鬼箭羽通过抑制AGEs-RAGE信号转导通路改善晚期糖基化终末产物诱导的小鼠肾足细胞损伤

Guijianyu alleviates advanced glycation endproducts-induced mouse renal podocyte injury by inhibiting the AGEs-RAGE signaling pathway

摘要

目的 观察鬼箭羽对晚期糖基化终末产物（AGEs）刺激的小鼠肾足细胞（MPC-5）AGEs-晚期糖基化终末产物受体（RAGE）信号转导通路及下游靶点的影响，并阐明鬼箭羽改善糖尿病肾脏疾病（DKD）足细胞损伤的机制。 方法 鬼箭羽干预糖尿病肾脏疾病动物模型，利用透射电镜观察肾脏形态与结构；实时荧光定量-聚合酶链反应（RT-qPCR）、免疫组化检测相关基因与核心蛋白的表达情况。体外培养MPC-5，采用浓度为50 mg/L糖基化终末期产物-牛血清白蛋白（AGEs-BSA）培养液孵育24 h，诱导建立糖尿病细胞模型。利用CCK-8法检测技术，评价造模后的细胞成活率。将对数生长期的MPC-5随机分为正常组、模型组、鬼箭羽组、RAGE激动剂（D-Ribose）组、鬼箭羽+RAGE激动剂（D-Ribose）组，利用CCK-8法筛选不同浓度鬼箭羽对MPC-5细胞活力的影响。蛋白免疫印迹法检测各组细胞RAGE、VEGFA、TNF-α、NF-κB（p65）、IL-6、Caspase-3蛋白表达；RT-qPCR检测RAGE、NF-κB（p65）、VEGFA、IL-6mRNA表达。 结果 体内结果表明，鬼箭羽干预后，与模型组相比，干预组动物模型肾脏组织足细胞病理变化有所改善。免疫组化结果显示，与模型组比较，鬼箭羽高剂量组RAGE、VEGFA、NF-κB（p65）、IL-6蛋白表达降低（P<0.05）；RT-qPCR结果显示，与模型组比较，鬼箭羽高剂量组RAGE、NF-κB、IL-6mRNA表达降低（P<0.05）。体外结果表明，与正常组相比，模型组细胞活力显著降低（P<0.05），RAGE、NF-κB（p65）、VEGFA、TNF-α、IL-6和Caspase-3蛋白表达升高（P<0.05），RAGE、NF-κB（p65）、VEGFA和IL-6 mRNA表达升高（P<0.05）；与模型组比较，浓度为550 mg/L的鬼箭羽干预成模后的MPC-5，24 h提高细胞活力最为显著（P<0.05），降低RAGE、NF-κB（p65）、VEGFA、TNF-α、IL-6和Caspase-3蛋白表达（P<0.05）；而鬼箭羽+RAGE激动剂可逆转RAGE激动剂对MPC-5模型中RAGE、VEGFA、TNF-α、IL-6和Caspase-3蛋白表达的改变（P<0.05），同时与RAGE激动剂组比较，鬼箭羽+RAGE激动剂组RAGE、NF-κB（p65）、IL-6、VEGFAmRNA表达显著降低（P<0.01）。 结论 鬼箭羽可以通过抑制AGEs-RAGE信号转导通路的激活，减少下游促炎细胞因子和血管内皮生长因子的表达，进而发挥改善AGEs诱导糖尿病肾脏疾病MPC-5损伤的作用。

