金樱子通过调控Src-AKT1轴抑制肺动脉高压平滑肌增殖

Rosa laevigata Michx. inhibits pulmonary arterial smooth muscle cell proliferation in hypertension by modulating the Src-AKT1 axis

摘要

目的 探讨传统中药金樱子（RLM）治疗肺动脉高压（PAH）的协同机制，通过网络药理学预测其活性成分与作用靶点，并通过体内外实验验证其抗增殖效应 降低细胞内钙离子浓度作用。 方法 网络药理学分析：筛选金樱子活性成分及PAH疾病靶点，构建“成分-靶点-疾病”互作网络，进行基因富集分析与分子对接验证。体外实验：设置对照组、缺氧组+溶剂对照、缺氧+金樱子（100 mg/mL）、缺氧+金樱子（200 mg/mL）、缺氧+金樱子（300 mg/mL），通过Western blotting和免疫荧光检测细胞增殖。动物实验：将大鼠随机分为5组：阴性对照组、野百合碱（MCT）+溶剂对照、野百合碱+金樱子（100 mg/mL），MCT+金樱子（200 mg/mL）、MCT+金樱子（300 mg/mL）。HE染色、免疫荧光染色观察肺血管形态学变化。 结果 网络分析筛选出7种核心活性成分（如β-谷甾醇、山奈酚）及39个关键靶点，分子对接显示Src为高亲和力靶点。KEGG富集分析显示，差异基因显著富集于钙信号通路和PI3K-AKT通路。体外实验表明，与对照组相比，Hypo组PCNA上调（P<0.001）。金樱子显著抑制PASMCs增殖（PCNA表达下调）。Western blotting实验证实金樱子可以抑制Src和AKT1的磷酸化。动物实验证实，金樱子治疗组肺动脉平均压（P<0.001）和右心室肥厚指数降低，右心室射血功能改善，肺血管壁增厚和纤维化减轻。 结论 金樱子通过调控Src-AKT1轴，发挥抗平滑肌增殖的作用，为肺动脉高压的治疗提供了新型天然药物候选策略。

Abstract

Objective To investigate the synergistic mechanism of the traditional Chinese medicine Rosa laevigata Michx. (RLM) for treatment of pulmonary arterial hypertension (PAH). Methods Network pharmacological analysis was carried out to screen the active ingredients of RLM and PAH disease targets and construct the "component-target-disease" interaction network, followed by gene enrichment analysis and molecular docking studies. In the cell experiments, primary cultures of rat pulmonary arterial smooth muscle cells were exposed to hypoxia for 24 h and treated with solvent or 100, 200 and 300 mg/mL RLM, and the changes in cell proliferation were detected using Western blotting for PCNA and immunofluorescence staining. In the animal experiment, male SD rats were randomized into 5 control group, monocrotaline (MCT) solvent group, and MCT with RLM (100, 200 and 300 mg/mL) treatment groups. HE staining and immunofluorescence staining were used to observe histopathological changes in the pulmonary blood vessels of the rats. Results Seven core active ingredients (including β-sitosterol and kaempferol) in RLM and 39 key disease targets were identified, and molecular docking showed that SRC was a high-affinity target. KEGG enrichment analysis showed that the differential genes were significantly enriched in calcium signaling and PI3K-AKT pathways. In rat pulmonary arterial smooth muscle cells, hypoxic exposure significantly up-regulated cellular expression of PCNA and phosphorylation levels of Src and AKT1, which were obviously lowered by RLM treatment. In RLM-treated rat models, the mean pulmonary artery pressure and right ventricular hypertrophy index (Fulton index) were significantly reduced, the tricuspid annular plane systolic excursion (TAPSE) was improved, and pulmonary vascular wall thickening and fibrosis were obviously ameliorated. Conclusion RLM inhibits pulmonary arterial smooth muscle cell proliferation in rat models of hypertension possibly by regulating the Src-AKT1 axis, suggesting the potential of RLM as a new natural drug for treatment of pulmonary hypertension.

