橙皮素通过调控AMPK/NLRP3通路减轻阿霉素诱导的小鼠心肌毒性

Hesperetin alleviates doxorubicin-induced cardiotoxicity by regulating the AMPK/NLRP3 pathway

摘要

目的 探讨橙皮素（Hes）通过调控AMP依赖的蛋白激酶（AMPK）/NOD热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）信号减轻炎症反应改善阿霉素（DOX）诱导的心肌损伤。 方法 采用DOX处理C57/bl6小鼠和H9c2细胞，并随机分为：对照组/假手术组、DOX处理组、Hes干预DOX组（DOX+Hes）以及Hes联合AMPK抑制剂Compound C干预DOX组（DOX+Hes+CC）。观察细胞形态变化，采用CCK-8法检测细胞活力，超声检测心脏功能，ELISA法检测培养基和心肌组织中LDH活性，TUNEL染色法检测细胞凋亡，RT-PCR检测TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平，Western blotting法检测cleaved caspase-3、Bcl2、Bax、IL-1β、IL-18、p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR、NLRP3、ASC和caspase-1的表达。 结果 与对照组相比，DOX组细胞肿胀，活力降低，培养基中LDH活性增加（P<0.01）；cleaved caspase-3表达和TUNEL染色阳性细胞数增加，Bcl2/Bax比值降低（P<0.01）。与假手术组相比，DOX组心肌纤维肿胀并出现炎性浸润，心脏功能降低，LDH活性增加；同时TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平以及IL-1β和IL-18的蛋白表达增加（P<0.01），p-AMPK和p-mTOR蛋白表达降低，NLRP3、ASC和caspase-1的表达增加（P<0.01）。与DOX组相比，DOX+Hes组细胞肿胀减轻，活力增加，培养基中LDH活性降低（P<0.01）；cleaved caspase-3表达和TUNEL染色阳性细胞数减少，Bcl2/Bax比值增加（P<0.01）；TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平以及IL-1β和IL-18的蛋白表达降低（P<0.01）；p-AMPK和p-mTOR蛋白表达增加，NLRP3、ASC和caspase-1的表达降低（P<0.01）。与DOX+Hes组相比，Compound C可以阻断Hes对DOX诱导的细胞损伤、心脏功能、炎症反应和AMPK/NLRP3通路的作用。 结论 Hes通过调控AMPK/NLRP3通路抑制炎症反应减轻DOX诱导的心脏毒性。

Abstract

Objective To verify whether hesperetin (Hes) alleviates doxorubicin (DOX)-induced cardiotoxicity by reducing inflammation via regulating the AMPK/NLRP3 pathway. Methods C57/bl6 mice and H9c2 cells treated with DOX to mimic cardiotoxicity were randomly divided into Sham (or control) group, DOX group, DOX+Hes group, DOX+Hes+compound C (CC, an AMPK inhibitor) group. Cardiac function and myocardial pathologies of the mice were evaluated, and the changes in H9c2 cell morphology and viability were assessed. Lactate dehydrogenase (LDH) activity in mouse myocardial tissues and H9c2 cells was measured using ELISA, and H9c2 cell apoptosis was detected with TUNEL staining. In both H9c2 cells and the myocardial tissues of the mice, cellular expression levels of TNF-α, IL-6 and IL-1β mRNAs and cleaved caspase-3, Bcl2, Bax, IL-1β, IL-18, p-AMPK, AMPK, p-mTOR, mTOR, NLRP3, ASC and caspase-1 proteins were detected using RT-PCR and Western blotting. Results DOX treatment caused cell swelling, decreased cell viability and increased LDH activity in H9c2 cells, resulting also in significantly increased cell apoptosis and cleaved caspase-3 expression and decreased Bcl2/Bax ratio. The DOX-treated mice showed obvious myocardial fiber swelling and inflammatory infiltration, decreased cardiac function and significantly increased myocardial LDH activity. In H9c2 cells, DOX treatment significantly increased the mRNA expressions of TNF-α, IL-6 and IL-1β and protein expressions of IL-1β and IL-18, lowered the expressions of p-AMPK and p-mTOR, and increased the expressions of NLRP3, ASC and caspase-1. Hes treatment obviously reduced these toxic effects of DOX in H9c2 cells, but its protective effects were blocked by application of compound C. Conclusion Hes reduces DOX-induced cardiotoxicity by inhibiting inflammation via regulating the AMPK/NLRP3 pathway.

