原发性肝癌患者的临床结局与治疗反应预测模型：基于失巢凋亡和免疫基因

Construction and verification of a prognostic model combining anoikis and immune prognostic signatures for primary liver cancer

摘要

目的 利用生物信息学方法构建原发性肝癌（PLC）的预后模型。 方法 在The Cancer Genome Atlas （TCGA）数据库中纳入了404名PLC患者。使用单变量 Cox 回归及LASSO-Cox方法构建失巢凋亡和免疫相关基因（DAIs）的预后模型。Kaplan-Meier法和受试者工作特征曲线用于评估模型的预测能力，建立列线图以方便临床应用。进行基因集富集分析（GSEA）揭示相关通路，并使用CIBERSORT和TIDE方法进一步探讨DAIs与肿瘤免疫微环境之间的关系。使用“pRRophetic”R包来计算PLC药物的半数最大抑制浓度（IC₅₀）。检测了PLC患者组织中SEMA7A的表达。 结果 构建并验证了基于7个DAIs（NR4A3、SEMA7A、IL11、AR、BIRC5、EGF和SPP1）的预后模型，在TCGA训练队列和GEO验证队列（GSE14520）中均发现一致的结果，即低风险组患者具有更好的临床预后和良好的免疫状态。将该预后模型与临床信息相结合，生成复合列线图以促进临床实践。体细胞突变分析显示TTN、TP53和CTNNB1突变占总突变比例最大，低风险-低TMB组生存率更高。药物敏感性分析显示高风险与低风险组之间以及TP53突变与非突变之间对化疗药物的敏感性存在差异。免疫组化结果显示SEMA7A在PLC中的表达高于癌旁正常肝组织（P<0.05）。 结论 本研究建立了一个基于DAIs的新的预测模型，用于预测PLC患者的临床结局和治疗反应，为个体化治疗提供新思路。

Abstract

Objective To establish a prognostic model for primary liver cancer (PLC) using bioinformatics methods. Methods Based on the data from 404 patients in the Cancer Genome Atlas (TCGA) database, we constructed a prognostic model integrating the differentially expressed genes, anoikis, and immune-related genes (DAIs) using univariate Cox regression and the LASSO-Cox approach. The predictive ability of the model was evaluated using Kaplan-Meier method and receiver-operating characteristic curves, and a nomogram was developed to facilitate its clinical applications. Gene set enrichment analysis (GSEA) was performed to explore the associated pathways and relationship between the DAIs and the tumor immune microenvironment, and the half-maximal inhibitory concentration (IC₅₀) of liver cancer drugs was calculated using the "pRRophetic" R package. We also detected the expression of SEMA7A in paired tumor and adjacent tissues from liver cancer patients. Results We constructed and validated a prognostic model based on 7 DAIs (NR4A3, SEMA7A, IL11, AR, BIRC5, EGF, and SPP1), and obtained consistent results in both the TCGA training cohort and GEO validation cohort (GSE14520), where the patients in the low-risk group were characterized by more favorable clinical outcomes and immune status. By integrating this prognostic signature with clinical information, a composite nomogram was generated. Somatic mutation analysis showed that TTN, TP53, and CTNNB1 mutations accounted for the largest proportion of total mutations, and the patients in the low-risk-low-TMB group had higher survival rate. Drug sensitivity analysis revealed differences in sensitivity to chemotherapeutic agents between high- and low-risk groups and between TP53 mutations and non-mutations. In clinical tissue specimens, SEMA7A expression was significantly higher in liver cancer tissues than in the adjacent tissues. Conclusions We established a new prognostic model based on DAIs for predicting clinical outcomes and therapeutic response of patients with primary liver cancer.

Graphical abstract

关键词

肝癌 / 失巢凋亡 / 免疫相关基因 / 预后模型 / 生物信息学

Key words

liver cancer / anoikis / immune-related genes / prognosis model / bioinformatics

原发性肝癌（PLC）是全球常见的消化系统恶性肿瘤，其发病率和死亡率居高不下。根据世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的2024年全球癌症负担数据显示^［1］，2022年全球肝癌新发病例达86.5万例，死亡病例75.8万例，分别位居全球恶性肿瘤发病谱第六位和死因谱第3位。值得注意的是，中国肝癌的疾病负担尤为沉重，其新发病例和死亡病例均居全球首位，已成为严重威胁我国居民健康的重大公共卫生问题。因此，建立有效的肝癌患者预后模型可以为临床治疗提供新的指导。

