桑麻止咳方改善感染后咳嗽大鼠气道炎症和敏感性：基于TRPV1-SP/CGRP和细胞焦亡途径

Sangma Zhike Formula alleviates airway inflammation and hyperresponsiveness in rats with postinfectious cough by inhibiting the TRPV1-SP/CGRP and pyroptosis pathways

摘要

目的 探讨桑麻止咳方（SMZKF）对感染后咳嗽（PIC）大鼠咳嗽敏感性和气道炎症的改善作用及其机制。 方法 SD雄性大鼠随机分为对照组，模型组，SMZKF低、中、高剂量组，复方甲氧那明组（ASM），8只/组。除对照组外，其余大鼠采用烟熏+鼻滴脂多糖+辣椒素雾化构PIC大鼠模型，第19天开始灌胃SMZKF和复方甲氧那明，连续10 d。分析各组大鼠行为学状态、咳嗽敏感性、肺组织病理、肺泡灌洗液（BALF）炎性细胞计数和炎性因子/介质、肺组织氧化应激以及咳嗽敏感性和细胞焦亡相关蛋白的表达。 结果 与对照组比较，模型组大鼠精神欠佳，呼吸加快，出现明显咳嗽、打喷嚏、抓脸等表现；咳嗽潜伏期明显缩短，5 min咳嗽次数增加；肺泡结构消失，肺泡隔增宽，支气管及支气管周围有大量炎性细胞浸润，支气管周围和肺泡炎症评分明显升高；BALF中炎性细胞计数和炎性因子/介质IL-1β、TNF-α、IL-6、COX-2、PGE-2、TXA-2均升高；肺组织ROS、MDA、MPO升高；肺组织咳嗽高敏感性相关蛋白TRPV1、SP、CGRP、NK1R和细胞焦亡相关蛋白P-NF-κB、NLRP3、ACS、cleaved-caspase-1、cleaved-IL-1β和GSDMD-N表达升高（P<0.05）。与模型组比较，SMZKF能改善各项指标的病理改变（P<0.05），且SMZKF高剂量与复方甲氧那明干预效果的差异无统计学意义（P>0.05）。 结论 SMZKF能有效改善PIC模型大鼠咳嗽敏感性和气道炎症，其作用机制与抑制TRPV1介导的SP/NK1R与CGRP释放和细胞焦亡途径密切相关。

Abstract

Objective To investigate the therapeutic mechanism of Sangma Zhike Formula (SMZKF) for relieving cough sensitivity and airway inflammation in rats with postinfectious cough (PIC). Methods Male SD rat models were established by cigarette smoke exposure with intranasal LPS instillation and capsaicin aerosol inhalation. From day 19 following the start of PIC modeling, the rats received daily treatment with saline (model group), low-, medium-, and high-dose SMZKF, and compound methoxyphenamine (ASM) via gavage for 10 consecutive days (n=8). The assessments included behavioral changes, cough sensitivity (latency and frequency), lung histopathology, inflammatory cell counts and cytokine/mediator levels in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF), oxidative stress markers in the lung tissue, and expressions of proteins related with cough hypersensitivity and pyroptosis. Results The rat models of PIC exhibited reduced mental alertness, accelerated respiration, and pronounced symptoms such as coughing, sneezing, and facial scratching with significantly shortened cough latency and increased 5-min cough frequency. Histopathological analysis revealed collapsed alveolar structures, thickened alveolar septa, and extensive inflammatory cell infiltration in the bronchi and peribronchial regions, accompanied by elevated bronchial and alveolar inflammation scores of the rat models. In the BALF, inflammatory cell counts and the levels of IL-1β, TNF-α, IL-6, COX-2, PGE-2, and TXA-2 were all markedly elevated, and the pulmonary oxidative stress markers (ROS and MDA) and myeloperoxidase (MPO) activity were also significantly increased. The pulmonary expressions of cough hypersensitivity-related proteins (TRPV1, SP, CGRP, and NK1R) and pyroptosis-associated markers (P-NF-κB, NLRP3, ACS, cleaved caspase-1, cleaved IL-1β, and GSDMD-N) were significantly upregulated in the model group. SMZKF interventions significantly ameliorated these pathological changes in the rat models, and high-dose SMZKF produced a similar therapeutic efficacy to that of ASM. Conclusion SMZKF alleviates cough sensitivity and airway inflammation in PIC rats possibly by inhibiting TRPV1-mediated SP/NK1R signaling and the NLRP3/caspase-1/GSDMD pyroptosis pathway.