Graphical abstract

关键词

肺动脉高压 / 平滑肌细胞增殖 / AKT1 / Src / 网络药理学

Key words

pulmonary hypertension / smooth muscle cell proliferation / AKT1 / Src / network pharmacology

肺动脉高压（PAH）是一种危及生命的疾病，病情进展最终会导致右心衰竭和死亡^［1］。肺血管平滑肌细胞（PASMCs）的异常增殖是肺动脉高压形成的关键环节之一^{［2， 3］}。正常情况下，肺动脉壁由内膜、中膜和外膜构成，其中主要包含平滑肌细胞。在正常生理条件下，这些细胞处于相对稳定的状态，维持着肺血管壁的正常结构与功能。然而，在肺动脉高压的病理状态下，肺血管平滑肌细胞会在缺氧、炎症因子.活性氧以及生长因子（如血小板源性生长因子、转化生长因子-β 等）等多种刺激因素的影响下，从静息状态转变为活跃的增殖状态，大量增殖的肺血管平滑肌细胞会导致肺血管壁增厚，进而使管腔逐渐变窄，随后增加肺血管阻力，这是肺动脉高压中肺血管重构的重要表现形式^{［2， 3］}。PAH的病理进展中，PASMCs内钙离子（Ca²⁺）稳态失衡与异常增殖密切相关。在正常生理条件下，钙离子通过电压门控通道（如L型钙通道）和钙池操纵性钙内流（SOCE）维持动态平衡。但在PAH中，缺氧、炎症因子等刺激导致细胞内Ca²⁺浓度异常升高，触发下游信号级联反应，驱动细胞增殖和血管重构^［3］。随着平滑肌细胞持续增殖，血管壁向内增厚，管腔空间逐渐变窄。根据流体力学原理，这种管腔变窄会使血流阻力增大，而血流阻力与血管半径的四次方成反比，即使管腔半径稍有减小，也会导致血流阻力大幅增加。在肺动脉高压患者中，肺动脉管腔狭窄会使肺动脉压力升高，为克服增加的后负荷，右心室必须增强收缩力，长期可导致右心室肥厚和衰竭^{［1， 4］}。

尽管已应用药物和手术干预来延缓肺动脉高压的进展，但目前的治疗效果仍不尽如人意。诸如前列环素类似物、内皮素受体拮抗剂、磷酸二酯酶—5抑制剂、可溶性鸟苷酸环化酶刺激剂等药物虽有一定益处，但它们无法阻止肺动脉高压的进展，且存在一定副作用^［5］。因此，诸如传统中医药等替代疗法可能是一种副作用更少、成本更低的肺动脉高压治疗选择^{［6， 7］}。所以，了解肺动脉高压的潜在机制并制定有效的治疗策略至关重要。网络药理学是一种利用传统药理学和生物信息学预测药物 - 疾病相互作用潜在机制的新型工具。通过构建 “药物 - 靶点 - 疾病” 网络，可用于探索相互作用的蛋白质，并确定它们涉及哪些生物学功能及通路^［8-12］。

金樱子是一种传统中药材，为蔷薇科植物金樱子的干燥成熟果实。其传统功效润肺止咳、润肠通便。现代研究表明，金樱子的主要成分包括多糖、黄酮类、酚类化合物、三萜类、维生素以及矿物质等^{［8， 13-15］}。其药理作用主要体现在心血管^［16］、呼吸系统方面。其核心活性成分槲皮素据报道可以抑制增殖^［17-19］和调节在肺动脉高压中处于关键地位的钙离子^［20-22］，可能有助于缓解肺动脉高压引起的血液循环障碍。

目前尚未见金樱子干预野百合碱（MCT）诱导的肺动脉高压的相关报道。本研究通过体内实验首次证实了金樱子对MCT诱导的肺动脉高压的积极作用，通过体外实验验证了金樱子降低胞内钙离子浓度、改善肺血管平滑肌增殖的特性，并通过网络药理学，分子对接的方式确定了5个靶点，从中选择了与调节钙离子浓度有关的Src和与细胞增殖密切相关的AKT1进行验证，实验证明金樱子可以通过抑制Src、AKT1磷酸化来降低胞内钙离子浓度抑制平滑肌增殖从而改善肺动脉高压。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂

MCT（MedChemExpress），纯度≥98.0%。12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）、0.3% 曲拉通X-100（TritonX-100）、细胞核染料4'，6-diamidino-2-phenylindole（DAPI，赛维尔生物科技公司），异氟烷（瑞沃德生命科技有限公司），戊巴比妥钠（北京普博斯生物有限公司），BCA试剂盒、RIPA裂解缓冲液（碧云天生物技术股份有限公司），聚偏二氟乙烯（PVDF，密理博）膜，5%牛血清白蛋白（BSA，苏州新赛美生物公司）。化学发光（ECL）检测系统（Pierce），小动物超声机（Visual Sonics），共聚焦显微镜（徕卡），小动物生理多导记录仪、Millar压力导管（米勒）。

