胆固醇清除障碍，脂质代谢紊乱，联合高脂饲料（肥甘厚味）饮食，中焦脾胃损伤，脾失健运，三焦气化失司，“湿热-痰淤-络阻”病理产物次第产生，模型动物病理表现与中医“气经-血络”微观病理演变规律高度吻合。在此基础上，应用JZHB干预，通过一般情况评估，血清生化、病理学检测考察其安全性及有效性；应用转录组学测序技术分析其药效核心分子机制，结合分子生物学技术验证其核心机制之一为调控PPARγ/ LXRα/ NF-κB信号通路关键蛋白的表达变化，改善肝脏胆固醇逆向转运途径及炎症信号通路，改善AS血管的损伤及斑块的形成。本研究旨在建立复方疗效核心分子机制，揭示中药药效学基础和靶器官分子效应，丰富“气经-血络”立法组方的现代科学内涵，为进一步拓展复方中核心药味组方规律研究，及AS临床安全有效天然药物研发提供科学依据及理论基础。

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基金资助

浙江中医药大学校级科研项目(2023RCZXZK12)

浙江省中医药科技计划项目(2025ZR106)

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