Graphical abstract

关键词

感染后咳嗽 / 桑麻止咳方 / 咳嗽敏感性 / 气道炎症 / 机制

Key words

postinfectious cough / Sangma Zhike Formula / cough sensitivity / airway inflammation / mechanism

感染后咳嗽（PIC）是上呼吸道感染后，感染本身急性期症状消失，胸部X线检查无异常，咳嗽仍然迁延不愈的一种常见呼吸系统疾病；临床主要表现为持续3~8周的刺激性干咳和咽部不适，或伴有少量白色黏液痰，通常由病毒、细菌、支原体等因素诱发^［1］。研究表明，上呼吸道感染病史患者中11%~25%的患者会发生PIC^［2］，长期咳嗽的患者中约有39.4%属于PIC^［3］，PIC是儿童慢性咳嗽的第3位病因^［4］。特别是新型冠状病毒疫情暴发后，我国呼吸系统感染性病原谱发生了较大变迁，PIC有增多趋势^［5］，流感病毒的流行也造成PIC发病率再增^［6］。目前，PIC尚无特异性治疗方法，临床多采用镇咳、抗组胺、抗炎和减充血等药物进行对症治疗^［7］，但容易产生嗜睡、口干、食欲不振等副作用，且停药后易复发。因此，迫切需要副作用较少的有效药物来治疗PIC。此外，PIC的发病机制尚不完全明确，多数学者认为其发病机制与气道敏感性和气道炎症密切相关^［8］。瞬时受体电位香草素亚型1（TRPV1）-P物质（SP）/降钙素基因相关肽（CGRP）和细胞焦亡是调控气道敏感性和气道炎症的核心机制，可能是有效治疗PIC的重要途径^［9］。

PIC属于中医学“久咳”“顽咳”范畴，风邪伏肺，风动气逆，或兼有痰、热邪气，肺壅气逆是其核心病机^［10］。桑麻止咳方（SMZKF）是临床治疗PIC的效验方，具有祛风散邪，宣肺利咽止咳之效，但作用机制尚不明确。本研究通过烟熏+脂多糖（LPS）鼻滴+辣椒素雾化构建PIC大鼠模型，以TRPV1介导的SP/CGRP分泌和细胞焦亡为切入点，观察SMZKF对PIC模型大鼠咳嗽敏感性和气道炎症的影响，并初步探讨其作用机制，为该方防治PIC提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

SPF级SD大鼠（180~200 g）购自浙江维通利华实验动物技术有限公司，实验动物合格证：SCXK（浙）2024-0001，饲养于标准动物房，室温22~23 ℃，相对湿度50%~60%，自然光照周期，自由进食、饮水。所有实验均按照《美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南》执行，研究方案经安徽中医药大学实验动物伦理委员会批准（伦理批号：AHUCM-rats-2024198）。

1.1.2 实验药物

SMZKF由桑叶10 g，炙麻黄8 g，金沸草10 g，蜜白前10 g，紫苏子10 g，枇杷叶10 g，牛蒡子10 g，浙贝母10 g，玄参10 g，僵蚕10 g，桔梗10 g，炙甘草6 g组成，所有药材购于安徽中医药大学第一附属医院，在1.14 L蒸馏水（1/10，m/V）中浸泡60 min，大火煮沸后，慢火煎煮90 min。后将提取液通过4层纱布过滤，残渣浸泡于0.912 L（1/8，m/V）蒸馏水中，大火煮沸后，慢火煎煮40 min，通过再次过滤，合并2次煎煮液进行浓缩，4 ℃保存备用。复方甲氧那明胶囊（江苏汉景药业有限公司，国药准字号：H20033669）。