1.2 动物

选取雄性SD大鼠，购自中国珠海百试通，体质量150~250 g。充足饮水，实验环境为室温，在动物的饲养和实验操作过程中，严格遵循《实验动物管理条例》的规定。本动物研究经南方医科大学珠江和医院动物伦理与使用委员会审批（伦理批号：LAEC-2024-173），并遵守ARRIVE指南。

1.3 方法

1.3.1 化合物成分筛选

使用“金樱子（Rosa laevigata Michx）”作为关键词在中药系统药理学数据库及分析平台（TCMSP）数据库（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）中进行检索。筛选标准为口服生物利用度≥30% 且类药性≤0.18。

1.3.2 成分-靶点网络构建

将不符合预先设定筛选标准的靶点剔除，以确保数据质量及相关性。利用 Cytoscape 3.8.0（可从Cytoscape 网站获取的网络可视化软件）进行网络映射。在构建的网络中：每个节点代表一个靶点、基因、分子或蛋白质。边（节点之间的连接）展示了这些实体（靶点、基因、分子、蛋白质）之间的相互作用。计算每个节点的“度”值，该值表示网络中与该节点相关联的连接数量。度值越高表明该靶点越有可能是所研究化合物的关键靶点。

1.3.3 获取疾病靶点

在GeneCards数据库（https：//www.genecards.org）中使用“特发性肺动脉高压”作为关键词获取疾病靶点，筛选标准为评分大于10。

1.3.4 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建与分析

将检索到的化合物的潜在靶点与疾病靶点取交集，选取重叠的靶点并导入STRING数据库（https：//string-db.org）以获取蛋白质相互作用关系。置信度阈值设为 Medium Confidence（0.400），排除游离节点其余采用标准默认值。然后将结果导入Cytoscape 3.8.0软件进行相互作用网络的构建与分析。

1.3.5 核心簇及关键靶点筛选

使用 Cytoscape 插件MCODE 进行聚类分析，设置过滤条件为度截止值：28；度截止值：37，介数中心性（BC）：0.229，聚类系数（CC）：0.6131，以挑选出网络中关联性最强的核心簇。然后应用CytoHubba 插件对蛋白质-蛋白质相互作用网络及核心簇进行分析，获取网络拓扑参数。选择在蛋白质-蛋白质相互作用网络及核心簇中高度共享的靶点作为关键靶点，并在DisGeNET数据库（http：//www.disgenet.org/search）中进行检索，获取这些关键靶点的蛋白质类别。

1.3.6 基因本体和通路富集分析

京都基因与基因组百科全书富集分析（KEGG）用于识别生物学功能及候选靶点。对共同靶点进行基因本体富集分析（GO）和京都基因与基因组百科全书KEGG。

1.3.7 分子对接验证

利用 Autodock 软件中的配体对接模块验证结果的可靠性，通过对接分数评估化合物与关键靶点之间的结合活性。所有化合物的结构均从 PubChem 数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载，关键靶点的三维结构从蛋白质数据银行（PDB）（http：//www.rcsb.org/PDB/home/home.do）获取。对接分数的绝对值越高，小分子与蛋白酶靶点的结合能力越强。

1.3.8 原代大鼠肺血管平滑肌细胞的提取方法

取雄性SD大鼠（体质量200~250 g），麻醉后处死大鼠，开胸暴露心肺，剪取肺血管分支，立即将血管放入预冷的无菌PBS或DMEM中运输，保持4 ℃以降低细胞自溶风险，用显微镊剥离外膜脂肪及结缔组织；纵向剪开血管，无菌棉签轻刮内膜去除内皮细胞（避免残留内皮影响纯度）；采用"压推法"（两把弯镊交替加压推动血管壁）分离中膜，保持中膜完整性，将中膜剪碎至1~2 mm³碎片，加入3 mL胶原酶消化液（37 ℃水浴，消化20~30 min），加入含血清培养基终止消化，300~800 r/min离心5 min去除酶液，使用100 μm细胞滤网过滤去除未消化组织块。将所得细胞悬液接种于含20%胎牛血清的DMEM培养基。