Graphical abstract

关键词

橙皮素 / 阿霉素 / AMPK/NLRP3 / 炎症反应 / H9c2细胞

Key words

hesperetin / doxorubicin / AMPK/NLRP3 / inflammatory response / H9c2 cells

肿瘤和心血管疾病在全世界范围内发病率和死亡率高^［1］。肿瘤和心血管疾病有着共同的危险因素和病理机制，并具有一定的相关性，如肿瘤通过释放炎症因子引发慢性炎症，导致血管内皮功能障碍，增加心血管疾病发生风险，而心血管疾病往往也伴有炎症反应，能促进癌细胞的增殖和迁移。蒽环类药物如阿霉素（DOX）在抗肿瘤治疗中发挥着重要作用，是临床上广泛使用的广谱化疗药物^{［2， 3］}。然而长时间或大剂量使用DOX会导致患者心血管功能障碍甚至出现心力衰竭^［4］。DOX导致心脏毒性的病理因素包括增加氧自由基、抑制DNA拓扑异构酶活性、诱发细胞凋亡和Ca²⁺超载等^［5-7］，但具体机制仍未完全阐明。

橙皮素（Hes）是柑橘类果实中的一种重要生物活性物质^［8］，具有抗炎、抗氧化、抗菌和抗肿瘤等多种药理作用^{［9， 10］}。近年来，Hes在抗肿瘤药物心脏毒性中的作用逐渐得到关注。Hes分子中富含酚类结构，可以通过清除氧自由基和抑制细胞凋亡减轻DOX导致的心肌细胞毒性^［11］。但Hes能否通过抑制DOX诱导的炎症反应和细胞焦亡发挥保护作用还不清楚。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是一类高度保守的蛋白激酶，可通过调控多种信号完成细胞功能，如调节PGC-1α信号影响线粒体生物合成和氧化代谢，抑制mTOR信号减少细胞凋亡，抑制TGF-β信号减少纤维化^［12-14］。此外，AMPK还可通过调控线粒体自噬并抑制线粒体ROS生成影响NLRP3炎性小体活性^［6］。研究表明AMPK在二甲双胍减轻DOX诱导的心脏毒性中发挥重要作用^［15］，但是否参与Hes改善DOX诱导心脏毒性的作用还未见报道。本研究采用DOX处理C57/bl6小鼠和H9c2细胞模拟心脏毒性模型，首次探讨Hes能否通过调节AMPK/NLRP3信号发挥抗细胞焦亡作用改善DOX诱导的心脏毒性。

1 材料和方法

1.1 实验材料

H9c2细胞系（中国上海天成科技有限公司）；C57/bl6小鼠（西安交通大学实验动物中心）；AMPK抑制剂Compound C（Selleck）；裂解的半胱氨酸蛋白酶-3（Cleaved caspase-3）、Bcl2、Bax、IL-1β、IL-18、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、NLRP3、ASC、Caspase-1和GAPDH抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；RIPA裂解液（南京建成生物工程研究所）；TUNEL染色试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技有限公司）；BCA蛋白定量试剂盒、CCK-8试剂盒和LDH活性检测试剂盒（碧云天生物技术有限公司）；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔和山羊抗鼠抗体（武汉谷歌生物技术有限公司）。本研究动物实验经西安医学院动物实验伦理委员会审批（审批号：XYLS2020044）。