1.1.3 主要试剂与仪器

LPS（SIGMA），苏木素染液、醇溶伊红染液（ebiogo），大鼠白细胞介素-1β（IL-1β）ELISA试剂盒、大鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）ELISA试剂盒、大鼠IL-6 ELISA试剂盒、大鼠环氧化酶-2（COX-2）试剂盒、大鼠前列腺素E2（PGE2）试剂盒、大鼠血栓素A2（TXA2）试剂盒（武汉基因美），丙二醛（MDA）测试试剂盒、髓过氧化物酶（MPO）测试试剂盒（南京建成），活性氧（ROS）检测试剂盒（碧云天），PVDF膜（Millipore），PBS缓冲液粉末（Zs-BIO），预染蛋白Marker（Thermo），western快速转膜液（Beyotime），ECL超敏发光试剂盒（Biosharp），山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG、GAPDH（Zsbio），磷酸化核因子κB（P-NF‑κB）（ImmunoWay.Biotechnology），NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）（Abcam），凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、剪切型胱天蛋白酶-1（cleaved-caspase-1）（Affinity），切割膜穿孔蛋白 N端结构域（GSDMD-N）（Santa Cruz），cleaved-IL-1β（Wanleibio）。SP（Abcam）、TRPV1（Bioworld）、神经激肽-1受体（NK-1R）（Bioss）、CGRP（Santa Cruz）。

酶标仪（雷杜），紫外可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司），离心机（安徽嘉文），漩涡混合器（其林贝尔仪器制造公司），电热恒温箱（上海三发），电泳仪及电泳槽（Tanon）、转膜仪（Tanon），自动曝光仪（上海培清科技有限公司），细胞计数仪（Countstar）。

1.2 研究方法

1.2.1 造模与分组给药

随机将所有SD大鼠分为对照组，模型组，SMZKF低、中、高剂量组，复方甲氧那明组（ASM），8只/组。除对照组外，其余大鼠采用联合烟熏+LPS滴鼻+辣椒素雾化制备PIC大鼠模型^［11］。第1~10天采用烟熏建立气道高反应性，将大鼠放入烟熏箱，用50 g锯末+5支香烟点燃烟熏，30 min/次，2次/d。实验第11、14、17天异氟烷麻醉大鼠，并以1 μL/g的体积在大鼠鼻腔滴入0.4 mg/mL的LPS溶液，1次/d；实验第12、13、15、16、18天，将大鼠放入密闭容器中，用0.1 mmol/L的辣椒素溶液雾化吸入诱咳，1次/d。造模第18天对造模大鼠行辣椒素咳嗽激发试验，若大鼠出现咳嗽、呼吸加快，脚前伸、颈前伸、腹肌收缩等特征性体征，且3 min内咳嗽多于10次，提示造模成功。第19天开始灌胃给药，根据人和动物按表面积折算的等效剂量比率表计算。对照组、模型组给予生理盐水，灌胃10 mL/kg，1次/d；SMZKF低剂量5.03 g/kg，中剂量10.06 g/kg，高剂量20.13 g/kg，1次/d；ASM组予复方甲氧那明胶囊，24.63 mg/kg，1次/d，共10 d。10 d后大鼠安乐死，分别采集肺泡灌洗液（BALF）、腹主动脉血、肺组织等标本进行相关检测（图1）。

1.2.2 大鼠行为学和咳嗽敏感性观察

观察记录一般状态和行为学特征。末次给药1 h后，运用辣椒素雾化激发诱导咳嗽3 min，观察记录大鼠的咳嗽潜伏期及5 min内咳嗽次数（大鼠咳嗽特征性动作：呼吸加快、伸颈、伸前脚、张口、腹部收缩等）^［9］。

1.2.3 HE染色观察肺组织病理形态

取相同位置大鼠肺组织，4%中性多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，进行HE染色，中性树胶封固。然后在光镜下进行组织病理形态学观察并进行分析。参考相关文献对支气管周围炎症^{［12， 13］}和肺泡炎症^［8］进行评分。支气管周围炎症评分如下：无炎症反应，0分；偶有炎性细胞浸润，1分；大部分支气管周围有薄层炎性细胞（2~5细胞厚度），2分；大部分支气管和血管周围有厚层炎性细胞（>5细胞厚度），3分。肺泡炎症评分如下：正常细胞0分；少量炎性细胞浸润，1分；炎性细胞环1层细胞深，2分；炎性细胞环2~4层细胞深，3分；炎性细胞环>4层细胞深，4分。