Abstract

Objective To investigate the mechanism by which Guijianyu ameliorates podocyte injury in a mouse model of diabetic kidney disease (DKD) induced by advanced glycation endproducts (AGEs). Methods Sixty db/db mouse models of DKD were randomized equally into 5 groups for treatment with saline, Guijianyu extract at 3 doses or irbesartan for 12 weeks, and the changes in renal pathology and structure were observed using transmission electron microscopy, and the expressions of related genes and key proteins were detected using RT-qPCR and immunohistochemistry. In cultured MPC-5 cells incubated with 50 mg/L AGEs-BSA for 24 h, the effect of different concentrations of Guijianyu extract on cell viability was examined with CCK-8 assay; Western blotting was performed to detect the protein expressions of RAGE, VEGFA, TNF-α, NF-κB(p65), IL-6 and caspase-3, and the mRNA expressions of RAGE, NF-κB (p65), VEGFA and IL-6 were detected with RT-qPCR. Results In mouse models of DKD, treatment with high-dose Guijianyu extract significantly reduced renal expressions of RAGE, VEGFA, NF-κB(p65), and IL-6 proteins and the mRNA expressions of RAGE, NF-κB, and IL-6. In MPC-5 cells, exposure to AGEs significantly reduced cell viability and increased the protein expressions of RAGE, NF‑κB (p65), VEGFA, TNF-α, IL-6 and caspase-3 (P<0.05) and mRNA expressions of RAGE, NF-κB (p65), VEGFA, and IL-6. Treatment with Guijianyu extract obviously improved cell viability and reduced the expressions of RAGE, NF-κB(p65), VEGFA, TNF-α, IL-6, and caspase-3. Furthermore, Guijianyu extract effectively reversed RAGE agonist-induced elevation of protein expressions of RAGE, VEGFA, TNF-α, IL-6, and caspase-3 and mRNA expressions of RAGE, NF-κB (p65), IL-6, and VEGFA in MPC-5 cells. Conclusion Guijianyu extract ameliorates AGEs-induced mouse renal podocyte injury in DKD by inhibiting the activation of AGEs-RAGE signaling pathway and reducing the expressions of pro-inflammatory cytokines and vascular endothelial growth factors.

Graphical abstract

关键词

鬼箭羽 / 糖尿病肾脏疾病 / 足细胞 / AGEs-RAGE信号通路 / 晚期糖基化终末产物

Key words

Guijianyu / diabetic kidney disease / podocytes / AGEs-RAGE signaling pathway / advanced glycation endproducts

糖尿病肾脏疾病（DKD）是一种严重的糖尿病并发症，占终末期肾脏疾病的30%~47%，且DKD的发病机制复杂，尚未完全明确^［1-4］。西医治疗DKD以控制血糖、血脂、血压等为主，无法阻止DKD病情进一步恶化^［5］。中医药治疗DKD具有明显优势，仝小林院士认为DKD的病位在“肾络”，其核心病机为虚、瘀、浊，治疗以滋补肝肾，活血通络为主^［6］。中药鬼箭羽始载于《神农本草经》，性寒，味苦，具有活血通经、祛风止痛、解毒消肿等功效^［7］。现代药理学研究表明其具有降血糖、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抑菌、抗炎、降血压等药理作用^［8］。相关研究显示，鬼箭羽可以通过单味药或者参与复方药的形式来改善肾小球损伤所导致的淤血症状，从而改善DKD^［9］。足细胞作为维持肾小球滤过屏障的关键细胞，其凋亡是DKD出现蛋白尿的主要原因^{［10， 11］}。晚期糖基化终末产物（AGEs）是由蛋白质和脂质的非酶糖化和氧化形成的，研究表明，足细胞对高AGEs环境非常敏感，AGEs可直接破坏肾足细胞，与晚期糖基化终末产物受体（RAGE）相结合，激活氧化应激、炎症并诱导足细胞凋亡等，加重DKD^［12-14］。

本研究团队前期通过网络药理学和生物信息学分析发现，鬼箭羽治疗DKD最主要的靶基因包括核因子-κB（NF-κB）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α），在候选的主要信号转导通路中AGE-RAGE糖尿病并发症信号转导通路位于前列^［15］。然而，鬼箭羽是否可以通过该通路调控其下游靶点，从而改善肾足细胞损伤达到治疗DKD的目的仍需进一步验证。基于以上研究报道，本课题组通过体内动物和体外细胞实验，探究中药鬼箭羽是否可通过AGEs-RAGE信号通路调控NF-κB、VEGFA、TNF-α、IL-6，从而改善小鼠肾足细胞（MPC-5）凋亡，达到干预DKD的目的。本研究可在一定程度上为深入开发鬼箭羽提供参考，丰富中医药治疗DKD的科学内涵，并为DKD相关研究启迪新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物

SPF级7周龄雄性db/db小鼠（n=60）和同窝雄性db/m小鼠（n=10）购于江苏集萃药康生物科技股份有限公司［SCXK（苏）2023-0009］，饲养于河南中医药大学动物实验中心［SYXK（豫）2021-0015］，室温19 ℃~25 ℃，相对湿度40%~55%；饮食饮水自由，适应性饲养1周后进入后续实验。本研究经河南中医大学动物伦理委员会批准后进行（伦理批号：IACUC-202302012）。