1.2 细胞模型的建立

用含有10%胎牛血清和青霉素/链霉素溶液的DMEM培养基在37 ℃恒温培养箱（21% O₂/5% CO₂）中培养H9c2细胞。细胞毒性模型的建立：浓度为1 μmol/L的DOX处理H9c2细胞24 h^［11］；实验随机分为4组，对照组：用含有10%胎牛血清和青霉素/链霉素溶液的DMEM培养基正常培养至实验结束；DOX处理组：用含DOX（1 μmol/L）的DMEM培养基处理24 h；Hes加DOX处理组（DOX+Hes）：先用含Hes（10 μmol/L）的DMEM培养基预处理24 h，再用含DOX（1 μmol/L）的DMEM培养基处理24 h；Hes联合AMPK抑制剂Compound C加DOX处理组（DOX+Hes+CC）：先用含Compound C（10 μmol/L）的DMEM培养基预处理1 h，再用含Hes（10 μmol/L）的DMEM培养基处理24 h，最后用含DOX（1 μmol/L）的DMEM培养基处理24 h。根据文献［11, 16, 17］确定DOX、Hes和Compound C的浓度。

1.3 CCK-8法检测各组H9c2细胞活力

将培养的H9c2细胞接种在96孔板中。严格按照CCK-8说明书步骤测定各组细胞存活率，通过酶标仪检测各组样品的光密度。各组处理结束后将CCK-8溶液加入10 μL/孔，并在37 ℃下在避光孵育2 h后检测。使用微板读取器分光光度法读取吸光度A_{450 nm}。

1.4 ELISA检测H9c2细胞LDH活性

将H9c2细胞以2×10⁵/mL的密度均匀种在6孔板中，待正常贴壁生长后，根据不同分组培养处理，按照LDH检测试剂盒步骤测定收集的4组细胞培养液上清中LDH的活性。根据LDH检测试剂盒方法提取小鼠心肌组织上清，并按照试剂盒步骤测量上清中LDH活性。使用酶标仪测量A_{450 nm}，根据说明书计算各组LDH活性。

1.5 超声检测心脏功能

用异氟烷将小鼠麻醉并去除胸前区被毛，将小鼠的四肢固定在恒温板电极上，实时监测心电变化。采用M超经胸壁在心脏短轴乳头肌水平检测心脏功能，并在Vevo2100超声成像系统计算各组心脏左室射血分数（LVEF）和短轴缩短率（LVFS）。

1.6 HE染色观察心肌纤维形态

造模结束后，用异氟烷将小鼠麻醉并固定在手术台上，快速剪开胸腔，暴露心脏，取下心脏，在预冷的PBS溶液中冲洗后放入4%多聚甲醛中固定24 h。再用梯度脱水的方法制备蜡块，将蜡块切成薄片，采用常规染色步骤将切片进行HE染色，光镜下观察心肌纤维的结构变化。

1.7 TUNEL染色检测H9c2细胞凋亡

各组细胞处理结束后，用4%多聚甲醛4 ℃固定1 h，用0.1% TritonX-100打孔30 min，PBS漂洗，加入配置好的TUNEL染色试剂，37 ℃避光孵育20 min，PBS避光漂洗，然后用DAPI染液37 ℃下避光孵育10 min，PBS避光漂洗。用激光共聚焦显微镜随机拍照，保存图像。