1.3.9 Western blotting

细胞在RIPA裂解缓冲液中裂解，然后收集细胞蛋白，在12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS–PAGE）上进行分离，并转印到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。在5%脱脂牛奶中封闭后，按1∶2000稀释的一抗孵育过夜。用TBST洗涤3次后，用按1∶5000稀释的二抗孵育膜2 h。按照说明书使用ECL检测系统监测信号。

1.3.10 免疫荧光（IF）

PASMC贴附在培养玻片上后，贴壁后按照分组干预24 h，先用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，然后4%多聚甲醛固定10 min，室温孵育，并用0.3%曲拉通X-100进行透化处理10~20 min，接着在5%牛血清白蛋白中封闭10 min。与一抗1∶200孵育后，用PBS洗涤细胞，再与Alexa Fluor 偶联的二抗1∶200一起培养。最后使用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染料进行细胞核检测。使用共聚焦显微镜进行成像。

1.3.11 体外实验设计

原代SD大鼠肺血管平滑肌细胞常规培养于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中（37 ℃、5% CO₂），待细胞融合度达80%时传代。实验采用三气培养箱（BEND）建立缺氧模型：将细胞置于含1% O₂、94% N₂、5% CO₂的缺氧环境中持续24 h。对照组同步置于常氧培养箱（5% CO₂、95%空气）中处理 。细胞随机分为5组（n=3生物学重复）：Control组：常氧培养，仅含培养基；Hypo组：缺氧处理24 h；Hypo+RLM组：缺氧处理同时分别加入低（100 μg/mL）、中（200 μg/mL）、高（300 μg/mL）浓度药物，药物溶解于纯水并与缺氧处理同步干预。

1.3.12 织免疫荧光

肺组织切片脱蜡，用柠檬酸钠进行抗原修复，并用0.3%曲拉通X-100进行透化处理。切片在室温下用快速封闭缓冲液封闭15 min。切片在 4 ℃下与一抗1∶200孵育过夜；洗涤后在室温下与Alexa Fluor偶联的二抗1∶200孵育1 h，并用DAPI复染。使用共聚焦显微镜进行成像。

1.3.13 动物造模及实验分组

使用1.0 mmol/L稀盐酸 作为溶剂，将野百合碱粉末完全溶解。溶解过程中需充分搅拌或超声处理，确保无结晶残留。在酸性溶解液中逐滴加入1.0 mmol/L氢氧化钠溶液，边滴加边监测pH值，直至溶液呈中性（pH≈7.0）。中和过程中可能出现短暂浑浊，继续搅拌至溶液澄清。根据实验需求用等渗盐水（如0.9% NaCl）调整溶液浓度，必要时通过滤膜（如0.22 μm无菌滤膜）过滤以去除杂质，现用现配。按照60 mg/kg体质量单次腹腔注射MCT溶液，然后在MCT注射后的4周时间点进行表型表征研究。对照大鼠按其体质量注射等量的溶媒。大鼠自由采食，每天检查1次。根据课题组前期研究^{［23， 24］}及相关文献支持^{［25， 26］}，将30只大鼠随机分为5组：对照组（NC）、MCT、MCT+金樱子［100 mg/kg，MCT+金樱子（200 mg/kg）］、MCT+金樱子（300 mg/kg），6只/组。根据我们之前的描述，单剂量MCT（60 mg/kg）腹腔注射建立MCT-PAH大鼠模型。治疗组RLM在MCT处理5 d后腹腔注射，1次/2 d。总暴露3周后，对大鼠进行进一步的血流动力学和病理评估，经胸超声心动图分析和组织解剖。

1.3.14 血流动力学评估

先预热动物加热垫，设置包含 Mikro-Tip导管传感器、MPVS Ultra压力-容积系统和 PowerLab数据采集系统（搭配LabChart 8软件）的 Millar导管系统，将导管尖端插入肝素钠生理盐水调右心室压至基线值。用5%异氟烷诱导麻醉动物，通过捏脚趾确认麻醉效果，麻醉后用呼吸面罩维持麻醉（1%~2%异氟烷），固定动物腹侧朝上。浸润颈外静脉处毛发后切开颈部右侧皮肤，在显微镜下（小鼠需用）钝性分离右颈静脉附近结缔组织，放两根缝合线并做相应处理后在静脉做切口插入导管。缓慢推进导管至右心室，待心率、呼吸频率和右心室压示踪稳定后记录1~2 min数据，用LabChart 8分析相关血流动力学数据，按公式估算肺动脉平均压。还可使用BIOPAC MP150数据采集系统评估大鼠右心室收缩压，以Fulton指数（右心室与左心室加间隔的比值）表示右心室肥厚情况。