1.1.2 细胞

MPC-5由河南中医药大学中医药科学院团队赠送。

1.1.3 药物与试剂

鬼箭羽购自江阴天江药业有限公司，将原材料粉碎，加入10 倍量水进行煎煮3 次，煎煮后留滤液，3次滤液合并浓缩，冷冻干燥，-20 ℃保存。细胞给药时，用纯水溶解粉末配置浓度为50 mg/mL，使用0.22 μm滤膜过滤，现用先配。厄贝沙坦（江苏恒瑞医药股份有限公司）、RAGE激动剂（D-Ribose，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；含1%双抗1640基础培养基（北京索莱宝科技有限公司）；胎牛血清（苏州依科赛生物科技有限公司）；鼠γ-干扰素（IFN-γ，PeproTech）；糖基化终末期产物-牛血清白蛋白（AGE-BSA）（武汉艾美捷科技有限公司）；CCK-8试剂（GlpBio）；RAGE兔单克隆抗体、NF-κB（p65）兔单克隆抗体、IL-6兔单克隆抗体、VEGEA兔单克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；TNF-α抗体、β-actin（武汉塞维尔生物科技有限公司）

1.1.4 仪器

酶标仪（郑州金友宁仪器有限公司）；台式高速离心机（河南岳鼎科技有限公司），电热鼓风干燥箱（上海森信实验仪器有限公司）；包埋机（武汉俊杰电子有限公司）；病理切片机（武汉徕卡仪器有限公司）；正置光学显微镜（Nikon）、透射电子显微镜（Hitachi）；CO₂细胞培养箱（Thermo Fisher Scientific）；EclipsetS100型倒置显微镜（Nikon）；7500Fast实时荧光定量PCR仪（ABI）；PAC300型电泳及转膜装置及自动凝胶成像系统（Bio-Rad）。

1.2 方法

1.2.1 体内实验

1.2.1.1　动物分组、给药及取材

60 只db/db小鼠通过尾静脉取血，罗氏血糖仪检测血糖，连续3次（1次/d）随机血糖≥16.7 mmol/L、尿量为db/m小鼠的150%，且持续出现蛋白尿，均符合DKD模型标准。采用简单随机分组法将60只db/db小鼠分为5组，模型组，鬼箭羽低、中、高剂量组和厄贝沙坦组， 12 只/组。模型组灌胃生理盐水10 mL·kg^-1·d^-1，鬼箭羽低、中、高剂量组分别灌胃鬼箭羽溶液1.5、3.0、6.0 g·kg^-1·d^-1，厄贝沙坦组予厄贝沙坦水溶液20 mg·kg^-1·d^-1。10 只db/m小鼠为空白组，灌胃生理盐水10 mL·kg^-1·d^-1，共给药12 周。

给药干预12 周后，全部小鼠禁食不禁水12 h，待麻醉完全后，迅速取出肾脏，分离肾皮质，将其分割成1 mm³组织块，置于提前预冷的4%戊二醛固定液中固定，用于透射电镜的检测。麻醉完全后的小鼠摘眼球取血，3000 r/min（r=12 cm），离心15 min，取上清分装，冻存于-80 ℃冰箱用于后续血清学检测。左肾放置于4%的多聚甲醛中用于后续免疫组化检测；右肾先用液氮速冻，然后放置于-80 ℃储存，用于RT-qPCR检测。

1.2.1.2　电子显微镜观察足细胞超微结构

将固定的右肾用2.5%戊二醛浸泡4 h后，用磷酸盐缓冲盐水冲洗4 次，每次15 min，然后用1%锇酸固定1.5 h。用不同浓度的乙醇梯度脱水。包封聚合，半薄切片定位和超薄切片，切片厚度为50 nm。切片以饱和醋酸铀酰溶液和柠檬酸铅溶液染色后，用透射电子显微镜拍照。观察基底膜的厚度和细胞外基质的增殖情况。定量分析肾小球基底膜平均厚度，平均足突宽度及足突数量的代表性显微镜图像。

