清肾颗粒通过调控miR-23b及Nrf2通路改善慢性肾脏病湿热证患者的肾功能：基于网络药理学和临床试验

Qingshen Granules improves renal function of patients with chronic kidney disease damp-heat syndrome by activating the miR-23b and Nrf2 pathway

摘要

目的 探讨清肾颗粒对慢性肾脏病（CKD）湿热证患者miR-23b及Nrf2通路及氧化应激干预作用。 方法 通过TCMSP、UniProt检索并映射清肾颗粒调控靶点，利用Small RNA测序技术筛选慢性肾衰竭湿热证的疾病基因，构建“活性成分-交集靶点-疾病”网络。利用KEGG通路富集分析及分子对接，明确清肾颗粒通过Nrf2通路影响CKD的靶点。临床试验：纳入60例CKD3~5期且表现为湿热证的非透析患者，设观察组和对照组，30例/组，另设20例正常组。对照组接受西医常规治疗，观察组在此基础上加用清肾颗粒，疗程8周。检测指标包括PBMC中miR-23b-5p、Nrf2和HO-1蛋白的表达水平，肾功能指标（Scr、eGFR），以及血清中ROS、AOPP、 PON-1的含量。 结果 清肾颗粒经筛选得到6种主要活性成分，10个关键靶点（ACTB、JUN、PTEN、ESR1、GSK3B、PPARG、PIK3CA、APP、PIK3R1、BECN1）。通过Small RNA测序，发现miR-23b-5p基因表达上调。KEGG通路分析显示Nrf2通路发挥重要作用。分子对接揭示核心靶点与活性成分结合活性良好，NFE2L2与木犀草素结合活性最好。清肾颗粒能降低患者血清Scr及ROS和AOPP水平，升高eGFR及血清PON-1水平（P<0.05）；升高PBMC中的 Nrf2和HO-1蛋白水平（P<0.05）；升高miR-23b-5p的表达水平（P<0.05）。 结论 miR-23b表达及Nrf2通路异常可能是CKD湿热证患者的关键干预靶点。清肾颗粒能通过多种活性成分作用于多靶点改善CKD湿热证患者肾功能，其治疗效果可能与 miR-23b 表达的上调、Nrf2 抗氧化通路活性的增强以及机体氧化应激水平的降低密切相关。

Abstract

Objective To investigate the therapeutic mechanism of Qingshen Granules (QSG) in patients with chronic kidney disease (CKD) damp-heat syndrome. Methods The regulatory targets of QSG were retrieved and mapped using TCMSP and UniProt. Small RNA sequencing technology was used to screen the target genes of chronic renal failure damp-heat syndrome to construct the "active ingredients-intersection targets-diseases" network, followed by KEGG pathway enrichment analysis and molecular docking of the core targets. Sixty patients with CKD (stage 3-5) presenting with damp-heat syndrome and not undergoing dialysis were randomized equally into two groups for conventional Western medicine treatment (control group) and additional treatment with QSG (observation group) for 8 weeks, with 20 healthy individuals as the normal control group. The expression levels of miR-23b-5p, Nrf2 and HO-1 protein in peripheral blood mononuclear cells (PBMC), renal function indicators (Scr and eGFR), and serum ROS, AOPP and PON-1 levels were compared among the 3 groups after the treatments. Results Six main active ingredients of QSG were identified, and their key targets included ACTB, JUN, PTEN, ESR1, GSK3B, PPARG, PIK3CA, APP, PIK3R1, and BECN1. MiR-23b-5p expression was significantly up-regulated in CKD damp-heat syndrome, in which the Nrf2 pathway abnormality played an important pathogenic role. Molecular docking results suggested good binding activity of the core targets with the active ingredients of QSG, and NFE2L2 had the strongest binding with luteolin. In patients with CKD damp-heat syndrome, QSG treatment significantly decreased serum Scr, ROS and AOPP levels, obviously improved eGFR, and increased serum PON-1 levels, expression levels of Nrf2 and HO-1 proteins in PBMCs, and the expression level of miR-23b-5p. Conclusion QSG can improve the renal function in patients with CKD damp-heat syndrome possibly by up-regulating miR-23b expression, activating the Nrf2 antioxidant pathway, and reducing oxidative stress levels.

