肉桂酸通过抑制TLR4减轻阿霉素诱导的小鼠心肌损伤铁死亡的发生

Cinnamic acid ameliorates doxorubicin-induced myocardial injury in mice by attenuating cardiomyocyte ferroptosis via inhibiting TLR4

摘要

目的 基于网络药理学技术结合动物实验探讨肉桂酸（CA）改善阿霉素心肌损伤（DIC）的可能机制。 方法 采用网络药理学分析得到CA改善DIC的关键靶点，并通过分子对接进行验证。6~8周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠被随机分为5组（6只/组）：Sham组、阿霉素（DOX）组、CA（25 mg/kg）+DOX组、CA（50 mg/kg）+DOX组、CA（100 mg/kg）+DOX和铁死亡抑制剂（Ferrostatin-1 5 mg/kg）+DOX组。超声心动图和HE染色观察心肌组织病理变化；检测小鼠血清 CK-MB、LDH、MDA、IL-6、TNF-α和心肌ROS水平。蛋白免疫印迹检测心肌组织中TLR4及铁死亡通路相关蛋白表达水平。构建慢病毒介导的基因稳定敲低TLR4的小鼠心肌HL-1细胞株，细胞分为6组：阴性对照组（NC）；DOX模型组（DOX）；铁死亡诱导剂组（Erastin）；低表达组（si-TLR4组）；DOX+si-TLR4组；Erastin+si-TLR4组。CCK8测定细胞活力；荧光探针检测细胞ROS含量变化；免疫荧光检测GPX4蛋白的表达。 结果 通过网络药理学分析获得交集靶点28个，KEGG富集分析显示，CA可能通过Toll样受体信号通路作用于DIC。动物实验显示，与Sham组相比，DOX组超声心动图和HE 染色结果显示心脏损伤，血清CK-MB、LDH、MDA、炎症因子和心肌ROS水平升高（P<0.01），SLC7A11和GPX4蛋白表达降低，TLR4和PTGS2蛋白表达升高（P<0.05）。经CA处理后，心超功能指标水平升高（P<0.05）；血清 CK-MB、LDH、MDA、炎症因子和心肌ROS水平降低（P<0.05）；CA和铁死亡抑制剂使心肌组织SLC7A11和GPX4蛋白表达升高，TLR4和PTGS2蛋白表达降低（P<0.05）。低表达TLR4细胞株中，与NC组相比，DOX组和Erastin组细胞，ROS水平升高（P<0.001），GPX4蛋白表达降低（P<0.001）；与DOX组和Erastin组相比，DOX+si-TLR4组和Erastin+si-TLR4组细胞ROS水平降低（P<0.05），GPX4蛋白表达升高（P<0.01）。 结论 CA减轻小鼠DIC，其机制可能与抑制TLR4减轻铁死亡有关。

Abstract

Objective To explore the mechanism of cinnamic acid (CA) for improving doxorubicin-induced myocardial injury (DIC) in mice. Methods Network pharmacology analysis was used to obtain the key targets of CA and DIC. Male C57BL/6J mice were randomized into Sham, DOX, CA (25, 50 and 100 mg/kg)+DOX, and CA+Ferrostatin-1+DOX groups, and their myocardial function and pathology were examined by echocardiography and HE staining. Serum levels of CK-MB, LDH, MDA, IL-6, TNF‑α and myocardial ROS level were detected, and the expression levels of TLR4 and ferroptosis pathway proteins in myocardial tissue were detected by Western blotting. Cultured murine cardiomyocytes (HL-1 cells) with or without transfection with a small interfering RNA targeting TLR4 (si-TLR4) were treated with DOX or Erastin, and the cellular ROS content was measured by DCFH-DA staining; the expression level of GPX4 was detected using immunofluorescence staining. Results Network pharmacology analysis suggested that CA may improve DIC through TLR4 signaling. DOX treatment caused obvious myocardial injury in mice, which showed significantly increased serum levels of CK-MB, LDH, MDA, IL-6, TNF-α and myocardial ROS level with decreased myocardial levels of SLC7A11 and GPX4 proteins and increased levels of TLR4 and PTGS2 proteins. All these changes in the mouse models were significantly alleviated by treatment with CA, and the mice receiving CA or ferrostatin-1 treatment exhibited increased myocardial expressions of SLC7A11 and GPX4 proteins and lowered expressions of TLR4 and PTGS2 proteins. In cultured HL-1 cells, treatment with DOX and Erastin both obviously increased intracellular ROS level and decreased cellular GPX4 expression level, and these changes were strongly attenuated by TLR4 interference. Conclusion CA, as a potent herbal monomer, can effectively alleviate DIC in mice by inhibiting TLR4-mediated ferroptosis.