1.2.1.3 免疫组化法检测VEGFA、TNF-α、NF-κB、IL-6靶点的表达

利用小鼠肾组织石蜡切片放入环保型脱蜡液Ⅰ10 min-环保型脱蜡液Ⅱ10 min-环保型脱蜡液Ⅲ10 min-无水乙醇Ⅰ5 min-无水乙醇Ⅱ5 min-无水乙醇Ⅲ5 min-蒸馏水洗，柠檬酸（pH=6.0）抗原修复，放入3%双氧水溶液，室温避光孵育25 min，在组化圈内滴加3% BSA均匀覆盖组织，室温封闭30 min（一抗是山羊来源的用兔血清封闭，其他来源的用BSA封闭）。在切片上滴加用PBS稀释的NF-κB（p65）（稀释比为 1∶200）、 TNF-α（稀释比为 1 ∶500）、IL-6（稀释比为 1 ∶500）、 VEGFA（稀释比为1∶200），切片平放于湿盒 内 4 ℃孵育过夜，次日，洗涤后切片稍甩干在圈内滴加 与一抗相应种属的二抗（HRP标记，稀释比为1∶300）覆盖组织，室温孵育50 min。玻片置于PBS（pH=7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3 次、5 min/次。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。苏木素复染约3 min，自来水洗，苏木素分化液分化数秒，自来水冲洗，苏木素返蓝液返蓝，流水冲洗。将切片依次放入酒精、无水乙醇、正丁醇、二甲苯中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，封片胶封片后镜检。采用ImageJ软件计算得到免疫组化图片（×400）的阳性平均光密度值。

1.2.1.4 实时荧光定量-聚合酶链反应（RT-qPCR）检测RAGE、NF-κB、IL-6mRNA的表达

取小鼠肾脏组织20 mg，加入mRNA提取液进行淹没，提取总RNA。在20 μL的逆转录反应体系中合成cDNA。逆转录条件为：25 ℃ 5 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 s。取0.1 mL PCR反应板，加入2.5 μmol/L上下游引物各3.2 μL至反应体系中进行扩增。扩增条件为95 ℃预变性30 s，95 ℃变形15 s，60 ℃30 s退火、延伸，共40 个循环。反应后，利用熔解曲线及扩增曲线判断PCR反应的特异性。采用DNAStar软件包的PrimerSelect程序设计特异性引物，并由servicebio公司合成（表1）。

1.2.2 体外实验

1.2.2.1　细胞培养与分化

将MPC-5细胞置于10%的胎牛血清、400 mg/L IFN-γ、含1%双抗的1640培养基中，33 ℃、5%CO₂培养。待细胞贴壁生长之后，将细胞转至10%的胎牛血清、含1%双抗的1640培养基中，37 ℃、5%CO₂培养10~14 d分化。

1.2.2.2　细胞分组

将分化后的MPC-5细胞取对数生长期的细胞，无血清饥饿处理12 h后，对其进行随机分组：空白组、模型组（AGEs50 mg/L）、鬼箭羽组（150、350、550、750 mg/L+50 mg/LAGEs）、RAGE激动剂（50 mmol/LD-Ribose+50 mg/LAGEs）组^［16］、鬼箭羽+RAGE激动剂（550 mg/L鬼箭羽+50 mmol/LD-Ribose+50 mg/LAGEs）组；各组给药后置于37 ℃、5%CO₂培养箱培养24 h。

1.2.2.3　CCK-8法检测细胞活性

每孔100 μL细胞悬液，以1×10⁴ /孔的密度接种于96孔板中，培养至完全贴壁生长24 h后，12 h饥饿处理，按“2.2”项下给药，培养24 h，每孔加入10 μLCCK-8试剂，将96孔板在培养箱避光孵育1.5 h，酶标仪测定每组细胞的吸光度值（A_{450 nm}），细胞活性（%）=［（A_实验组-A_空白组）/（A_对照组-A_空白组）］×100%，计算细胞存活率。

1.2.2.4 Western blotting检测RAGE、VEGFA、TNF-α、NF-κB、IL-6蛋白的表达

从37 ℃恒温培养箱取出14 d分化结束的细胞，按“2.2”项下分组处理并收集各组细胞，每组加入200 μL含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA细胞裂解液，使细胞充分裂解，将细胞刮入1.5 mL EP管中，用12 000 r/min离心15 min，取上清得到总蛋白，采用BCA法对总蛋白浓度进行测定，加入蛋白上样缓冲液后变性，冷冻保存备用。按照十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）配制说明书选择合适配比的分离胶，各组取等量蛋白上样，电泳和半干转法转膜，将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉摇床室温封闭2 h，TBST洗涤3 次、10 min/次，加入稀释后的RAGE（稀释比为1∶15000）、NF-κB（p65）（稀释比为1∶3000）、TNF-α（稀释比为1∶1000）、IL-6（稀释比为1∶1000）、VEGFA（稀释比为1∶6000）和β-actin（稀释比为1∶3000）4 ℃过夜；TBST洗涤3 次，10 min/次，孵育二抗（稀释比为1∶5000），室温孵育1 h；TBST洗涤3 次，10 min/次，将膜置于暗盒中加入发光液与膜充分接触，用全自动化学发光分析仪检测，ImageLab软件读取条带灰度值。以β-actin为内参，通过ImageJ软件计算蛋白相对表达量。