Graphical abstract

关键词

清肾颗粒 / 慢性肾脏病 / microRNA / Nrf2通路 / 网络药理学

Key words

Qingshen Granules / chronic kidney disease / microRNA / Nrf2 pathway / network pharmacology

慢性肾脏病（CKD）是一种以高发病率、不良预后以及高昂医疗成本为特征的全球性重大健康问题。其病理特点以肾小球硬化以及肾间质纤维化（RIF）为主要表现^［1］。肾小球硬化导致肾小球结构的破坏和功能丧失，而肾间质纤维化则进一步加剧肾脏组织的损伤，最终加速了终末期肾脏病（ESRD）的发展进程^［2］。这一病理过程不仅对患者的生活质量产生深远影响，也给医疗系统带来了沉重的负担^［1］。研究发现microRNA（miRNA）在CKD及肾脏纤维化的发病过程中发挥重要作用，而氧化应激则是RIF发生的关键病理机制^［3］。Nrf2/ARE信号通路作为细胞内重要的抗氧化应激调节通路，在肾脏疾病的发病机制、进展过程以及预防策略中展现出显著的治疗潜力^［4］。然而，目前在CKD领域对于miRNA/Nrf2机制的研究尚处于空白。当前阶段，CKD的治疗仍面临诸多挑战，核心治疗策略涵盖肾素-血管紧张素系统（RAS）阻断剂的使用、控制饮食中蛋白质摄入和必需氨基酸治疗，具有降低肾小球“三高”病理状态作用^［5］，然而这些常规治疗难以抓住CKD的病理变化和发病机制的关键。清肾颗粒作为安徽中医药大学第一附属医院肾内科王亿平教授的经验方，前期临床研究^{［6， 7］}，已明确其在抑制氧化应激反应、增强机体抗氧化能力及延缓肾纤维化等方面积极作用。本研究旨在通过网络药理学和Small RNA测序技术，根据差异miRNA，筛选清肾颗粒的作用靶点及机制，并通过临床研究验证其对miR-23b及Nrf2通路的干预效果，为其临床应用提供科学依据。

1 资料和方法

1.1 网络药理学研究

1.1.1 建立“复方-活性成分-靶点”机制网络

通过中药系统药理学数据库（TCMSP）以“OB≥30%、DL≥0.18”为条件检索清肾颗粒的中药成分，将中药成分信息导入PubChem数据库，获取对应的Canonical SMILES结构式，进一步利用SwissADME数据库，基于“胃肠道吸收（GI absorption）为High，且5类药性预测：5项中≥2项Yes”的条件，对化合物进行筛选。通过Swiss Target Prediction数据库预测并保留“Probability≥0.5”的靶点。最后在UniProt数据库靶点蛋白对应基因的映射，精简去重后得到清肾颗粒调控的基因集，绘制“复方-活性成分-靶点”靶点调控图。

1.1.2 筛选CKD湿热证患者疾病基因集

利用Small RNA测序技术检测CKD 4-5期湿热证患者和健康对照者血清中miRNA表达谱，并筛选差异miRNA，运用Miranda、TargetScan、miRDB等数据库进行靶基因搜集，总结得到疾病基因集，深入解析miRNA在CKD湿热证中的作用机制。

1.1.3 建立“活性成分-关键靶点”机制网络

取清肾颗粒的活性成分靶点与疾病基因集的交集，确定了共同作用基因，解析清肾颗粒在慢性肾衰竭湿热证治疗过程中的重要靶点。绘制“活性成分-交集靶点-疾病”机制网络图，通过网络拓扑分析筛选核心靶点。

1.1.4 蛋白质互作网络构建

基于交集靶点基因数据，利用String数据库资源，调整筛选参数，绘制PPI网络图，导出TSV格式文件。在Cytoscape软件中根据“Betweenness、Closeness、Degree、Eigenvector”4个筛选维度分析PPI网络，并绘制蛋白靶点相互作用图谱，通过比较degree值大小，筛选对网络结构具有决定性的靶点。

1.1.5 GO功能注释及KEGG通路富集分析

将交集靶点录入Metascape 数据库，并借助GO 功能注释以及 KEGG 通路分析手段，探究清肾颗粒活性成分的功能及关键作用通路，并确立了“活性成分-关键靶点-信号通路”网络结构。