Graphical abstract

关键词

肉桂酸 / 阿霉素心肌损伤 / 铁死亡 / TLR4 / 网络药理学

Key words

cinnamic acid / doxorubicin-induced myocardial injury / ferroptosis / Toll-like receptor 4 / network pharmacology

阿霉素（DOX）作为临床上常用的蒽环类抗生素，用于各种类型癌症（如乳腺癌、肺癌、卵巢癌和甲状腺癌）的治疗^［1］。尽管被批准用于治疗各种癌症，但是它会对机体的心脏功能造成损伤^［2］。DOX诱导的心脏毒性（DIC）限制了其在临床环境中的使用。铁死亡是DOX发挥其心脏毒性的途径之一，是一种涉及由铁过载和活性氧（ROS）诱导的脂质过氧化引起的程序性细胞死亡形式^［3-5］。铁死亡为研究DIC提供了新的靶点与方向。

桂枝和肉桂是生活中常用的中药，其主要化学成分是肉桂酸（CA）。药理学研究表明，CA不仅是一种低毒性的抗氧化剂，而且具有多种心血管保护作用^{［6， 7］}。有报道表明，CA可减少胆碱功能障碍和氧化应激，防治心肌缺血再灌注损伤 ^［8］；CA可以保护心肌细胞免受氧化还原失衡的影响^{［9， 10］}。基于CA的上述作用，我们推测CA在治疗DIC方面具有很大的潜力，但目前CA对DOX心肌损伤的保护作用和相关机制尚不清楚，缺乏CA的有效靶点与疾病相关靶点相互作用的研究。

近年来，网络药理学以系统生物学思想和数据为基础，通过网络方法解析药物、靶点和疾病之间的相互关系，根据分析结果研发和设计具有多种药理学效应的药物^{［11， 12］}。因此，本研究通过网络药理学及分子对接技术预测CA、DIC和铁死亡的潜在靶点，并通过体内和体外实验进行验证，探讨CA是否通过调控关键靶点来降低铁死亡，发挥抗DIC作用，为CA在预防和治疗DIC的基础机制研究和临床应用中提供新的见解及依据。

1 材料和方法

1.1 药物靶点预测

利用pubchem数据库（https：//pubchem. ncbi.nlm.nih.gov/）、Swiss target prediction数据库（http：//www. swisstargetprediction.ch/）对cinnamic acid进行检索，最后得到CA对应的活性靶点。

1.2 疾病靶点的获取

通过GeneCards基因数据库（https：//www.genecards.org/）、Disgenet数据库（https：//www.disgenet.org/）、OMIM数据库（https：//www.omim.org/），以“doxorubicin induced myocardial injury”作为检索词进行检索，汇总去重后获取DIC靶点，以“ferroptosis”作为检索词进行检索，和FerrDb铁死亡数据库汇总去重后获取铁死亡疾病靶点。

1.3 PPI互作网络构建及关键靶点筛选

将筛选出的药物靶点与疾病靶点输入维恩图在线作图网站（https：//www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/example.html），作为药物作用于疾病的预测靶点进行后续分析。将CA与DIC共有靶点输入STRING数据库（https：//string-db.org/cgi/inpu t.pl）进行PPI网络的构建，将生物种类设定为“Mus musculus”，“minimum required interaction score”设置为0.40，去除孤立靶点得到PPI网络。将STRING数据库得到的TSV文件导入到Cytoscape3.7.2软件中构建交集靶点间的PPI网络，通过centiscape2.2获得degree、closeness、betweenness值筛选，将交集基因中的关键基因可视化。

1.4 交集靶点的GO功能富集分析与KEGG通路富集分析

将得到的交集靶点上传至DAVID数据库中进行分析，获得交集靶点的细胞组分（CC）、分子功能（MF）和生物过程（BP）以及KEGG 通路等的关键信息。并利用微生信云平台将数据结果可视化，富集分析结果采用条形图和气泡图展现。其中，不同颜色节点代表不同类型富集结果，而其大小与明显程度正相关。

1.5 分子对接

通过PubChem数据库（https： //pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获得配体（CA）结构；通过PDB数据库获取核心交集靶点（受体）结构。由Autodock 和Pymol进行模型可视化处理。

1.6 动物、材料与试剂

6~8周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠（体质量18~22 g）（杭州子源实验动物科技公司生产许可号：20231023Abzz0105000452）。本研究经动物伦理委员会许可，动物的护理和处理严格遵守《实验动物管理条例》进行（伦理批号：［2024］第567号）。