1.2.2.5 实时荧光定量-聚合酶链反应（RT-qPCR）检测RAGE、NF-κB、IL-6、VEGFAmRNA的表达

弃去细胞样本中的培养基，用PBS洗2 遍，加入1 mLTrizol，轻柔吹打细胞，转入1.5 mL离心管中，室温静置5 min。加入100 μL氯仿涡旋并静置5 min，12 000 g、4 ℃、离心15 min。吸上层无色水，加500 μL异丙醇混匀，室温沉淀10 min，同上条件离心10 min，提取总RNA。在20 μL的逆转录反应体系中合成cDNA，后续步骤按“2.1.4”操作。

1.2.3 统计学分析

所有数据采用独立双机双份录入，并核查一致率。后续的数据分析采用SPSS26.0统计软件，定量资料以均数±标准差表示，定性资料以例数（构成比）表示，以P<0.05为差异有统计学意义。单因素分析定量资料如满足条件两组比较则采用两独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析，如不满足条件则采用秩和检验，多重比较采用LSD法，重复测量资料采用重复测量方差分析；定性资料采用卡方检验。

2 结果

2.1 体内实验结果

2.1.1 小鼠肾脏组织超微结构

正常组小鼠肾脏组织结构完整，足细胞足突排列整齐密集、无融合，肾小球基底膜厚度较为均匀致密，系膜区及基质部分无明显增生。与正常组小鼠相比，模型组小鼠足细胞足突大面积弥漫性融合，足突间孔隙消失，基底膜增厚明显。与模型组小鼠比较，鬼箭羽组各剂量组及厄贝沙坦组小鼠足突节段性融合减轻，基底膜异常增厚减轻，细胞结构改善，足突呈现齿梳状结构（图1）。

2.1.2 小鼠肾脏NF-κB（p65）、VEGFA、TNF-α、IL-6蛋白表达

免疫组化结果显示，与正常组比较，模型组细胞NF-κB（p65）、VEGFA、TNF-α、IL-6蛋白表达升高（P<0.05）；与模型组比较，鬼箭羽高剂量组和厄贝沙坦组小鼠肾脏NF-κB（p65）、VEGFA、TNF-α、IL-6蛋白表达降低，且接近正常组水平（P<0.05，图2，表2）。

2.1.3 小鼠肾脏组织RAGE、NF-κB（p65）、IL-6mRNA表达

RT-qPCR结果显示，与正常组比较，模型组小鼠肾脏RAGE、NF-κB、IL-6 mRNA表达升高（P<0.05）；与模型组比较，鬼箭羽低、中、高剂量组和厄贝沙坦组细胞RAGE、NF-κB、IL-6 mRNA表达降低，且接近正常组水平（P<0.05，表3）。

2.2 体外实验结果

2.2.1 模型鉴定

与正常组细胞相比，模型组细胞存活率降低，且接近正常组水平（P<0.01，表4）。

2.2.2 不同浓度鬼箭羽对DKD模型MPC-5细胞活力的影响

与模型组比较，鬼箭羽不同剂量组细胞存活率均明显增高（P<0.05）。与其他浓度组别相比，鬼箭羽浓度为550 mg/L组细胞存活率明显提高，且接近正常组水平（P<0.05，表4）。因此，后续实验选用鬼箭羽550 mg/L组作为药物处理剂量。

2.2.3 鬼箭羽对DKD模型MPC-5细胞活力的影响

与正常组比较，模型组细胞活力显著降低（P<0.01）；与模型组比较，鬼箭羽组细胞活力升高，且接近正常组水平（P<0.01），RAGE激动剂组细胞活力降低（P<0.05）；与鬼箭羽组相比，鬼箭羽+RAGE激动剂组细胞活力降低（P<0.05，表5）。