1.8 RT-PCR检测H9c2细胞炎性因子mRNA表达

取4组细胞或心肌组织，用PBS小心洗涤收集各组细胞或心肌组织，离心弃上清并保留沉淀。使用TRIzol提取总RNA，并通过分光光度计对其产率和纯度进行计算。RNA（每个样品2 µg）引物cDNA合成试剂盒反转录成cDNA。检测TNF-α、IL-6、IL-1β和GAPDH的mRNA水平。细胞引物序列如下：TNF‑α正义链：5'‑AGCATGATCCGAGATGTGGAA‑3'，反义链：5'‑TAGACAGAAGAGCGTGGTGGC‑3'；IL‑1β正义链：5'‑GGGATGATGACGACCTGCTAG‑3'，反义链：5'‑ACCACTTGTTGGCTTATGTTCTG‑3'；IL‑6正义链：5'‑GTTGCCTTCTTGGGACTGATG‑3'，反义链：5'‑ATACTGGTCTGTTGTGGGTGGT‑3'；GAPDH正义链：5'‑GACATGCCGCCTGGAGAAAC‑3'，反义链：5'‑AGCCCAGGATGCCCTTTAGT‑3'。心肌组织引物序列如下：TNF‑α正义链：5'-CATCTTCTCAAAATT CGAGTGACAA-3'，反义链：5'-TGGGAGTAGACAA GGTACAACCC-3'；IL‑1β正义链：5'-CCGTGGACCT TCCAGGATGA-3'，反义链：5'-GGGAACGTCACACA CCAGCA-3'；IL‑6正义链：5'-AGTTGCCTTCTTGGG ACTGA-3'，反义链：5'-TCCACGATTTCCCAGAGA AC-3'；GAPDH正义链：5'‑GACATGCCGCCTGGA GAAAC‑3'，反义链： 5'‑AGCCCAGGATGCCCTTTA GT‑3'。所有引物由引物设计软件3.0（Applied Biosystems）设计并由汉恒生物科技有限公司。

1.9 免疫印迹法检测蛋白表达

将H9c2细胞培养于60 mm细胞培养皿中，根据分组处理后，弃上清，PBS清洗；心肌组织用预冷的PBS清洗。用含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液将细胞重悬或加入心肌组织中，在冰上裂解20 min，并于4 ℃ 12 000 g离心20 min，取上清，BCA定量。采用聚丙烯酰胺凝胶100 V分离蛋白，湿转法将凝胶上的蛋白转至PVDF膜90 min；将膜置于5 %脱脂奶粉室温封闭2 h，将膜放入抗cleaved caspase-3（1∶1000）、Bcl2（1∶1000）、Bax（1∶1000）、IL-1β（1∶1000）、IL-18（1∶1000）、AMPK（1∶1000）、p-AMPK（1∶1000）、mTOR（1∶1000）、p-mTOR（1∶1000）、NLRP3（1∶1000）、ASC（1∶1000）、Caspase-1（1∶1000）和GAPDH（1∶5000）抗体中，4 ℃摇床过夜；用含有0.1%吐温20的TBS（TBST）洗膜后，加入HRP标记的二抗室温下孵育2 h，Bio-Rad化学发光系统检测，并用Image Lab软件进行灰度值计算。以内参蛋白的灰度值为1，计算目的条带相对内参蛋白的灰度值为目的蛋白的相对表达量。以对照组的蛋白相对表达量的均数为100%，计算其他组相对于对照组目的蛋白的表达量。

1.10 统计学分析

采用SPSS 28.0软件进行统计分析，计量数据以均数±标准差表示，运用单因素方差分析进行组间比较，再用SNK-q检验比较两组间差异，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Hes改善DOX所致细胞损伤的作用被Compound C逆转

细胞形态和ELISA检测结果显示（图1）：对照组细胞呈正常形态且分布均匀，细胞活力高，培养基中LDH活性低；与对照组比较，DOX组细胞皱缩，密度和活力降低，培养基中LDH活性增加（P<0.01）；与DOX组比较，DOX+Hes组细胞形态改善，密度和活力增加，培养基中LDH活性降低（P<0.01）；与DOX+Hes组比较，DOX+Hes+Compound C组细胞皱缩，密度和活力明显降低，培养基中LDH活性增加（P<0.01）。