1.1.6 分子对接

针对筛选得到的化合物核心组分与核心靶点实施分子对接，从TCMSP数据库（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中获得配体的MOL2格式，此外，化合物的SDF 3D格式亦可通过Pubchem数据库（https：// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取，在OPEN Bable软件中转化为MOL2格式。在PDB数据库（https：//www.rcsb. org/）中利用靶点蛋白全称搜索其PDB三维结构。使用AutoDock4软件对蛋白质和活性成分进行脱水以及加氢处理工作，计算结合能值，生成受体与配体的PDBQT格式；并利用OpenBabel软件完成转换为PDB格式转换，运用PyMOL软件将分子对接可视化展示。

1.2 临床研究

1.2.1 诊断标准及纳入、排除标准

CKD诊断及分期：遵循2012年国际肾脏病组织“肾脏病：改善全球预后”（KDIGO）发布的标准^［5］。依据CKD-EPI公式来估算肾小球滤过率（eGFR）^［8］。遵循《中药新药临床研究指导原则》^［9］中慢性肾衰竭湿热证辨证标准。纳入标准：18~65岁；CKD 3~5期且尚未接受透析治疗；入组前已对电解质紊乱、血压、血糖、贫血等并发症实施有效控制；签署知情同意书；经医院伦理委员会批准（伦理批号：2021AH-43）。排除标准：妊娠或哺乳期女性；精神异常患者；在观察期间使用免疫抑制剂或其他与清肾颗粒成分相似的复方制剂的患者；合并心力衰竭、肝脏疾病、肿瘤以及严重内分泌、血液、免疫系统疾病等严重疾病的患者；临床资料不真实、不完整者；正在参加其他临床试验的患者。

1.2.2 分组情况

纳入2021年12月~2022年12月期间于安徽中医药大学第一附属医院肾病科就诊的60例非透析治疗的CKD3~5期且辨证为湿热证的患者。采用随机抽样法分为观察组和对照组，30例/组，并选取同期我院体检中心的健康正常人群20例设为正常组。在年龄、性别、病程以及基础疾病方面，两组差异均无统计学意义（P>0.05，表1）。

1.2.3 干预方案

对照组：接受西医常规治疗，具体涵盖营养管理（依据2005年《慢性肾脏病蛋白营养治疗共识》）^［10］、降压干预（依据2024年《中国高血压防治指南》）^［11］、贫血纠正策略（依据2021年《中国肾性贫血诊治临床实践指南》）^［12］以及慢性肾脏病矿物质和骨异常（CKD-MBD）的防治（依据《中国慢性肾脏病矿物质和骨异常诊治指南概要》）^［13］。观察组：在对照组治疗基础上，予以清肾颗粒（皖药制备字：Z20190027000，由茵陈、丹参、大黄、白花蛇舌草等组成，10 g/包。）口服，3次/d，1袋/次，以开水冲服，疗程8周。

1.2.4 观察指标及方法

1.2.4.1　中医证候积分

参照《中药新药临床研究指导原则（试行）》^［9］中“慢性肾衰竭的中医症状量化评分标准和证候疗效判定标准”执行。对湿热证临床症状（脘腹闷胀、纳呆、口中黏腻，大便溏垢等）观察。按程度轻、中、重度分别计1、2、3分，舌象不计分。

1.2.4.2　血清指标检测

采用全自动生化分析仪（Beckman Coulter）检测血清肌酐（Scr） ，并依据CKD-EPI公式估算eGFR（南京建成生物）。采用ELISA法检测血清中ROS、AOPP、PON1水平（武汉基因美）。

1.2.4.3　miR-23b-5p

利用Trizol法提取PBMC中总RNA，经生物分光光度计测定其浓度（A_{260 nm}/A_{280 nm}比值为1.8~2.0）。将总RNA逆转录为cDNA（逆转录条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5s），随后进行PCR扩增（20 μL反应体系，条件为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火及延伸30 s，共40个循环）。通过荧光定量 PCR仪（Thermo Scientific）自带软件分析数据，采用2^-△△Ct法计算相对表达量。引物由Primer 5.0软件设计，上海生物工程公司合成，miR-23b-5p引物序列为CTCAACTG GT GTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAAATCA。