1.3.15 超声心动图分析心功能

经胸超声心动图是一种无创而有效地检测PAH动物模型右心室功能的方法。首先，使用吸入异氟烷（1%~2%）麻醉动物，胸部备皮脱毛后固定于加热垫上，然后使用VisualSonics Vevo 2100超声系统探测右心功能（小鼠传感器探头：MS-550D，22~55 MHz；大鼠传感器探头：MS-250，13~24 MHz）。在胸骨旁长轴采用脉冲多普勒超声记录右心室道肺动脉血流流出量，测量肺动脉加速时间（PAT）和射血时间（PET）。在M型超声心动图上，从心尖四腔面测量三尖瓣环收缩偏移（TAPSE），将游标定位于外侧三尖瓣环面，测量三尖瓣环从舒张末期到收缩末期的纵向偏移量。胸骨旁长轴右心室流出道M型水平测量舒张末期右心室游离壁厚度（RVFWT）。记录影像用Vevo LAB 3.1.1软件进行测算和分析。

1.3.16 HE染色观察肺小动脉

收集冲洗干净的肺组织，游离左下肺，用4%多聚甲醛固定24 h，乙醇梯度醇洗及脱水，石蜡包埋。使用二甲苯将固定的肺组织切片，进行HE染色；使用显微镜观察和记录，拍照观察肺血管形态。

1.3.17 统计学分析

所有数据以均数±标准差表示；“n”表示各处理组的动物数或细胞实验数。对于无区组配对的多个样本比较使用One-way ANOVA检测，随后使用Bonferroni法进行组间的两辆比较。对于两个非配对样本比较则使用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 金樱子中活性成分及其靶点筛选结果

利用TCMSP数据库对有效成分的药理学和分子性质进行了研究，获得了7种活性成分：亚麻油酸乙酯，β-谷甾醇，山奈酚，顺式-11-二十碳烯酸，3-氢化松苓酸甲酯，4-甲基-N-甲基乌药碱，槲皮素。其二维结构如图１所示。

利用在线数据库确定特发性肺动脉高压和金樱子的潜在靶点。鉴定了大约220个金樱子靶基因和928个特发性肺动脉高压靶基因。发现了96个金樱子和特发性肺动脉高压的共同靶点（图2A）。利用Cytoscape 3.8.0构建了“疾病-活性成分-靶点”网络图（图2B）。然后获取了化合物-靶点网络中各化合物的度值。亚麻油酸乙酯有100个潜在靶点，β-谷甾醇有44个，山奈酚有 102个，顺式-11-二十碳烯酸有80个，3-氢化松苓酸甲酯有75个，4'-甲基-N-甲基乌药碱有83个，槲皮素有98个。

2.2 金樱子治疗特发性肺动脉高压的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络及关键靶点分析

利用STRING数据库构建了PPI网络，其中包括105个节点和892条相互作用边（平均节点度数=16.8，局部聚类系数=0.611，PPI富集P值<1.0e-16）（图3）。为了识别关键靶点，使用了Cytoscape中的CytoHubba插件来分析度数大于28的核心集群。最终确定了5个表现出最高度值的靶点作为关键基因：原癌基因酪氨酸激酶（c-Src）、表皮生长因子受体（EGFR）、蛋白激酶B（AKT）、雌激素受体1（ERα）和过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）。

2.3 基因本体论和通路富集分析

金樱子治疗肺动脉高压（PAH）相关的基因在生物过程、细胞组分及分子功能中的富集分数（图4A）。生物过程：显著富集于“肽响应”（Enrichment Score=21）“外源性反应”（19）及“血压调节”（18）、抑制激酶（17）、磷代谢（16）；细胞组分：主要富集于“膜筏”、“膜微域”、“小窝”、“质膜筏”、“细胞前缘”；分子功能：核心功能为类固醇结合、蛋白酪氨酸激酶活性、血红素结合、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、四吡咯结合。KEGG通路富集分析显示（图4B），金樱子干预后显著影响10条核心信号通路。其中钙信号通路富集最为显著（富集因子=12.5，-log₁₀P=14），涉及基因数量最多（气泡面积=20）。其他关键富集通路包括：血管重构相关通路：VEGF signaling、PI3K-Akt signaling。激素调控通路：Estrogen signaling、Oxytocin signaling。细胞应激通路：MAPK signaling、HIF-1 signaling。