2.2 Hes降低DOX所致细胞凋亡的作用被Compound C逆转

TUNEL染色和Western blotting结果显示（图2）：与对照组比较，DOX组TUNEL染色阳性细胞数增加，促凋亡蛋白cleaved caspase-3、Bax表达增加，抗凋亡蛋白Bcl2表达降低（P<0.01）；与DOX组比较，DOX+Hes组TUNEL染色阳性细胞数减少，促凋亡蛋白cleaved caspase-3、Bax表达降低，抗凋亡蛋白Bcl2表达增加（P<0.01）；与DOX+Hes组比较，DOX+Hes+Compound C组TUNEL染色阳性细胞数增加，促凋亡蛋白cleaved caspase-3、Bax表达增加，抗凋亡蛋白Bcl2表达降低（P<0.01）。

2.3 Hes抑制DOX所致炎症反应的作用被Compound C逆转

RT-PCR和Western blotting结果显示（图3）：与对照组比较，DOX组TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表达增多，IL-1β和IL-18的蛋白表达增加（P<0.01）；与DOX组比较，DOX+Hes组TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表达减少，IL-1β和IL-18的蛋白表达降低（P<0.01）；与DOX+Hes组比较，DOX+Hes+Compound C组TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表达增多，IL-1β和IL-18的蛋白表达增加（P<0.01）。

2.4 Hes调控AMPK/NLRP3通路的作用被Compound C逆转

Western blotting结果显示（图4）：与对照组比较，DOX组p-AMPK表达减少，p-mTOR、NLRP3、ASC和caspase-1表达增多（P<0.01）；与DOX组比较，DOX+Hes组p-AMPK表达增加，p-mTOR、NLRP3、ASC和caspase-1表达减少（P<0.01）；与DOX+Hes组比较，DOX+Hes+Compound C组p-AMPK表达减少，p-mTOR、NLRP3、ASC和Caspase-1表达增多（P<0.01）。

2.5 Hes改善DOX所致小鼠心脏损伤的作用被Compound C逆转

HE染色结果显示，假手术组心肌纤维排列整齐有序，DOX组心肌纤维空泡化严重，肿胀明显，DOX+Hes组心肌纤维结构改善，空泡化和肿胀明显改善（图5A）；心肌LDH检测和心脏功能结果显示（图5B），与假手术组比较，DOX组LDH活性增加，LVEF、LVFS降低（P<0.01）；与DOX组比较，DOX+Hes组LDH活性降低，LVEF、LVFS增加（P<0.01）；与DOX+Hes组比较，DOX+Hes+Compound C组LDH活性增加，LVEF、LVFS降低（P<0.01，图5C、D）。

2.6 Hes抑制DOX所致小鼠心脏炎症反应的作用被Compound C逆转

RT-PCR和Western blotting结果显示（图6）：与假手术组比较，DOX组心肌组织TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表达增多，IL-1β和IL-18的蛋白表达增加（P<0.01）；与DOX组比较，DOX+Hes组心肌组织TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表达减少，IL-1β和IL-18的蛋白表达降低（P<0.01）；与DOX+Hes组比较，DOX+Hes+Compound C组心肌组织TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表达增多，IL-1β和IL-18的蛋白表达增加（P<0.01）。

2.7 Hes调控AMPK/NLRP3通路的作用被Compound C逆转

Western blotting结果显示，与Sham组比较，DOX组心肌组织中p-AMPK表达减少，p-mTOR、NLRP3、ASC和caspase-1表达增多（P<0.01）；与DOX组比较，DOX+Hes组心肌组织中p-AMPK表达增加，p-mTOR、NLRP3、ASC和caspase-1表达减少（P<0.01）；与DOX+Hes组比较，DOX+Hes+Compound C组心肌组织中p-AMPK表达减少，p-mTOR、NLRP3、ASC和caspase-1表达增多（P<0.01，图7）。