1.2.4.4　Nrf2通路及相关蛋白

通过Western blotting法检测PBMC中Nrf2、HO-1蛋白表达。提取PBMC总蛋白，低温离散沉淀物后振荡15 min，静置15 min，以10 000 r/min离心15 min（4 ℃），收集上清并用BCA法测定蛋白含量。蛋白经10% SDS-PAGE电泳后，电转移至PVDF膜，用10%脱脂奶粉-TBST溶液室温封闭4 h，加入一抗Nrf2（1∶1000，武汉三鹰），HO-1（1∶1000，武汉三鹰），β-actin（1∶5000，Zsbio）后4 ℃孵育过夜。次日TBST漂洗，二抗为山羊抗兔IgG（Zsbio），室温孵育2 h，TBST漂洗后加入ECL曝光，利用Fluors凝胶成像系统分析蛋白条带。目的蛋白相对含量以吸光密度×面积与β-actin条带比值表示。

1.3 统计学分析

采用SPSS 26.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差表示；组间差异比较采用t检验；多组间的比较运用单因素方差分析；采用非参数检验分析不符合正态分布或方差不齐的资料。P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 网络药理学研究结果

2.1.1 复方活性成分及靶点预测

清肾颗粒中14味中药的活性成分经去重处理后，共筛选出225个潜在活性成分，映射出650个靶点基因，据此构建了“复方-活性成分-靶点”网络关系图（图1）。

2.1.2 慢性肾衰竭（CRF）湿热证的疾病基因获取

本研究利用人血清small RNA测序分析，检测6例CRF湿热证患者和5例正常人血清miRNA表达谱，共鉴定出97种差异表达的miRNA，其中84个呈上调表达，13个呈下调表达（表2）。分别借助Miranda、FunRich、TargetScan及miRDB等数据库进行靶基因预测，并收集与慢性肾衰竭湿热证相关的疾病基因，经过数据整合与去重处理后，筛得交集基因2327个，其中，miR-23b-5p在CRF湿热证的疾病基因谱中下调（图2）。

2.1.3 建立“活性成分-交集靶点-疾病”机制网络

在“活性成分-交集靶点-疾病”机制网络图中（图3），节选degree值排名前六位的活性成分，分别为MOL000098（quercetin，槲皮素，degree=50）、MOL000422（kaempferol，山奈酚，degree=23）、MOL000008（Apigenin，芹菜素，degree=21）、MOL000006（luteolin，木犀草素，degree=19）、MOL000354（isorhamnetin，异鼠李素，degree=16）、MOL000096（（-）-catechin，（-）-儿茶素，degree=16）。

2.1.4 PPI网络分析

在PPI网络中，共包含了106个节点与592条连线（图4）。利用CytoNCA筛选出排名前10位的靶点分别为ACTB、JUN、PTEN、ESR1、GSK3B、PPARG、PIK3CA、APP、PIK3R1、BECN1。

2.1.5 GO功能注释富集分析

对差异基因进行GO功能注释富集分析，其中生物学过程方面主要涵盖细胞对缺氧的反应、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正向调控、凋亡过程负调控等；细胞组分涵盖69条富集条目，涉及胞浆、质膜、RNA聚合酶Ⅱ转录因子复合物、细胞质、线粒体等；分子功能富集条目84条，涉及RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性，酶、蛋白质、蛋白激酶结合，蛋白质酪氨酸/苏氨酸/丝氨酸激酶活性，磷脂酰肌醇3-激酶结合等。本研究选取了P值最小的TOP10富集条目进行展示（图5）。

2.1.6 KEGG通路富集分析

KEGG通路富集147条与慢性肾衰竭湿热证相关的信号通路。PI3K-AKT、AMPK、Wnt、NFE2L2（Nrf2）、MAPK、JAK-STAT、自噬、p53以及mTOR等处在慢性肾衰竭湿热证相关通路上富集程度前列（图6）。基于以上分析结果，绘制“活性成分-关键靶点-信号通路”机制网络图（图7）。

2.2 分子对接结果

选择槲皮素、山奈酚、芹菜素、木犀草素作为配体，以ACTB、PTEN、PPARG、PIK3CA、NFE2L2作为分子对接的受体，通过AUTODOCK Vina软件进行分子对接，对接结果显示核心靶点和关键活性化合物的结合能在-6.0~2.34 kcol/mol（表3），选择结合活性较好的成分进行可视化展示（图8）。NFE2L2受体和各配体成分均有较好的结合活性，与木犀草素结合能为-5.38 kcol/mol，结合活性最佳。