2.4 通过分子对接验证结果

对7种化合物与5种目标蛋白进行了分子对接，并列出了每种配体与目标蛋白对接后的结合能数值，以表格形式呈现（图5A），结合能最高的前5个分子对接的三维结构见图5B~F。

2.5 金樱子的生物安全性和抑制平滑肌细胞增殖作用的研究

浓度为0~300 μg/mL的金樱子对PASMC细胞无明显毒性，300 μg/mL时细胞活性达到80%（图6A）。因此，体外实验选用浓度为100、200和300 μg/mL的金樱子进行后续研究。金樱子处理可减少缺氧诱导的细胞增殖（图6B）。

Western blotting显示金樱子处理可降低缺氧导致的PCNA上升。与缺氧模型组（Hypo+PBS）相比，Hypo+RLM（100）组PCNA水平下降（P<0.05），Hypo+RLM（200）组（P<0.001）和Hypo+RLM（300）组（P<0.001）抑制作用更为显著（图6C）。

免疫荧光检测发现，缺氧处理后，增殖细胞核抗原（PCNA）显著升高（与常氧组相比，P<0.05）。金樱子处理可剂量依赖性降低缺氧诱导的PCNA异常升高：与缺氧模型组（Hypo+PBS）相比，Hypo+RLM（100）组PCNA水平下降（P<0.05），Hypo+RLM（200）组（P<0.001）和Hypo+RLM（300）组（P<0.001）抑制作用更为显著（图6E），EdU实验同样佐证了这一结论（图6G）。

2.6 金樱子通过抑制Src-钙超载-AKT磷酸化轴发挥抗平滑肌增殖作用

缺氧（Hypo）组平滑肌细胞中 p-Src蛋白磷酸化水平较Control组升高2.5倍（P<0.001，图7A、B）；RLM处理后［Hypo+RLM（100）组］ p-Src磷酸化水平较Hypo组下降（P<0.01，图7A、B）。Hypo组p-AKT1（Ser473）磷酸化水平较Control组升高2.2倍（P<0.001）；Hypo+RLM（100）组p-AKT1磷酸化水平较Hypo组降低（P<0.001），证实RLM靶向抑制AKT1通路的激活（图7D）。Hypo组细胞内Ca²⁺浓度较Control组升高2.87倍（P<0.001，图7E），Hypo+RLM（100）组Ca²⁺浓度较Hypo组下降至73%（P<0.001，图7E）。

2.7 金樱子改善野百合碱（MCT）诱导的肺动脉高压大鼠的血流动力学变化

MCT造模组右心室收缩压（RVSP）较Control组升高（从21.5±3.21 mmHg vs 70.4±5.1 mmHg，P<0.001），平均右心室压（mRVP）从10.6±1.5 mmHg升至35.2±1.4 mmHg（P<0.001），且右心室肥厚指数Fulton Index ［RV/（LV+S）］从0.25±0.03增至0.68±0.05（P<0.001，图8A、B）。RLM治疗组以剂量依赖性方式显著逆转MCT诱导的血流动力学恶化：高浓度组（300 mg/kg）疗效明显高于低浓度组（100 mg/kg，图8B、C）。RVSP从MCT造模组的70.4±5.1 mmHg降至58.2±4.3 mmHg（P<0.01）和38.4±3.2 mmHg（P<0.001）；mRVP从35.2±1.4 mmHg降至30.1±3.6 mmHg和13.9±2.3 mmHg （P<0.05）；Fulton指数从0.68±0.05恢复至0.38±0.04和0.30±0.03（P<0.001，图8A、B）。

2.8 金樱子可改善MCT诱导的肺动脉高压大鼠的心功能障碍和右心衰

MCT处理导致PAT、PAT/PET比值和TAPSE下降（P<0.001），而RVESWT和RVEDWT升高（P<0.001，图9）。

2.9 RLM治疗抑制肺血管重构和MCT-PAH大鼠平滑肌细胞的增殖

在分离的主要含有PASMCs的PAs中，MCT-PAH大鼠的增殖细胞核抗原（PCNA）上调（P<0.001），MCT+RLM（300）组的增殖细胞核抗原（PCNA）正常化（P<0.001，图10A）。HE染色结果展示金樱子干预后肺动脉管腔狭窄变化（图10B）。