1.2.4 BALF炎性细胞计数

取大鼠BALF，4 ℃条件下3000 r/min离心10 min （r=16 cm）收集BALF中的细胞，然后将其重悬于磷酸盐缓冲液（PBS）中混匀后进行细胞计数。然后吸取10 μL细胞悬进行涂片，干燥后，将载玻片置于甲醇固定，保存细胞形态。固定后，将载玻片浸入稀释的吉姆萨染液中染色，去除多余的染料后自然风干，根据形态学标准，在显微镜下进行细胞计数，计算各类细胞所占百分比后乘以细胞总数即获得各类炎性细胞计数。

1.2.5 大鼠BALF炎症因子和致咳因子的含量评价

待测的大鼠BALF，4 ℃条件下4000 r/min离心10 min取上清，按照试剂盒说明书的操作步骤进行加样，测量检测BALF中炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α和炎症介质COX-2、PGE2、TXA2的含量。

1.2.6 大鼠肺组织氧化应激指标检测

取各组大鼠小块组织研磨成单细胞悬液，加入浓度为10 μmol/L DCFH-DA 500 μL，37 ℃孵育20 min，使探针和细胞充分作用。PBS洗去未进入细胞内的DCFH-DA，上流式细胞仪检测ROS表达强度。其次取适量保存的肺组织，制备组织匀浆后，分别严格按试剂盒要求进行样本检测准备，测定各组大鼠肺组织MDA和MPO水平。

1.2.7 Western blotting检测大鼠肺组织中咳嗽敏感性相关蛋白表达

提取各组大鼠肺组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，蛋白变性后，经电泳、转移、封闭、抗体孵育［抗体稀释比例分别为SP（1∶1000）、TRPV1（1∶1000）、NK-1R（1∶1000）、CGRP（1∶1000）、P-NF-κB（1∶2000）、NLRP3（1∶1000）、ASC（1∶1000）、cleaved-caspase-1（1∶500）、GSDMD-N（1∶500）、cleaved-IL-1β（1∶500）、GAPDH（1∶2000）］、洗膜，ECL发光分别检测肺组织气道敏感性相关蛋白TRPV1、SP、CGRP、NK1R和细胞焦亡相关蛋白P-NF-κB、NLRP3、ASC、cleaved-caspase-1、GSDMD-N、cleaved-IL-1β的表达，使用Image J软件进行半定量分析。

1.3 统计学分析

使用SPSS 27.0进行统计学分析。数据若符合正态分布，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用ANOVA分析；非正态分布数据多组比较采用Kruskal-Wallis分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况与咳嗽敏感性评价

对照组大鼠精神状态佳，皮毛顺滑光泽，进食正常，呼吸均匀。造模后各组大鼠精神欠佳，毛发凌乱光泽减少，进食减少，呼吸加快，辣椒素雾化刺激后，出现明显咳嗽特征、打喷嚏、抓脸、呼吸加快等表现，经药物治疗后各组大鼠均有不同程度改善。与对照组比较，模型组大鼠咳嗽潜伏期缩短，5 min咳嗽次数增加（P<0.05），提示模型构建成功。与模型组相比，SMZKF低剂量、中剂量、高剂量组均可延长咳嗽潜伏期和降低5 min咳嗽次数，呈现一定的剂量依赖性（P<0.05），且SMZKF高剂量与复方甲氧那明干预效果差异无统计学意义（P>0.05，图2）。