2.3 临床实验验证

2.3.1 中医症候积分比较

治疗后两组患者中医证候积分均较治疗前降低（P<0.05），且观察组变化相较于对照组更为明显（P<0.05，表4）。

2.3.2 两组患者Scr、eGFR比较

治疗前，两组患者的Scr、eGFR水平差异无统计学意义（P>0.05）；治疗后，观察组的Scr水平降低，eGFR水平提升（P<0.05）；且变化较对照组明显（P<0.05，表5）。

2.3.3 PBMC中Nrf2、HO-1含量

治疗前，两组患者的PBMC中Nrf2和HO-1的水平均低于正常组（P<0.05），且两组之间差异无统计学意义（P>0.05）。治疗后，两组的Nrf2和HO-1水平均高于治疗前（P<0.05）。观察组的Nrf2和HO-1水平高于同期的对照组（P<0.05，表6，图9）。

2.3.4 血清ROS、PON-1、AOPP水平

治疗前，对照组和观察组血清ROS、AOPP水平均高于正常组，PON-1水平低于对照组（P<0.05），两组之间差异无统计学意义（P>0.05）。治疗后，两组患者的血清ROS、AOPP水平降低， PON-1水平升高（P<0.05）；而观察组的ROS、AOPP水平低于同期对照组，PON-1水平高于同期对照组（P<0.05，表7）。

2.3.5 PBMC中miR-23b-5p水平

治疗前，对照组和观察组的PBMC中miR-23b-5p表达水平低于正常组（P<0.05），两组之间差异无统计学意义（P>0.05）。治疗后，观察组患者的miR-23b-5p表达水平高于治疗前（P<0.05），对照组在治疗前后的变化差异统计学意义（P>0.05）。观察组的miR-23b-5p表达水平明显高于同期对照组（P<0.05，表8）。

2.3.6 miR-23b-5p表达量的相关性分析

CKD湿热证患者（包括对照组和观察组）治疗前miR-23b-5p表达量与Scr、ROS含量、AOPP含量呈负相关性（P<0.01），与eGFR、Nrf2含量、HO-1含量、PON1含量呈正相关性（P<0.01，图10）。

3 讨论

本研究应用网络药理学方法对清肾颗粒治疗CKD的潜在分子靶点进行系统地预测，并通过临床试验进行验证，旨在深入探索其治疗机制。研究过程中，经筛选确定清肾颗粒包含225种活性成分以及650个靶点蛋白。网络分析揭示，槲皮素、山奈酚、芹菜素、木犀草素、异鼠李素、（-）-儿茶素等是清肾颗粒治疗CKD的主要活性成分。研究表明^［14］，槲皮素阻断近端肾小管上皮细胞的铁死亡机制，从而对肾脏起到保护作用。芹菜素可减轻糖尿病大鼠肾纤维化程度，调控促炎基因表达，其机制为抑制Nrf2通路介导的氧化应激及炎症反应，进而维护肾小管上皮细胞完整性，使其规避高糖环境诱导的损伤^［15］。在PPI网络中，筛出重要靶点有ACTB、PTEN、PPARG、PIK3CA等。且NFE2L2在网络中发挥重要作用。利用分子对接技术，明确了活性成分与关键靶点间的结合能，NFE2L2与木犀草素结合活性最佳。在对慢性肾脏病靶点的解析中，发现清肾颗粒中发挥抗肾纤维化药效的活性物质靶点多样性，这可能为慢性肾脏病治疗的新方向。

为进一步明确清肾颗粒在慢性肾脏病治疗过程中的机制。进行GO功能及KEGG通路分析，GO功能注释分析结果反映了清肾颗粒治疗慢性肾衰竭湿热证发挥主要作用机制与参与调控细胞迁移、细胞凋亡、细胞增殖以及氧化应激等生物学过程有关，其中缺氧和氧化应激在CKD发病机制和肾纤维化进展过程中起到重要作用，这与课题组前期的研究结果相符^［17］。KEGG通路富集分析鉴定了147种相关细胞信号通路，主要包括PI3K-AKT、AMPK、Wnt、NFE2L2（Nrf2）、MAPK、JAK-STAT、自噬、p53、mTOR信号通路等，其中NFE2L2（Nrf2）信号通路在该网络中发挥较突出的作用，初步预测出清肾颗粒对CKD湿热证的网络调控机制。在肾小管损伤和肾脏纤维化发生机制中，氧化应激及其介导的炎性反应起着举足轻重的作用^［16］；作为机体内源性最重要的抗氧化信号通道，Nrf2通路具有抗氧化应激和炎症反应的作用，因此在肾小管氧化应激损伤和上皮间质转化（EMT）中，Nrf2靶向治疗具有很大的应用价值^［17］。Nrf2激活可以减轻TGF-β1刺激所致的肾小管EMT进程，提示Nrf2诱导剂在肾纤维化机制中的有益作用^［18］。Wang等^［19］通过体内体外实验验证，Nrf2通路能够抵消TGF-β1诱导的EMT和肾间质纤维化作用。近期研究也发现^［20］，5/6肾切除大鼠的肾组织中Nrf2蛋白表达量下降；而清肾颗粒可以增强Nrf2活性，进而减轻肾小管及肾间质的病理损伤。由此可见，Nrf2信号通路的激活在肾小管损伤中起重要防御与保护作用，也成为中医药防治肾间质纤维化的重要靶点。