3 讨论

肺高压（PH）是指肺动脉平均压力≥25 mmHg（静息状态下右心导管测量值），伴随肺血管阻力进行性升高，最终导致右心衰竭甚至死亡的心肺血管疾病。PASMCs异常增殖是血管重构的核心。尽管已应用药物和手术干预来延缓肺动脉高压的进展，但目前的治疗效果仍不尽如人意。诸如前列环素类似物、内皮素受体拮抗剂、磷酸二酯酶—5抑制剂、可溶性鸟苷酸环化酶刺激剂等药物虽有一定益处，但现有药物主要靶向NO-cGMP、前列环素等血管舒张通路，对驱动血管重构的增殖信号轴（如钙超载、PI3K/AKT）干预不足，无法阻止肺动脉高压的进展，且存在一定副作用：长期使用易出现耐药性（如内皮素受体拮抗剂肝毒性、PDE5抑制剂停药反跳）。金樱子作为传统中药，既往研究证实其活性成分（槲皮素、山奈酚等）具有抗平滑肌痉挛、降脂抗炎及钙调节作用^［27-30］。本研究首次揭示其通过多靶点干预PAH核心增殖机制，为突破治疗瓶颈提供新策略。本研究筛选出金樱子中β-谷甾醇、山奈酚、槲皮素等7种核心成分，其作用靶点显著富集于钙信号通路（调控细胞内Ca²⁺浓度）和PI3K-AKT通路（介导细胞增殖）。这与PAH的核心病理机制高度契合：钙信号紊乱：缺氧激活电压门控钙通道（VDCC）和受体门控钙通道（ROC）^{［31， 32］}，导致PASMCs内钙离子超载（［Ca²⁺］i升高），驱动血管收缩与增殖。金樱子通过抑制Src磷酸化从而降低［Ca²⁺］i。Src-AKT1轴调控：Src和AKT1磷酸化是PAH中PASMCs增殖的关键驱动因子。细胞实验证实金樱子剂量依赖性抑制Src和AKT1磷酸化，直接阻断增殖信号传导；动物实验表明金樱子可以改善大鼠肺血管平滑肌细胞的增殖，初步揭示了金樱子治疗PAH可能作用机制。

PAH研究中，针对PASMCs增殖表型的模型构建是揭示疾病机制和药物开发的核心^{［33， 34］}。我们选择了低氧诱导的PASMC增殖模型进行RLM对平滑肌增殖的体外研究^［35］。缺氧是PAH的关键诱因之一，通过激活HIF-1α、PI3K-AKT通路等驱动PASMC增殖与凋亡抵抗^［36-38］。缺氧模型能清晰揭示钙信号、PI3K/AKT、ERK等通路的作用^［39-41］，便于靶点筛选。而且体外缺氧培养（如3% O₂）条件可控且重复性高，适用于药物筛选。MCT诱导的肺动脉高压病理特征与人类PAH高度吻合^［42］，适用于药物疗效评估。操作简便且成本可控。缺氧模型聚焦细胞代谢和增殖信号，适合分子机制研究。MCT模型全面模拟平滑肌细胞增殖、血管炎症、重构和右心衰竭，适合整体病理评估. 相比遗传模型：MCT和缺氧模型无需复杂基因编辑，成本更低且周期短；相比手术模型（如分流术）：避免手术创伤干扰，更聚焦于血管生物学机制。需要承认的是体外缺氧可能无法完全模拟体内微环境（如细胞间相互作用）。缺氧诱导的PASMC增殖模型和MCT诱导的肺动脉高压大鼠模型，既能精准解析PAH的细胞分子机制，又能整体评估病理进程和药物疗效。两者结合为PAH研究提供了从细胞到动物的多层次证据链，是肺动脉高压研究领域的主流方案。