2.2 肺组织病理学观察

对照组大鼠肺组织肺泡结构清晰，间隔正常，炎症细胞浸润较少，病理表现基本正常；模型组大鼠肺泡结构消失，肺泡隔增宽，支气管及支气管周围有大量炎性细胞浸润（图3A）。与模型组相比，SMZKF低、中、高剂量组和ASM组肺组织病理表现均有不同程度的改善，且SMZKF的改善作用呈一定的剂量依赖性，SMZKF高剂量组与ASM组作用效果接近。模型组大鼠支气管周围和肺泡炎症评分升高（P<0.05），与模型组相比，SMZKF低、中、高剂量组均可降低大鼠支气管周围和肺泡炎症评分，呈现一定的剂量依赖性（P<0.05），且SMZKF高剂量与复方甲氧那明干预效果差异无统计学意义（P>0.05，图3B、C）。

2.3 BALF炎性细胞计数比较

与对照组相比，模型组大鼠BALF中WBC、LYM、NEU、MON和EOS细胞计数升高（P<0.05）；与模型组比较，SMZKF低、中、高剂量组均可降低BALF中WBC、LYM、NEU和EOS细胞计数，呈现一定的剂量依赖性（P<0.05），且SMZKF高剂量与复方甲氧那明干预效果差异无统计学意义（P>0.05，图4）。

2.4 BALF炎症因子和炎症介质评价

与对照组相比，模型组大鼠BALF中IL-1β、TNF-α、IL-6、COX-2、PGE-2、TXA-2均升高（P<0.05）；与模型组比较，SMZKF低、中、高剂量组均可降低BALF中IL-1β、TNF-α、IL-6、COX-2、PGE-2、TXA-2（P<0.05），呈现一定的剂量依赖性，且SMZKF高剂量与复方甲氧那明干预效果差异无统计学意义（P>0.05，图5）。

2.5 对肺组织氧化应激指标的影响

与对照组相比，模型组大鼠肺组织中ROS、MDA和MPO均升高，差异具有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，SMZKF低、中、高剂量组肺组织ROS、MDA和MPO表达均明显降低（P<0.05），呈现一定的剂量依赖性，且SMZKF高剂量与复方甲氧那明干预效果差异无统计学意义（P>0.05，图6）。

2.6 对气道敏感性相关蛋白的影响

与对照组相比，模型组大鼠肺组织TRPV1、SP、CGRP和NK1R蛋白表达升高（P<0.05）；与模型组比较，SMZKF低、中、高剂量组肺组织TRPV1、SP、CGRP和NK1R蛋白表达均降低，呈现一定的剂量依赖性（P<0.05），且SMZKF高剂量与复方甲氧那明干预效果差异无统计学意义（P>0.05，图7）。

2.7 对细胞焦亡相关蛋白的影响

与对照组相比，模型组大鼠肺组织P-NF‑κB、NLRP3、ACS、cleaved-caspase-1、cleaved-IL-1β和GSDMD-N蛋白表达升高（P<0.05）；与模型组比较，SMZKF低、中、高剂量组肺组织P-NF‑κB、NLRP3、ACS、cleaved-caspase-1、cleaved-IL-1β和GSDMD-N蛋白表达均降低，呈现一定的剂量依赖性（P<0.05），且SMZKF高剂量与复方甲氧那明干预效果差异无统计学意义（P>0.05，图8）。

3 讨论

PIC发病机制复杂，涉及多因素交互作用，气道炎症与气道敏感性是PIC的核心发病机制^［14］。如何抑制PIC气道敏感性和气道炎症是PIC临床治疗需突破的瓶颈，亦是临床PIC防治的重要途径。TRPV1介导的SP/NK1R与CGRP释放和NLRP3/caspase-1/IL‑1β介导的细胞焦亡分别是PIC咳嗽敏感性和气道炎症的重要信号通路，备受关注。本研究以此为切入点，探讨SMZKF改善PIC的作用机制。中医认为风邪是PIC的重要发病因素。风邪犯肺，肺失宣肃，肺壅气逆作咳，或肺壅气滞生热，热壅阴伤气逆，气道滞涩而咳嗽，或外风引动伏邪，痰热内蕴则咳嗽频发是其病机^［10］，SMZKF由桑叶、炙麻黄、金沸草、蜜白前等12味中药组成，共奏祛风散邪，宣肺利咽止咳之效，高度契合PIC“风邪伏肺，肺壅气逆”的核心病机，是治疗PIC等慢性、亚急性咳嗽的临床效验方，无论是治疗风寒咳还是风热咳，咳嗽有痰还是咳嗽无痰，SMZKF均有良好的治疗效果，能有效降低PIC患者咳嗽程度和咳嗽敏感性。本研究不仅证实了SMZKF能改善PIC大鼠的气道敏感性和气道炎症，还揭示了其通过调控TRPV1-SP/CGRP和细胞焦亡途径发挥抗PIC作用。