microRNA（miRNA）是单链非编码小RNA，通过在转录后水平上完全或部分结合靶蛋白编码的mRNAs进行降解或翻译抑制，在调节蛋白质表达方面发挥了关键作用，参与细胞增殖、分化、凋亡等多个过程，也影响了肾小管EMT和肾脏纤维化进程，与肾脏疾病发生密切相关。研究发现^{［21， 22］}，miR-23b在抑制肾小管上皮-间质转化（EMT）以及缓解氧化应激性损伤方面发挥着关键效能，已然成为肾脏纤维化干预研究领域的全新靶点。Liu等^［23］研究发现，在高糖诱导的人肾近端小管上皮细胞（HK-2）和db/db小鼠的肾组织中，miR-23b含量显著降低；miR-23b过表达能够减弱汞诱导的肾小管EMT进程。Li等^［24］研究发现，在IgAN患者血清和肾脏组织中miR-23b水平下调，miR-23b^-/-小鼠出现系膜IgA和C3沉积的IgAN样表型，与蛋白尿、高血压、血清肌酐升高呈正相关，且miR-23b的缺失增加了肾脏纤维化的易感性。这些提示miR-23b在肾小管EMT和肾纤维化中起到重要的保护性作用。我们通过Small RNA测序分析得到97个差异miRNA，构成了CRF湿热证疾病基因谱，其中miR-23b-5p在该基因谱中表达是显著下调的，提示miR-23b在CKD的发病过程中可能起到重要的保护性作用。在本研究收集的健康人群与慢性肾脏病患者PBMC中miR-23b-5p水平的比较中发现，miR-23b-5p在CKD湿热证患者中表达明显下调，且miR-23b-5p 表达量与Scr、ROS和AOPP含量呈负相关，与eGFR、Nrf2、HO-1、PON-1含量呈正相关，提示miR-23b-5p表达减少及Nrf2抗氧化通路活性下降可能是CKD湿热证患者的主要疾病靶点之一，也是导致CKD湿热证患者氧化应激的重要原因。而治疗后观察组miR-23b-5p表达水平的显著上调以及与对照组的差异表明miR-23b-5p表达水平越高，肾功能损伤越轻。且清肾颗粒能够改善CKD湿热证患者肾功能，延缓肾衰进程，其治疗作用可能与上调miR-23b表达、增强Nrf2抗氧化通路活性、减轻机体氧化应激水平等有关。

在本次临床试验中对上述筛选出的miR-23b和Nrf2通路活性进一步进行验证，观察了CKD湿热证患者的肾功能指标（Scr、eGFR）、Nrf2、HO-1、PON-1、ROS、AOPP含量的变化。其中HO-1是Nrf2信号通路中重要的下游因子，发挥着抗氧化作用^［26］。ROS是一种含有氧自由基的高活性化学物质，是介导氧化应激的重要物质 ^［26］。AOPP是由体内血浆蛋白遭受ROS攻击后发生氧化修饰而形成。相较于脂质过氧化产物，AOPP在预测氧化应激时更为灵敏和精准，更能贴切地反映急性氧化应激过程^{［27， 28］}。而PON-1作为机体内对抗氧化反应的关键磷酸酯酶，其作用机制为与高密度脂蛋白中的ApoA1相结合，进而减少脂质过氧化产物的聚集，以此实现抗氧化功效^［29］。此次研究结果发现，CKD湿热证患者的PBMC中Nrf2和HO-1含量均显著低于正常组，而血清ROS、AOPP水平均显著高于正常组，PON-1水平显著低于对照组；清肾颗粒可能通过激活Nrf2/HO-1通路，增强身体的抗氧化能力，从而减少氧化应激产物（ROS、AOPP），提升PON-1的水平。