肉桂酸（MCE）；异氟烷（深圳瑞沃德有限公司）；TNF-α、IL-6试剂盒（江苏晶美生物科技有限公司）；CK-MB和LDH测定试剂盒（南京建成生物工程研究所有限公司）；MDA试剂盒（APExBIO）；BCA蛋白试剂盒（碧云天）；PAGE凝胶试剂盒（雅酶生物公司）；PVDF膜、Immobilon Western和ECL试剂盒（Millipore）；DHE荧光探针、DAPI染液（碧云天）；Marker（美国赛默飞公司）；兔抗小鼠GPX4抗体、兔抗小鼠PTGS2抗体（Abcam）；兔抗小鼠SLC7A11抗体（Affinity）；兔抗小鼠TLR4抗体（Proteintech）；兔抗小鼠GAPDH抗体（Absin）；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（Biosharp）。

1.7 动物实验

1.7.1 小鼠模型建立与分组

小鼠适应性喂养1周后，随机分5组，6只/组。Sham组；阿霉素组（DOX 15 mg/kg组）；CA（25 mg/kg）+DOX组；CA（50 mg/kg）+DOX组；CA（100 mg/kg）+DOX组。CA采用灌胃的方式给药，灌胃14 d后单次腹腔注射DOX，Sham组小鼠腹腔注射等体积的生理盐水。为进一步验证铁死亡是否参与DOX诱导的心肌损伤，蛋白检测上补充铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1 5 mg/kg）+DOX组。小鼠给予DOX前2 h腹腔注射5 mg/kg Fer-1，其余同DOX组。

1.7.2 超声心动图评估小鼠心脏功能

吸入1%的异氟烷麻醉小鼠，剃除小鼠胸前区毛发，使用超高分辨率小动物超声系统进行评估。在M型超声模块下检测心率，计算左心室射血分数（LVEF）、缩短分数（LVFS）、每搏输出量（SV）和心输出量（CO），每只小鼠至少取3个心动周期，反映小鼠心脏的舒张和收缩功能。

1.7.3 小鼠心脏组织HE染色观察心肌形态变化

取出新鲜小鼠心脏，剪取部分心脏组织并固定在4%多聚甲醛中24 h，将组织乙醇梯度脱水，石蜡包埋后切片（6 μm），苏木精-伊红染色，光镜下（Nikon Eclipse E100）分析心肌组织结构变化。

1.7.4 DHE检测心肌组织ROS水平

剪取心肌组织放入O.C.T中包埋后液氮速冻，冷冻切片6 μm，10 μmol/L的DHE避光37 ℃孵育30 min，PBS洗涤5 min，之后加入浓度5 μg/mL DAPI染液避光37 ℃孵育10 min，PBS洗涤5 min，滴加抗荧光淬灭剂，显微镜下获得样品荧光图像，ImageJ软件分析荧光平均强度。

1.7.5 ELISA法检测各组小鼠血清中炎症因子TNF-α和IL-6的含量

收集小鼠全血放置2 h后，4 ℃低温离心机中12 000 r/min离心15 min，取上清液，按照试剂盒说明，按步骤测量各孔的吸光度，计算出各组血清TNF-α和IL-6的浓度。

1.7.6 血清CK-MB、LDH、MDA水平检测

MDA含量的测定：术后24 h，收集小鼠全血放置2 h后，4 ℃低温离心机中12 000 r/min离心15 min，取小鼠眼球血上清液，按照试剂盒操作说明进行操作，检测各孔的吸光度值A_{532 nm}，计算各组血清MDA含量。

CK-MB含量的测定：取小鼠眼球血上清液并用蒸馏水稀释5倍后检测，按照各试剂盒的操作说明进行操作，在酶标仪内340 nm读取吸光度值 A1，继续孵育3 min，读吸光度值A2，△A=A2-A1，根据1~3 min A值变化斜率代入公式CK-MB活力（U/L）=△A/min×F（反应系数=8360）得到各组小鼠CK-MB值。

LDH含量的测定：取小鼠眼球血上清液，按照各试剂盒的操作说明进行操作，室温放置5 min，测定吸光度值A_{440 nm}，根据LDH（U/L）＝（A_测定-A_对照）（/A_标准-A_空白）×C_标准（0.2 μmol/mL）×N（稀释倍数）×1000，计算出各组小鼠血清LDH含量。

1.7.7 Western blotting检测各组小鼠心脏组织中TLR4、SLC7A11和GPX4蛋白表达

取每只小鼠约10 mg心肌组织，加入200 μL裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1）提取组织总蛋白，BCA法测定各组蛋白浓度，加入5×蛋白上样缓冲液后，定量40 μg上样，电泳后将蛋白转至PVDF膜，用5%脱脂牛奶封闭PVDF膜2 h，兔抗小鼠TLR4抗体（1∶4000）、兔抗小鼠PTGS2抗体（1∶2000）、兔抗小鼠SLC7A11抗体（1∶2000）、兔抗小鼠GPX4抗体（1∶3000）和GADPH抗体（1∶6000）4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，然后将膜与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（1∶50 000）和山羊抗鼠二抗（1∶50 000）孵育2 h， TBST洗膜4次，发光化学发光成像系统曝光、显影。Image J软件分析各组蛋白表达水平。