3 讨论

DOX是一种常用的抗癌药物，但具有严重的心脏毒性，易导致心肌细胞死亡并最终可能进展为心力衰竭。有研究发现DOX能引起线粒体内蛋白如FUNDC2和SLC25A11泛素化水平改变，使心肌细胞铁稳态失衡，进而引发铁死亡^［18］。Hes通过抑制DOX诱导的心肌细胞线粒体形态变化和铁死亡，保护心肌细胞^［18］。此外，Hes还可以通过调节线粒体GSH含量，抑制DOX引发的铁死亡^［19］。这些研究表明，Hes在DOX诱导的心肌毒性中具有潜在的保护作用，为防治DOX导致的心肌损伤提供了新的思路。

研究表明，DOX诱导的心肌细胞毒性表现为心肌细胞活力降低，细胞凋亡增加^［20］。而心肌细胞作为高度分化的终末细胞，成熟的心肌细胞已无法进行细胞分裂，几乎丧失自我更新能力^［21］。本研究结果显示，H9c2细胞经DOX处理后活力降低，心肌损伤指标LDH活性增加，抗凋亡蛋白表达减少，而促凋亡蛋白表达增多，细胞凋亡增加；同时，小鼠心肌组织HE染色和心脏功能检测显示，心肌纤维空泡化严重，肿胀明显，心功能降低，Hes干预后可明显改善H9c2细胞活力，降低LDH活性，抑制细胞凋亡，并改善心肌纤维损伤和心脏功能，这与以往的文献报道一致^［22］。更为重要的是，本研究首次证实，Hes对DOX引起的H9c2细胞和小鼠心肌损伤的保护作用能够被AMPK抑制剂Compound C所逆转，这一结果说明AMPK在Hes改善DOX引起的心肌毒性中发挥关键作用。

研究证据表明，炎症反应在DOX诱导的心肌细胞毒性中也发挥着关键作用^［23］。DOX处理能通过激活NF-κB显著增加炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达^［24］。而且，炎症反应和氧化应激能够相互促进，具有共同加重DOX导致的心肌毒性损伤的作用^{［25， 26］}。本研究结果显示，DOX能明显增加TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达，IL-1β和IL-18的蛋白表达也明显增加，这进一步证明炎症反应是DOX诱导心肌细胞毒性损伤的重要原因。本研究结果还显示Hes能明显降低DOX引起的TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达，并减少IL-1β和IL-18的蛋白表达；本文采用Compound C观察AMPK的作用，发现Hes降低DOX引起的H9c2细胞炎症反应的作用被Compound C所阻断，表明AMPK是Hes改善DOX引起的炎症反应的关键因素。

细胞焦亡是一种由细胞膜破裂导致胞质内容物释放引起的炎性细胞死亡方式，主要特点是形成炎性小体，而NLRP3炎性小体是最典型的一种，其是由NLRP3、ASC和caspase-1组成的一类复合物^［27］。AMPK是调节细胞代谢的能量传感器，对于调节细胞内能量的动态平衡至关重要，也被称为人体的“代谢开关”^{［28， 29］}。AMPK通过调节糖脂代谢、蛋白质合成和降解、影响糖异生、脂肪生成和线粒体生物相关蛋白的转录改善心脏功能障碍^［30］。本研究首次证明，Hes能够上调DOX引起的p-AMPK和p-mTOR表达，降低NLRP3、ASC和caspase-1的表达；而Compound C能阻断Hes对AMPK及其底物mTOR以及NLRP3、ASC和caspase-1表达的影响。这表明Hes可通过激活AMPK/NLRP3通路改善DOX引起的心脏毒性。

综上所述，本研究进一步证明Hes在DOX诱导的心脏毒性模型中具有保护作用，并证实Hes可通过调控AMPK/NLRP3通路减轻炎症反应改善心脏毒性。本研究为未来临床可能使用Hes防治抗肿瘤药物引起的心脏毒性提供了实验依据和理论支持。

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基金资助

陕西省教育厅专项科研计划项目(20JK0883)

陕西省教育厅专项科研计划项目(20JS135)

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