2.2.4 鬼箭羽对DKD模型MPC-5细胞中RAGE、VEGFA、TNF-α、NF-κB（p65）、IL-6、Caspase-3蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组细胞RAGE、NF-κB（p65）、VEGFA、TNF-α、IL-6、Caspase-3蛋白表达升高（P<0.01）；与模型组比较，鬼箭羽组RAGE、NF-κB（p65）、VEGFA、TNF-α、IL-6、Caspase-3蛋白表达降低，且与正常组水平相近（P<0.01，P<0.05），RAGE激动剂组RAGE、NF-κB、VEGFA、TNF-α、IL-6、Caspase-3蛋白表达升高（P<0.01，P<0.05）；与鬼箭羽组比较，鬼箭羽+RAGE激动剂组RAGE、NF-κB（p65）、VEGFA、TNF-α、IL-6、Caspase-3蛋白表达升高（P<0.05，图3、表6）。

2.2.5 鬼箭羽对DKD模型MPC-5细胞中RAGE、NF-κB、IL-6 mRNA表达的影响

与正常组比较，模型组细胞RAGE、NF-κB、VEGFA、IL-6mRNA表达升高（P<0.01）；与模型组比较，鬼箭羽组RAGE、NF-κB、IL-6、VEGFA mRNA表达降低，且与正常组水平相近（P<0.01，P<0.05），RAGE激动剂组RAGE、NF-κB、IL-6、VEGFA mRNA表达升高（P<0.01，P<0.05）；与鬼箭羽组相比，鬼箭羽+RAGE激动剂组RAGE、NF-κB（p65）、IL-6、VEGFA mRNA表达升高（P<0.05，表7）。

3 讨论

DKD以持续性蛋白尿和进行性肾功能减退为核心临床特征，具有发病率高、治疗手段有限、预后较差等特点^［17］。肾小球滤过屏障由内皮细胞、基底膜、系膜细胞和足细胞构成，其中足细胞的结构和功能损伤是导致肾小球滤过功能障碍和蛋白尿的关键因素^［18］。随着DKD的进展，代谢紊乱、炎症反应、氧化应激及内质网应激等机制可进一步诱发足细胞损伤，甚至导致异常凋亡、自噬或坏死^［19］。足细胞损伤的主要表现包括：足细胞标志物（WT-1）表达减少、足突融合、裂隙隔膜功能障碍，由于足细胞再生能力有限，其损伤会加速DKD进展，因此保护足细胞对防治DKD至关重要。

目前临床针对DKD的治疗新策略主要聚焦于抗炎、抗氧化应激及抗肾脏纤维化等靶点。现代医学常规治疗以血糖、血压、血脂调控及蛋白尿管理为主，虽能取得短期疗效，但存在远期预后不佳、乳酸酸中毒及高钾血症等不良反应风险。在中医理论体系中，DKD可归属于“水肿”“肾消”“尿浊”“癃闭”“关格”等病证范畴。历代医家在DKD诊治方面积累了丰富的临床经验。现代临床研究表明，闫镛^［20］、赵进喜^［21］、孔薇^［22］等运用鬼箭羽治疗糖尿病及慢性肾病均取得了显著疗效。鬼箭羽首见于《神农本草经》，因其干燥枝干具直棱如箭羽，形似持箭防卫之态，故又名"卫矛"。本品性味苦寒，主入足厥阴肝经，具有破血通经、散瘀止痛、解毒杀虫之功效^{［6， 23］}。同时现代药理研究表明，鬼箭羽在DKD治疗中具有多重药理作用，包括抗肾脏纤维化、抗炎、抗氧化等肾脏保护效应，同时兼具降糖、降压、心血管保护及调节血脂等综合治疗优势^［21］。鬼箭羽对于DKD的疗效多见于组方，其单独的疗效以及实验验证类的研究较为匮乏。