1.8 细胞实验

1.8.1 心肌细胞模型建立与分组

构建慢病毒介导的基因稳定表达TLR4的小鼠心肌细胞（HL-1）细胞株后，将细胞分成以下6组：阴性对照组（NC）；DOX组（DOX 1 μmol/L）；铁死亡激活剂组（Erastin 10 μmol/L）；低表达TLR4组（si-TLR4）；DOX+si-TLR4组；Erastin+si-TLR4组。DOX组和Erastin组的处理时间为24 h。构建慢病毒介导的基因稳定表达TLR4的HL-1细胞株时，感染病毒的细胞中带红色荧光，所以荧光检测细胞ROS和GPX4水平时选择绿色荧光探针。

1.8.2 CCK-8检测细胞活性

96孔板中，按5000/孔接种，设置复孔。细胞生长至约50%时进行药物处理，完成后每孔加入10 μL CCK8和90 μL培养基，培养箱中反应1 h后测定A值，计算细胞的活性。

1.8.3 DCFH-DA检测心肌细胞ROS水平

细胞传代培养时，以5×10⁵/孔的密度将细胞接种到预先放置有处理过的24孔板中，培养至密度达50%~60%进行分组干预处理。1 μmol/L的DCFH-DA避光37 ℃孵育30 min，PBS洗涤5 min，10 μmol/L的DHE避光37 ℃孵育30 min，PBS洗涤5 min，之后加入浓度5 μg/mL DAPI染液避光37 ℃孵育10 min，PBS洗涤5 min，滴加抗荧光淬灭剂，显微镜下获得样品荧光图像，ImageJ软件分析荧光平均强度。

1.8.4 免疫荧光检测各组细胞GPX4的表达

将细胞接种至共聚焦小皿中，培养至密度达50%~60%进行分组干预处理。多聚甲醛室温固定30 min，用PBS清洗细胞3次，5 min/次，Triton X-100室温通透细胞10 min，5% BSA室温孵育30 min，PBS清洗细胞3次，5 min/次，每个小皿加入250 μL的GPX4一抗（稀释比1∶200），4 ℃过夜孵育，PBS清洗细胞3次，5 min/次，选择FITC标记山羊抗兔的荧光二抗避光孵育2 h，之后加入浓度5 μg/mL DAPI避光37℃孵育10 min，显微镜下获得样品荧光图像，ImageJ软件分析荧光平均强度。

1.9 统计学分析

利用GraphPad Prism 8.0进行统计学分析，并采纳单因素方差分析进行组间比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 药物靶点

利用pubchem数据库、Swiss target prediction数据库对cinnamic acid进行检索，最后得到CA对应的活性靶点共计1055个。

2.2 疾病靶点

通过GeneCards基因数据库、Disgene 数据库、OMIM数据库，以“doxorubicin induced myocardial injury”作为检索词进行检索，汇总去重后得到相关靶点1056个。以“ferroptosis” 作为检索词进行检索，和FerrDb铁死亡数据库汇总去重后得到相关靶点2623个。

2.3 PPI 互作网络构建及关键靶点筛选

将筛选出的药物靶点与疾病靶点输入维恩图在线作图网站（Venny 2.1.0），得到 28个交集基因（图1），将CA、DIC和铁死亡的交集靶点导入STRING数据库中获得PPI网络（图2A），节点代表靶点，边代表蛋白间相互作用关系，使用Cytoscape进行可视化，取平均数再次进行筛选得到核心靶点是前列腺素内过氧化物合成酶2（PTGS2）和Toll样受体4（TLR4）（图2B）。

2.4 GO 功能富集分析与 KEGG 通路富集分析

使用Metascape数据库对9个交集靶点进行GO及KEGG富集分析。GO结果显示靶点主要参与调节细胞对压力的反应、对蛋白质转运的调节、对氧化还原酶活性的调节、对活性氧代谢过程的调节等生物过程；细胞组分方面涉及细胞质的核周区域、膜架和突触后密度；具有磷酸酶结合、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合、蛋白激酶活性等生物活性（图3A）。KEGG通路分析结果显示，三者共同靶点涉及的通路主要有肿瘤坏死因子信号通路、C型凝集素受体信号通路、T细胞受体信号通路、Toll样受体信号通路、NF-κB信号通路等（图3B），其中，Toll样受体通路与本研究有关联。

2.5 分子对接结果

本研究使用Autodock 和Pymol软件对CA与Cytoscape筛选出的核心靶点PTGS2和TLR4进行分子对接，结合能的高低与对接构象的稳定性成反比，能量越低，小分子配体和靶点蛋白的结合效果越好。结果显示，CA与TLR4的结合能是-6.3 Kcal/mol，CA与PTGS2的结合能是-5.4 Kcal/mol（图4）。