本研究是通过网络药理学研究清肾颗粒经Nrf2通路治疗慢性肾脏病湿热证主要活性成分及作用靶点，并探讨主要机制；利用分子对接解析成分与靶点之间的结合，验证清肾颗粒的药效物质基础。通过临床研究初步验证清肾颗粒能够改善CKD湿热证患者肾功能，延缓肾衰进程，其治疗作用可能与上调miR-23b表达、增强Nrf2抗氧化通路活性、减轻机体氧化应激水平等有关。在未来研究中将对miR-23b与Nrf2通路之间的靶向调控关系进行深入探索。

参考文献

[1] GBD Chronic Kidney Disease Collaboration. Global, regional, and national burden of chronic kidney disease, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017[J]. Lancet, 2020, 395(10225): 709-33. doi：10.1016/s0140-6736(19)32977-0

[2] Ruiz-Ortega M, Rayego-Mateos S, Lamas S, et al. Targeting the progression of chronic kidney disease[J]. Nat Rev Nephrol, 2020, 16(5): 269-88. doi：10.1038/s41581-019-0248-y

[3] Zhao H, Ma SX, Shang YQ, et al. microRNAs in chronic kidney disease[J]. Clin Chim Acta, 2019, 491: 59-65. doi：10.1016/j.cca.2019.01.008

[4] Aranda-Rivera AK, Cruz-Gregorio A, Pedraza-Chaverri J, et al. Nrf2 activation in chronic kidney disease: promises and pitfalls[J]. Antioxidants (Basel), 2022, 11(6): 1112. doi：10.3390/antiox11061112

[5] DiseaseKidney: Improving Global Outcomes CKD Work Group. KDIGO 2024 clinical practice guideline for the evaluation and management of chronic kidney disease[J]. Kidney Int, 2024, 105(4S): S117-314.

[6] 王亿平, 陈 芳, 王 东, 等. 清肾颗粒对慢性肾衰竭湿热证患者氧化应激的干预作用[J]. 中成药, 2017, 39(1): 46-50.

[7] 金 华, 王亿平, 王 东, 等. 清肾颗粒对慢性肾衰竭湿热证患者氧化应激介导的NF-κB信号通路活化的影响[J]. 时珍国医国药, 2017, 28(12): 2841-3.

[8] 李文娟, 王亿平. 湿热证与慢性肾衰竭病证关系浅析[J]. 安徽中医学院学报, 2004, 23(2): 58-9.

[9] 邵光新.慢性肾功能衰竭中医证候学临床回顾性调查研究[D].合肥:安徽中医学院,2007.

[10] 慢性肾脏病蛋白营养治疗专家共识[J]. 国外医学 内分泌学分册, 2005, 25(6): 437-8.

[11] 中国高血压防治指南修订委员会, 高血压联盟(中 国, 中国医疗保健国际交流促进会高血压病学分会, 等. 中国高血压防治指南(2024年修订版)[J]. 中华高血压杂志: 中英文, 2024, 32(7): 603-700.

[12] 孙雪峰. 《中国肾性贫血诊疗的临床实践指南》解读[J]. 中国实用内科杂志, 2021, 41(9): 785-8.

[13] National Clinical Research Center of Kidney Diseases. 中国慢性肾脏病矿物质和骨异常诊治指南概要[J]. 肾脏病与透析肾移植杂志, 2019, 28(1): 52-7.

[14] Lai KM, Wang JJ, Lin SY, et al. Sensing of mitochondrial DNA by ZBP1 promotes RIPK3-mediated necroptosis and ferroptosis in response to diquat poisoning[J]. Cell Death Differ, 2024, 31(5): 635-50. doi：10.1038/s41418-024-01279-5

[15] Zhang JC, Zhao XM, Zhu HL, et al. Apigenin protects against renal tubular epithelial cell injury and oxidative stress by high glucose via regulation of NF-E2-related factor 2 (Nrf2) pathway[J]. Med Sci Monit, 2019, 25: 5280-8. doi：10.12659/msm.915038