本课题组前期研究证实，鬼箭羽对于DKD小鼠的肾脏结构以及功能的改善起到关键作用^［24］。研究表明，多种损伤因素（如阿霉素、嘌呤霉素、Ang-II、TGF-β、高糖及AGEs）均可通过增强氧化应激反应引发足细胞损伤^［25］。其中，AGEs主要通过改变血浆及细胞外基质蛋白的结构与功能（尤其是诱导蛋白质交联）或通过与受体（如RAGE）及结合蛋白相互作用发挥毒性作用^［26］。在系膜细胞和内皮细胞中，AGEs-RAGE相互作用会显著增加氧自由基生成，进而激活NF-κB信号通路，促进促炎细胞因子（IL-6、TNF-α）、生长因子（TGF-β1、IGF-1）及粘附分子（VCAM-1、ICAM-1）的释放^［27-29］。高糖状态下，由于活性氧（ROS）生成增加或抗氧化防御系统功能不足，导致ROS累积并引发氧化应激。这一过程在调控细胞内关键信号通路的激活中发挥重要作用^［30］。细胞外AGEs通过与足细胞膜上的RAGE结合，加速足细胞损伤进程，因此RAGE已被视为潜在的治疗靶点。损伤的足细胞可以释放趋化因子，诱导单核细胞和炎性细胞因子的募集，导致肾小球炎症^［31］。除了促进局部炎症外，足细胞还表达各种炎症细胞因子的受体，因此是促炎环境有害作用的潜在靶点^{［32， 33］}。此外，AGEs-RAGE相互作用还会加剧VEGFA与一氧化氮（NO）信号通路的异常串扰，进一步促进氧化应激水平升高^［35-36］。

为进一步阐释鬼箭羽改善DKD的作用机制，前期通过网络药理学和生物信息学对于鬼箭羽治疗DKD的潜在靶点与通路进行预测，AGEs-RAGE信号通路位于候选通路前列。随后，本研究选取了该通路上的关键靶点RAGE、NF-κB、IL-6、VEGF、TNF-α分别进行体内外实验验证。利用在体动物实验验证鬼箭羽通过调控AGEs-RAGE信号通路改善DKD模型小鼠肾脏损伤，与正常组小鼠相比，模型组小鼠足细胞足突大面积弥漫性融合，足突间孔隙消失，基底膜增厚明显；小鼠肾脏RAGE、NF-κB（p65）、VEGFA、TNF-α、IL-6蛋白表达升高，RAGE、NF-κB、IL-6mRNA表达升高，提示AGEs-RAGE信号通路处于激活状态，小鼠肾脏存在炎性损伤，足细胞功能及骨架结构受损。与模型组小鼠比较，鬼箭羽组各剂量组及厄贝沙坦组小鼠足突节段性融合减轻，基底膜异常增厚有所减轻，足突呈现齿梳状结构；鬼箭羽高剂量组和厄贝沙坦组小鼠肾脏NF-κB（p65）、VEGFA、TNF-α、IL-6蛋白表达降低；鬼箭羽低、中、高剂量组和厄贝沙坦组细胞RAGE、NF-κB、IL-6mRNA表达降低。说明鬼箭羽能抑制AGEs-RAGE信号通路改善小鼠肾脏组织损伤。

随后利用体外细胞实验在MPC-5模型中运用RAGE的激动剂D-核糖（D-Ribose），反向验证鬼箭羽通过调控AGEs-RAGE信号通路防治DKD的作用机制。结果发现，浓度为550 mg/L的含鬼箭羽的培养基促进细胞增殖效果最佳，而D-Ribose可逆转含鬼箭羽的培养基诱导的MPC-5细胞增殖和凋亡抵抗。进一步检测AGEs-RAGE信号通路及其下游炎症和凋亡相关因子水平，结果表明，鬼箭羽能够降低RAGE、NF-κB、VEGFA、IL-6、TNF-α、Caspase-3蛋白和RAGE、NF-κB、IL-6、VEGFAmRNA表达，D-Ribose可逆转鬼箭羽对MPC-5中RAGE、NF‑κB、VEGFA、IL-6、TNF‑α、Caspase-3蛋白和RAGE、NF-κB、IL-6、VEGFAmRNA表达的改变。研究结果说明，鬼箭羽可抑制AGEs-RAGE信号通路减轻AGEs-BSA诱导的MPC-5细胞模型的损伤，减少炎性细胞因子及血管内皮生长因子水平的表达，并扭转细胞凋亡进一步恶化。

终上所述，鬼箭羽可以通过抑制AGEs-RAGE信号转导通路的激活，减少相关促炎细胞因子、血管内皮生长因子和凋亡因子的阳性表达水平，进而发挥改善AGEs诱导DKD小鼠足细胞损伤的作用。本研究为AGEs-RAGE信号通路的调控在DKD治疗中的作用提供新见解，同时为鬼箭羽的现代药理学研究及其潜在临床应用提供更科学的理论依据。

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