2.6 小鼠在体内实验验证

2.6.1 CA对DIC小鼠模型心脏超声的变化

与Sham组相比，DOX组小鼠LVFS、LVEF、SV和CO都明显下降（P<0.01）；与DOX组相比，CA25 mg/kg+DOX、CA50 mg/kg+DOX和CA100 mg/kg+DOX组小鼠LVFS、LVEF、SV和CO均升高（P<0.05，图5）。

2.6.2 各组小鼠心脏组织HE染色

小鼠心脏HE染色显示，Sham组心肌纤维细胞完整，排列整齐，无坏死和炎症细胞浸润，心肌横纹清晰可见，排列较整齐，细胞核为深蓝色。DOX组心肌纤维断裂、心肌横纹模糊，部分消失，间质水肿，有红细胞渗出，炎症浸润，细胞核为淡蓝色。CA25 mg/kg+DOX、CA50 mg/kg+DOX和CA100 mg/kg+DOX组肌丝排列较整齐，形态学损伤有所改善（图6）。

2.6.3 各组小鼠心肌组织ROS的变化

与sham组相比，DOX组小鼠心肌组织心肌ROS水平明显升高（P<0.001。与DOX组相比，CA25 mg/kg+DOX、CA50 mg/kg+DOX和CA100 mg/kg+DOX组小鼠心肌组织ROS水平降低（P<0.001，图7）。

2.6.4 各组小鼠血清中炎症因子IL-6、TNF-α含量的变化

与Sham组相比，DOX组小鼠血清IL-6和TNF-α水平明显升高（P<0.01）。与DOX组相比，CA25 mg/kg+DOX、CA50 mg/kg+DOX和CA100 mg/kg+DOX组小鼠血清IL-6和TNF-α水平降低（P<0.05，图8）。

2.6.5 各组小鼠血清中CK-MB、LDH和MDA含量的变化

与Sham组相比，DOX组小鼠血清CK-MB、LDH和MDA水平明显升高（P<0.01）。与DOX组相比，CA25 mg/kg+DOX、CA50 mg/kg+DOX和CA100 mg/kg+DOX组小鼠血清CK-MB、LDH和MDA水平降低（P<0.05，图9）。

2.6.6 Western blotting检测各组小鼠心脏组织中TLR4、PTGS2、SLC7A11和GPX4的表达

与sham组相比，DOX组小鼠心肌组织SLC7A11和GPX4蛋白表达降低， TLR4和PTGS2蛋白表达升高（P<0.05）。与DOX组相比，CA25 mg/kg+DOX、CA50 mg/kg+DOX和CA100 mg/kg+DOX组心肌组织SLC7A11和GPX4蛋白表达升高，TLR4和PTGS2蛋白表达降低（P<0.05，图10）。

2.6.7 Western blotting检测各组小鼠心脏组织中TLR4、PTGS2、SLC7A11和GPX4的表达

与DOX组相比，CA+DOX组和Fer-1+DOX组心肌组织SLC7A11和GPX4蛋白表达升高，TLR4和PTGS2蛋白表达降低（P<0.05，图11）。

2.7 体外实验验证

2.7.1 Western blotting验证细胞转染效果

Western blotting所示，与感染阴性对照病毒细胞组相比，感染低表达慢病毒组小鼠心肌细胞检测到TLR4低表达（P<0.05，图12），成功构建了基因稳定低表达TLR4的HL-1细胞株。

2.7.2 CCK-8 检测细胞活性

用不同浓度的DOX（0.2、0.5、1、2、5 μmol/L）和Erastin（1、2、5、10、20 μmol/L）处理HL-1心肌细胞24 h，CCK-8实验测定细胞活力，根据计算出的DOX和Erastin的半数抑制浓度（IC₅₀），选择1 μmol/L DOX和10 μmol/L Erastin对细胞进行处理（P<0.01，图13）。

2.7.3 DCFH-DA检测心肌细胞ROS水平

荧光结果显示，与对照组相比，DOX组和Erastin组细胞ROS水平明显升高（P<0.001）。与DOX组比较，DOX+si-TLR4组细胞的ROS水平明显降低（P<0.05）。与Erastin组相比，Erastin+si-TLR4组细胞的ROS水平明显明显降低（P<0.05，图14）。

2.7.4 免疫荧光检测各组细胞GPX4的变化

荧光显示，与NC组相比，DOX组和Erastin组细胞GPX4荧光强度明显下降（P<0.001）。与DOX组比较，DOX+si-TLR4组细胞的GPX4荧光强度明显升高（P<0.05）。与Erastin组相比，Erastin+si-TLR4组能增加GPX4的表达水平（P<0.05，图15）。