免疫细胞释放的细胞因子激活TRPV1使周围神经末梢敏感性增高，气道感觉神经的过度激活和过敏化从而导致潜在的组织损伤和咳嗽超敏反应。病原体感染呼吸道后，激活免疫细胞，释放大量细胞因子损伤气道黏膜上皮，破坏气道屏障功能，气道黏膜通透性升高，容易受到冷空气等外界刺激而发生咳嗽。同时，感染后炎症细胞因子分泌失衡，导致气道神经源性炎症和气道高敏感性持续存在于PIC病程中，进而导致咳嗽反复^［15］。COX2、PGE2、TXA2是与气道炎症密切相关的致咳因子，PIC发病过程中会明显升高^［16］。炎症诱导型环氧合酶COX-2可通过促花生四烯酸代谢，衍生PGE2、TXA2从而加重炎症反应^［17］。其中PGE2一方面可以直接刺激肺部无髓鞘感觉C纤维诱发咳嗽^［18］，亦能降低TRPV1通道激活阈值，增强辣椒素等刺激物诱发的咳嗽反射，与PIC的发生密切相关^［19］。TXA2则是通过结合气道平滑肌细胞上的TP受体，引发细胞内钙离子浓度骤升，导致支气管强烈收缩和显著增强气道感觉神经对刺激性物质（如辣椒素、缓激肽）的敏感性^［20］。此外TXA2亦能通过NOX依赖性途径促进ROS表达加重炎症表达^［21］。本研究中模型组大鼠咳嗽潜伏期明显缩短，5 min咳嗽次数明显增加，且BALF中LYM、NEU、MON和EOS等炎性细胞计数、炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α以及致咳因子PGE2、TXA2、COX-2均升高，同时肺组织炎性浸润明显，符合PIC的典型病理特征，模型构建成功。SMZKF治疗后上述炎症指标均改善，且SMZKF-H组效果与ASM组类似。说明SMZKF改善PIC气道炎症病理改变的效果确切可靠，探索其相关机制具有重要意义。

TRPV1是辣椒素的主要作用靶点，亦是是首个被证实能介导咳嗽反射的瞬时受体电位（TRP）通道，同时也是神经源性炎症的关键因素，它可以感知温度、炎症因子和辣椒素等刺激，激活咳嗽感受器^［22］。TRPV1广泛分布于气道感觉神经末梢，其激活诱导的气道神经源性炎症和咳嗽敏感性增高是PIC发病的重要机理之一^［23］。其作用机制是促进感觉神经末梢Ca²⁺内流，然后触发SP、CGRP等神经肽释放，介导神经源性炎症，放大气道炎症反应^［24］。CGRP和SP是气道神经源性炎症和气道高反应的重要神经内分泌肽，CGRP与SP共释放，通过受体介导扩张气道血管，增强炎症细胞浸润、协同促进神经源性炎症、激活气道感觉神经元，致使气道高反应性，表现为支气管收缩、黏液分泌增加^［25］。SP作用于速激肽NK1R受体，从而导致气道平滑肌收缩、血管通透性增加，募集中性粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞，加重气道炎症和支气管上皮的破坏、支气管收缩，增加气道敏感性及高反应性^{［26， 27］}。TRPV1介导的神经肽SP和CGRP释放可进一步激活NF-κB通路释放IL-6、TNF-α等促炎因子，并正反馈上调TRPV1表达，从而形成“神经肽-TRPV1”交叉致敏^{［28， 29］}，这可能是长期气道高反应性的重要机制，亦是治疗感染后咳嗽和慢性气道疾病的重要策略。复方甲氧那明是《咳嗽的诊断与治疗指南（2015）》推荐用于PIC治疗的推荐药物^［30］，由盐酸甲氧那明、那可丁、氨茶碱、氯苯那敏组成，具有抑制支气管痉挛咳嗽和气道高敏感性的功效，本研究选其作为对照药物。本研究表明，与对照组大鼠相比，模型组大鼠BALF中COX-2、PGE2、TXA2升高，肺组织TRPV1、SP、CGRP和NK1R蛋白表达均升高。同时SMZKF和复方甲氧那明均能够有效改善上述指标。表明气道神经源性炎症与PIC病理密切相关，SMZKF改善PIC的作用机制与抑制TRPV1介导的SP/NK1R与CGRP释放密切相关。