研究表明，Src激酶与AKT1信号通路的交互作用（Src-AKT1轴）在调控细胞增殖、迁移及存活中具有枢纽地位^{［43， 44］}。低氧通过机械应力或氧化还原信号激活非受体酪氨酸激酶SRC，触发其自磷酸化（Tyr416位点）。活化后的SRC进一步磷酸化并激活PI3K^［45］，促进PIP3的生成，从而招募AKT1至细胞膜^［46］。PIP3结合AKT1的PH结构域后，PDK1磷酸化AKT1的 Thr308位点，随后mTORC2磷酸化Ser473位点，实现其完全激活。研究表明，低氧条件下AKT1的磷酸化水平显著升高，并通过下游 mTORC1信号驱动PASMCs增殖^{［34， 47， 48］}。根据Lan等^［48-50］的研究机械敏感通道Piezo1 在低氧下感知血流剪切力变化，通过钙离子内流激活 SRC，进而放大AKT1信号，提示Src-钙超载-AKT1 轴在PASMC增殖中的关键作用。靶向该轴的药物有望逆转PAH的血管重构病理进程。当前一线药物（如5型磷酸二酯酶抑制剂）主要针对NO-cGMP通路，而金樱子通过Src介导的钙信号调控提供新的干预维度，可能成为联合用药的理想候选；金樱子是一种中药化合物，其特点是毒性低，副作用比其他药物少，并且具有显著的抗增殖活性^［6］。Luo等^［15］的研究使用了金樱子的抗凋亡特性治疗阿霉素诱导的心肌损伤，其核心活性成分槲皮素可以调控钙离子受体^［20-22］。钙离子浓度升高在肺动脉高压的病理进展处于核心地位，但在肺动脉高压领域尚未有金樱子的应用。本实验发现金樱子对肺血管平滑肌细胞的钙离子浓度有明显调节作用，提示金樱子治疗肺动脉高压与钙信号调控相关。体外实验证实，RLM处理显著降低PASMCs内钙离子浓度和AKT磷酸化，提示其可能通过双重调控Src-AKT1轴和钙稳态抑制细胞增殖，这一发现与翟振国团队提出的PI3K/AKT通路在肺血管重塑中的核心作用相呼应^［51］，但进一步揭示了传统中药成分对上游激酶Src的调控优势。分子对接结果显示，RLM活性成分槲皮素与SRC蛋白的结合能（-8.7 kcal/mol）显著优于其他靶点，提示其可能通过直接结合抑制Src激酶活性，从而阻断AKT1的磷酸化级联反应。这与PAH中PI3K/AKT通路、钙信号通路过度激活的病理特征高度契合，提示调节Src/AKT通路、钙稳态可能成为未来药物研发的新方向，未来需通过空间转录组学验证两者在血管重塑中的协同效应。相较于现有PAH治疗药物（如内皮素受体拮抗剂、PDE5抑制剂）的单靶点作用，RLM通过β-谷甾醇、山奈酚、槲皮素等7种核心成分实现多靶点干预^［16］。这与雷帕霉素等mTOR抑制剂通过单一通路抑制增殖的策略相比，具有更广泛的抗重塑潜力和更高的生物安全性。

本研究首次通过多组学整合揭示了金樱子靶向Src-AKT1轴抑制PAH平滑肌增殖的分子机制，为天然药物干预PAH提供了新视角，为中药现代化提供范例：将网络药理学与多组学整合应用于传统中药机制解析；推动精准医疗：基于SRC-AKT1信号轴的分子分型可能指导PAH患者的个体化用药。这一发现不仅深化了对中药“多成分-多靶点”作用模式的理解，也为开发联合钙通道靶向药物的新型疗法提供了理论依据，推动中医药从经验科学向精准医学跨越。

在本研究中，我们基于网络药理学、分子对接与实验方法相结合的方式，揭示金樱子靶向“Src-AKT1轴”的抗PAH增殖机制，其多组分协同作用模式克服了单靶点药物的耐药性与副作用风险，为中药现代化提供新的见解。筛选出金樱子治疗PAH的潜在重要通路及所涉及的重要作用靶点。通过PPI与分子对接 我们筛选出结合能最高的5个靶点。结合KEGG和GO分析我们选择了和钙信号通路相关的Src和与细胞增殖密切相关的AKT1进行验证。体外实验证明金樱子抑制肺血管平滑肌细胞的Src和AKT1磷酸化。体内实验 超声和测压的结果证明金樱子可以改善MCT诱导的肺动脉高压和右心功能障碍。总之，金樱子对野百合碱诱导的肺动脉高压具有显著的保护作用，表现出抗增殖作用。我们的研究结果表明，金樱子是一种潜在的抗肺动脉高压药物候选物。然而，本研究也存在一些不足之处。本研究聚焦于PASMCs增殖机制，但仍存在一些局限：PH的血管重构也依赖内皮细胞、炎症介质与细胞外基质的串扰，单一关注平滑肌增殖未能全面反映PAH病理机制；机制深度不足：PASMCs行为受缺氧时序性、机械应力及表型转化的动态调控，静态模型难以模拟体内微环境；之后我们会开展更多研究解析多细胞、多机制参与的病理机制。

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