3 讨论

临床上，DOX诱导的心脏毒性特征是左心室射血分数降低，心室壁厚度增加，心律失常和心力衰竭，严重时可导致死亡^［13］。本研究中，在DOX诱导小鼠心肌损伤模型中，我们观察到，与Sham组相比，DOX组小鼠LVEF、LVFS、SV和CO均明显下降；心肌纤维排列紊乱，组织间质水肿、炎性细胞浸润等，提示DOX诱导小鼠心肌损伤模型建立成功。此外，多项研究表明，DOX 通过上调心脏组织中促炎细胞因子的表达，如TNF-α、IL-1β、IL-6等，从而引发心血管疾病的发生^［14-18］。探讨心肌损伤的发病机制，寻找有效的保护措施，对于改善DOX心脏毒性，增加DOX的临床应用安全性具有重要临床意义。因此迫切需要探索DOX诱导心肌损伤的可能发病机制，并寻求减轻DOX诱导心肌损伤的药物。

有研究表明，铁死亡可能是DOX诱导的心肌细胞死亡的主要形式，过表达GPX4显著挽救了DOX诱导的铁死亡^{［19， 20］}。本研究中，DOX组小鼠血清CK-MB、LDH、MDA、IL-6和TNF-α水平明显升高；心肌ROS水平明显升高，心肌组织SLC7A11和GPX4蛋白表达降低，PTGS2蛋白表达升高。提示DOX诱导小鼠心肌损伤显著，发生炎症反应和氧化应激损伤，并伴有铁死亡的发生。因此，靶向铁死亡的治疗可能是DIC的新预防策略。

有研究表明，CA可使丙二醛减少，促进超氧化物歧化酶的升高，减轻心肌细胞氧化应激损伤 ^{［21， 22］}。这表明CA具有抗炎、抗氧化等特性。我们推测CA可能对DOX诱导的心肌损伤发挥保护作用。但CA是否能够减轻DOX诱导的心肌损伤未见报道。本研究结果显示，使用CA进行预处理后，小鼠心肌损伤减轻；血清CK-MB、LDH、MDA、IL-6和TNF-α水平降低；心肌ROS水平降低，SLC7A11和GPX4蛋白表达升高，PTGS2蛋白表达降低。CA各浓度组之间差异无统计学意义。以上结果提示，CA可显著降低DOX引起的氧化应激和炎症水平，并通过抑制铁死亡减轻心肌组织损伤。CA可在DOX诱导的心脏毒性模型中起到保护剂的作用，但其具体的保护机制不详。

近年来，网络药理学被广泛应用于中药方剂及单体对疾病的药理作用及其机制研究、复方新适应证发现和网络毒理学研究等^{［23， 24］}。本研究通过网络药理学分析发现，CA、DIC和铁死亡的交集靶点28个；利用Cytoscape 3.7.2软件，以Degree值>5作为条件，筛选核心靶点，构建PPI网络图，其中核心靶点包括PTGS2、TLR4等。将交集基因进行GO基因功能和KEGG信号通路富集分析，KEGG信号通路富集分析筛选出排名前30的信号通路包含TNF-α、Toll样受体信号通路、NF-κB等主要信号通路。分子对接结果显示，CA与TLR4的结合能较好。因此，本课题组选择CA对DOX心肌损伤TLR4依赖的铁死亡机制开展研究。

越来越多的证据表明，DOX介导的心脏毒性与心肌TLR4的表达上调有关^［25-28］。DOX诱导的心脏不良反应在TLR4敲除小鼠中有所缓解^{［29， 30］}。有研究表明，TLR4的激活可以上调NADPH氧化酶4的表达，增加细胞内ROS水平，从而诱导铁死亡，通过靶向TLR4并调节Keap1/Nrf2信号通路，显著抑制炎症和铁死亡^［31］。Chen等^［32］发现，TLR4的表达可以通过上调p53作用于SLC7A11并抑制SLC7A11和GPX4的表达，从而诱导铁死亡；抑制TLR4的表达改善铁死亡相关指标和炎症环境。本研究中，我们观察到，DOX组小鼠心肌TLR4蛋白表达水平升高，结合文献和我们的实验结果，我们推测，TLR4的信号转导参与了DOX诱导的心脏毒性损伤。进一步使用铁死亡抑制剂Fer-1处理减轻了DOX诱导的心肌损伤，铁死亡关键蛋白SLC7A11和GPX4蛋白表达升高同时，TLR4蛋白表达水平降低，提示Fer-1可以通过下调TLR4的表达减轻铁死亡。不同浓度CA干预后，TLR4蛋白表达水平降低，SLC7A11和GPX4蛋白表达升高。以上结果提示CA可能通过降低TLR4表达从而抑制铁死亡的发生，减轻DIC。