细胞焦亡是一种新型的程序性细胞死亡模式，其特征是细胞裂解和促炎细胞因子释放，NLRP3炎性小体介导的Caspase-1激活是细胞的典型途径^［31］。研究表明，气道炎症与细胞焦亡关系密切，受到越来越多研究的关注。细胞焦亡可导致肺组织和气道损伤，上皮细胞修复障碍、气道高反应性和粘液分泌过多^［32］。细胞焦亡的机制主要受ACS、GSDMD-N、cleaved-IL-1β、cleaved-caspase-1、NLRP3等蛋白调控^［33］。氧化应激是肺组织损伤过程中诱导细胞焦亡的重要致病环节。ROS是NLRP3炎症小体的激活的重要物质，可诱导机体氧化应激和炎症反应导致细胞焦亡^［34］。MDA是脂质过氧化标志，反映焦亡过程中氧化应激的副产物，可能通过破坏膜结构加剧细胞破裂^［35］。MPO则通过中性粒细胞介导氧化应激放大组织炎性损伤^［36］。通常NLRP3炎性小体激活过程中有两个信号，一是LPS通过模式识别受体诱导NF-κB依赖性促炎细胞因子转录和NLRP3 mRNA表达增加；另外则是各种刺激诱导NLRP3炎性小体组装、caspase-1切割和促炎细胞因子的产生^［37］。NLRP3蛋白激活与接头蛋白ASC形成多聚复合体，后者通过CARD结构域结合Pro-Caspase-1并促使其自剪切生成活性形式的Cleaved-Caspase-1^［38］。Cleaved-caspase-1特异性切割GSDMD，释放其N端片段GSDMD-N。该片段寡聚化后在细胞膜上形成10~15 nm孔道，导致细胞渗透压失衡、肿胀破裂^［39］。Cleaved-caspase-1同时剪切pro-IL-1β生成活性形式的cleaved-IL-1β，并通过GSDMD-N孔道释放至胞外，招募炎症细胞放大炎症反应^［40］。研究表明IL-1β影响气道平滑肌的收缩和松弛，在气道高反应中起重要作用，抑制NLRP3炎性小体可以减少气道高反应和气道炎症，同时降低IL-1β、IgE和Th2相关细胞因子的水平^［41］。本研究发现模型组大鼠肺组织P-NF-κB、NLRP3、ACS、cleaved-caspase-1、cleaved-IL-1β和GSDMD-N蛋白表达升高，说明PIC气道炎症的发生机制与细胞焦亡关系密切；与模型组比较，SMZKF各给药组P-NF-κB、NLRP3、ACS、cleaved-caspase-1、cleaved-IL-1β和GSDMD-N表达明显下降，SMZKF-H组作用效果与ASM组结果类似，说明SMZKF治疗PIC的作用机制与调控NF-κB和NLRP3/caspase-1/IL-1β介导细胞焦亡密切相关。

综上所述，SMZKF可通过抑制TRPV1介导的SP/NK1R与CGRP释放和细胞焦亡来改善PIC大鼠气道神经源性炎症、降低咳嗽敏感性和气道炎症，证实了SQTSF防治PIC的科学性，初步揭示了SQTSF作用的的潜在分子机制。

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基金资助

国家自然科学基金联合重点项目(U20A20398)

国家自然科学基金(82374399)

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