[16] Jin H, Wang YP, Wang D, et al. Effects of Qingshen Granules on the oxidative stress-NF/kB signal pathway in unilateral ureteral obstruction rats[J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2018, 2018: 4761925. doi：10.1155/2018/4761925

[17] Lin DW, Hsu YC, Chang CC, et al. Insights into the molecular mechanisms of NRF2 in kidney injury and diseases[J]. Int J Mol Sci, 2023, 24(7): 6053. doi：10.3390/ijms24076053

[18] Ryoo IG, Shin DH, Kang KS, et al. Involvement of Nrf2-GSH signaling in TGFβ1-stimulated epithelial-to-mesenchymal transition changes in rat renal tubular cells[J]. Arch Pharm Res, 2015, 38(2): 272-81. doi：10.1007/s12272-014-0380-y

[19] Wang J, Zhu HB, Huang LQ, et al. Nrf2 signaling attenuates epithelial-to-mesenchymal transition and renal interstitial fibrosis via PI3K/Akt signaling pathways[J]. Exp Mol Pathol, 2019, 111: 104296. doi：10.1016/j.yexmp.2019.104296

[20] 陈 诺, 金 华, 呼 琴, 等. 清肾颗粒对腺嘌呤致肾纤维化大鼠Nrf2/ARE信号通路及氧化应激的干预作用[J]. 中医药临床杂志, 2023, 35(5): 976-82.

[21] Yu DM, Yang XH, Zhu Y, et al. Knockdown of plasmacytoma variant translocation 1 (PVT1) inhibits high glucose-induced proliferation and renal fibrosis in HRMCs by regulating miR-23b-3p/early growth response factor 1 (EGR1)[J]. Endocr J, 2021, 68(5): 519-29. doi：10.1507/endocrj.ej20-0642

[22] Zhao BH, Li HZ, Liu JT, et al. microRNA-23b targets ras GTPase-activating protein SH3 domain-binding protein 2 to alleviate fibrosis and albuminuria in diabetic nephropathy[J]. J Am Soc Nephrol, 2016, 27(9): 2597-608. doi：10.1681/asn.2015030300

[23] Liu HF, Wang XH, Liu SF, et al. Effects and mechanism of miR-23b on glucose-mediated epithelial-to-mesenchymal transition in diabetic nephropathy[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2016, 70: 149-60. doi：10.1016/j.biocel.2015.11.016

[24] Li HZ, Chen ZC, Chen WT, et al. microRNA-23b-3p deletion induces an IgA nephropathy-like disease associated with dysregulated mucosal IgA synthesis[J]. J Am Soc Nephrol, 2021, 32(10): 2561-78. doi：10.1681/asn.2021010133

[25] Li M, Peng YF, Chen WJ, et al. Active Nrf2 signaling flexibly regulates HO-1 and NQO-1 in hypoxic Gansu Zokor (Eospalax cansus)[J]. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol, 2023, 264: 110811. doi：10.1016/j.cbpb.2022.110811

[26] Zhao YF, Fan XT, Wang QM, et al. ROS promote hyper-methylation of NDRG2 promoters in a DNMTS-dependent manner: Contributes to the progression of renal fibrosis[J]. Redox Biol, 2023, 62: 102674. doi：10.1016/j.redox.2023.102674

[27] Xiang Q, Cheng ZR, Wang JT, et al. Allicin attenuated advanced oxidation protein product-induced oxidative stress and mitochondrial apoptosis in human nucleus pulposus cells[J]. Oxid Med Cell Longev, 2020, 2020: 6685043. doi：10.1155/2020/6685043

[28] Zuo J, Chaykovska L, Chu C, et al. Head-to-head comparison of oxidative stress biomarkers for all-cause mortality in hemodialysis patients[J]. Antioxidants (Basel), 2022, 11(10): 1975. doi：10.3390/antiox11101975

[29] Morris G, Puri BK, Bortolasci CC, et al. The role of high-density lipoprotein cholesterol, apolipoprotein A and paraoxonase-1 in the pathophysiology of neuroprogressive disorders[J]. Neurosci Biobehav Rev, 2021, 125: 244-63. doi：10.1016/j.neubiorev.2021.02.037

基金资助

国家自然科学基金(82274307)

合肥综合性国家科学中心大健康研究院新安医学与中医药现代化研究所专项资金(2023CXMMTCM018)

RIGHTS & PERMISSIONS

版权所有©《南方医科大学学报》编辑部2021