心肌细胞模型上，CCK8实验测定了细胞活性，确定了DOX和Erastin处理细胞的条件。我们观察到与NC组相比，铁死亡激活剂Erastin和DOX均引起心肌细胞ROS水平升高，铁死亡标志蛋白GPX4蛋白表达降低，DOX诱导心肌细胞氧化应激损伤和铁死亡的发生。为进一步探讨TLR4与铁死亡之间的联系，我们采用低表达TLR4的心肌细胞，观察到，与DOX组相比，DOX+si-TLR4组细胞ROS水平降低，GPX4蛋白表达升高。与铁死亡诱导剂Erastin组相比，Erastin+si-TLR4组细胞ROS水平降低，GPX4蛋白表达升高，表明抑制TLR4的表达可以降低DOX和Erastin引起的铁死亡的发生，缓解心肌损伤，抑制TLR4可以作为一种潜在的策略，减轻铁死亡和相关炎症反应。

综上所述，本研究通过网络药理学、分子对接的方法对CA、DIC和铁死亡的靶点进行了预测并验证，并通过在小鼠DOX模型上验证，观察到DOX诱导小鼠心肌损伤时，CA可以减轻铁死亡的发生发挥心肌保护作用，其作用机制可能与抑制TLR4表达有关。

参考文献

[1] Sohail M, Sun Z, Li Y, et al. Research progress in strategies to improve the efficacy and safety of doxorubicin for cancer chemotherapy[J]. Expert Rev Anticancer Ther, 2021, 21(12): 1385-98. doi：10.1080/14737140.2021.1991316

[2] Prasanna PL, Renu K, Valsala Gopalakrishnan A. New molecular and biochemical insights of doxorubicin-induced hepatotoxicity[J]. Life Sci, 2020, 250: 117599. doi：10.1016/j.lfs.2020.117599

[3] Dixon SJ, Lemberg KM, Lamprecht MR, et al. Ferroptosis: an iron-dependent form of nonapoptotic cell death[J]. Cell, 2012, 149(5): 1060-72. doi：10.1016/j.cell.2012.03.042

[4] Cheng YF, Zak O, Aisen P, et al. Structure of the human transferrin receptor-transferrin complex[J]. Cell, 2004, 116(4): 565-76. doi：10.1016/s0092-8674(04)00130-8

[5] Yu H, Yang C, Jian L, et al. Sulfasalazine-induced ferroptosis in breast cancer cells is reduced by the inhibitory effect of estrogen receptor on the transferrin receptor[J]. Oncol Rep, 2019, 42(2): 826-38.

[6] Teschke R. Treatment of drug-induced liver injury[J]. Biomedicines, 2022, 11(1): 15. doi：10.3390/biomedicines11010015

[7] Pontiki E, Hadjipavlou-Litina D. Multi-target cinnamic acids for oxidative stress and inflammation: design, synthesis, biological evaluation and modeling studies[J]. Molecules, 2018, 24(1): E12. doi：10.3390/molecules24010012

[8] Song F, Li H, Sun JY, et al. Protective effects of cinnamic acid and cinnamic aldehyde on isoproterenol-induced acute myocardial ischemia in rats[J]. J Ethnopharmacol, 2013, 150(1): 125-30. doi：10.1016/j.jep.2013.08.019

[9] Sova M. Antioxidant and antimicrobial activities of cinnamic acid derivatives[J]. Mini Rev Med Chem, 2012, 12(8): 749-67. doi：10.2174/138955712801264792

[10] Takao K, Toda K, Saito T, et al. Synthesis of amide and ester derivatives of cinnamic acid and its analogs: evaluation of their free radical scavenging and monoamine oxidase and cholinesterase inhibitory activities[J]. Chem Pharm Bull: Tokyo, 2017, 65(11): 1020-7. doi：10.1248/cpb.c17-00416

[11] 王凤雪, 高 宇, 刘海波.中药网络药理学研究流程及代表性数据库工具[J].中国现代中药, 2021, 23(6): 1111-8.

[12] Lu SM, Yang B, Tan ZB, et al. TaoHe ChengQi decoction ameliorates sepsis-induced cardiac dysfunction through anti-ferroptosis via the Nrf2 pathway[J]. Phytomedicine, 2024, 129: 155597. doi：10.1016/j.phymed.2024.155597

[13] Volkova M, Russell R. Anthracycline cardiotoxicity: prevalence, pathogenesis and treatment[J]. Curr Cardiol Rev, 2011, 7(4): 214-20. doi：10.2174/157340311799960645

[14] Tacar O, Sriamornsak P, Dass CR. Doxorubicin: an update on anticancer molecular action, toxicity and novel drug delivery systems[J]. J Pharm Pharmacol, 2013, 65(2): 157-70. doi：10.1111/j.2042-7158.2012.01567.x

[15] Wang L, Chen Q, Qi H, et al. Doxorubicin-induced systemic inflammation is driven by upregulation of toll-like receptor TLR4 and endotoxin leakage[J]. Cancer Res, 2016, 76(22): 6631-42. doi：10.1158/0008-5472.can-15-3034

[16] Singla DK, Johnson TA, Tavakoli Dargani Z. Exosome treatment enhances anti-inflammatory M2 macrophages and reduces inflammation-induced pyroptosis in doxorubicin-induced cardiomyopathy[J]. Cells, 2019, 8(10): E1224. doi：10.3390/cells8101224

[17] Lan Y, Wang Y, Huang K, et al. Heat shock protein 22 attenuates doxorubicin-induced cardiotoxicity via regulating inflammation and apoptosis[J]. Front Pharmacol, 2020, 11: 257. doi：10.3389/fphar.2020.00257

[18] Hu S, Liu B, Yang M, et al. Carnosic acid protects against doxorubicin-induced cardiotoxicity through enhancing the Nrf2/HO-1 pathway[J]. Food Funct, 2023, 14(8): 3849-62. doi：10.1039/d2fo03904d

[19] Tadokoro T, Ikeda M, Ide T, et al. Mitochondria-dependent ferroptosis plays a pivotal role in doxorubicin cardiotoxicity[J]. JCI Insight, 2020, 5(9): 132747. doi：10.1172/jci.insight.132747

[20] Fang X, Wang H, Han D, et al. Ferroptosis as a target for protection against cardiomyopathy[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2019, 116(7): 2672-80. doi：10.1073/pnas.1821022116

[21] Xu F, Wang F, Wen T, et al. Protective effect of cinnamic acid in endotoxin-poisoned mice[J]. Phytother Res, 2017, 31(12): 1946-53. doi：10.1002/ptr.5944

[22] Koczurkiewicz-Adamczyk P, Klaś K, Gunia-Krzyżak A, et al. Cinnamic acid derivatives as cardioprotective agents against oxidative and structural damage induced by doxorubicin[J]. Int J Mol Sci, 2021, 22(12): 6217. doi：10.3390/ijms22126217

[23] 庄延双, 蔡宝昌, 张自力. 网络药理学在中药研究中的应用进展[J]. 南京中医药大学学报, 2021, 37(1): 156-60.

[24] 杜若丽, 云 琦, 王奕人, 等.白花丹素通过抑制JAK2/STAT3通路减弱焦亡对抗脓毒症心肌损伤[J].南方医科大学学报,2024,44(11):2209-19.

[25] Oo TT, Sumneang N, Ongnok B, et al. L6H21 protects against cognitive impairment and brain pathologies via toll-like receptor 4-myeloid differentiation factor 2 signalling in prediabetic rats[J]. Br J Pharmacol, 2022, 179(6): 1220-36. doi：10.1111/bph.15741

[26] Alanazi AM, Fadda L, Alhusaini A, et al. Liposomal resveratrol and/or carvedilol attenuate doxorubicin-induced cardiotoxicity by modulating inflammation, oxidative stress and S100A1 in rats[J]. Antioxidants: Basel, 2020, 9(2): E159. doi：10.3390/antiox9020159

[27] Li B, Cai XY, Wang YX, et al. Circ-SKA3 enhances doxorubicin toxicity in AC16 cells through miR-1303/TLR4 axis[J]. Int Heart J, 2021, 62(5): 1112-23. doi：10.1536/ihj.20-809

[28] Xu L, Wang C, Zou Z, et al. Ozone attenuated H9c2 cell injury induced by doxorubicin[J]. J Cardiovasc Pharmacol, 2021, 78(1): e86-93. doi：10.1097/fjc.0000000000001043

[29] Feng PP, Yang Y, Liu N, et al. Baicalin regulates TLR4/IκBα/NFκB signaling pathway to alleviate inflammation in Doxorubicin related cardiotoxicity[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2022, 637: 1-8. doi：10.1016/j.bbrc.2022.10.061

[30] Riad A, Bien S, Gratz M, et al. Toll-like receptor-4 deficiency attenuates doxorubicin-induced cardiomyopathy in mice[J]. Eur J Heart Fail, 2008, 10(3): 233-43. doi：10.1016/j.ejheart.2008.01.004

[31] Li YC, Huang LT, Li JL, et al. Targeting TLR4 and regulating the Keap1/Nrf2 pathway with andrographolide to suppress inflamm-ation and ferroptosis in LPS-induced acute lung injury[J]. Chin J Nat Med, 2024, 22(10): 914-28. doi：10.1016/s1875-5364(24)60727-2

[32] Chen D, Geng Y, Deng Z, et al. Inhibition of TLR4 alleviates heat stroke-induced cardiomyocyte injury by down-regulating inflamm-ation and ferroptosis[J]. Molecules, 2023, 28(5): 2297. doi：10.3390/molecules28052297

基金资助

国家级创新创业训练计划项目(202410367058)

蚌埠医科大学研究生科研创新项目(Byycx23003)

安徽省优秀科研创新团队项目(2022AH010083)

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