失巢凋亡是一种特殊类型的凋亡，由细胞与细胞外基质（ECM）的粘附不当或粘附丧失引起^［2］。ECM调节细胞生长和分化，并在许多细胞类型中作为存活因子发挥重要作用。正常上皮细胞通过细胞-细胞间连接和细胞-ECM相互作用维持其组织架构^［3］，而失巢凋亡则通过清除异常黏附的细胞来阻止其异常增殖。此外，失巢凋亡还参与组织稳态、发育和致癌过程等。许多激酶/磷酸酶信号分子作为中枢调控因子参与失巢凋亡^［4］，包括磷酸肌醇-3激酶相关信号、Raf-ERK相关信号、Jun N末端激酶等。肿瘤细胞通过获得失巢凋亡抵抗能力促进其转移扩散。研究发现，一些肿瘤病毒，包括EBV、HBV^［5］、代谢中间体（特别是氨基酸和核苷酸）^［6］以及自噬等^［7］，对于抗失巢凋亡至关重要。

肿瘤微环境的免疫特征在肝癌进展中扮演着关键角色。肿瘤微环境包含丰富的免疫细胞浸润，包括先天免疫细胞（巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞等）和适应性免疫细胞（T/B淋巴细胞）^［8］。其中，免疫抑制细胞通过抑制抗肿瘤免疫反应促进肿瘤免疫逃逸和转移。随着免疫检查点抑制剂（如抗CTLA-4和抗PD-1/PD-L1抗体）在临床的应用，免疫治疗已成为晚期肝癌系统治疗的重要突破，显著改善了部分患者的生存预后^［9］。然而，由于肝脏特有的免疫耐受特性及慢性炎症微环境，肝癌对免疫治疗的反应率仍不理想，需要更深入地解析肝癌免疫微环境的调控机制^［10］。

失巢凋亡相关基因（ARGs）的预后价值已在胃癌、肾癌、子宫内膜癌、胶质母细胞瘤等多种恶性肿瘤中得到验证^［11-14］，但失巢相关基因与免疫调控网络的交互作用在肝癌中尚未阐明。其次，目前尚缺乏整合失巢相关基因和免疫相关基因（IRGs）的预后预测模型。基于此，本研究拟系统分析DAIs在PLC中的预后价值，并重点探讨其与临床特征、免疫微环境、体细胞突变、信号通路和药物敏感性的相关性，以期为肝癌的精准治疗提供新的生物标志物和潜在治疗靶点。

1 资料和方法

1.1 基因表达和临床数据的获取

所用PLC患者的 RNA 测序数据、体细胞突变和相关临床信息数据均从 Cancer Genome Atlas （TCGA） 数据库（https：//portal.gdc. cancer.gov/）下载作为训练集。从Gene Expression Omnibus（GEO）数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）获取了GSE14520微阵列数据集和相关临床数据作为验证集。使用网站提供的注释文件来匹配基因符号。当多个探针与一个基因匹配时，取最高值。去重后，从GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）、Harmonizome数据库（https：//maayanlab.cloud/Harmonizome/）和美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库（https：//www. ncbi.nlm.nih.gov/）整合了740个ARGs。从ImmPort数据库（https：//immport.niaid.nih.gov）检索了1811个IRGs数据。通过STRING在线数据库绘制功能蛋白相关网络。

1.2 差异表达基因分析

为了获得PLC中的差异表达基因（DEG），我们使用R软件中的 DESeq2分析正常和肿瘤样本中所有基因的表达情况，以获得 DEG（|log2FC|>1且P<0.05）。最终获得了4182个DEGs。将 ARGs、DEGs 和 IRGs 取交集，通过网站 （https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/） 制作维恩图显示交叉基因（DAIs）。使用R包“pheatmap”展示PLC组织和癌旁正常肝组织中DAIs表达的差异。使用 “ggplot”R 包可视化DAIs 的 CNV频率。

1.3 预后模型的构建

通过基于DAIs的单变量Cox回归分析获得TCGA中的候选预后基因。使用“glmnet”R包对预后基因采用LASSO-Cox比例风险模型（迭代次数=1000）来开发Anoikis-Immune相关特征。风险评分等于每个基因表达的总和乘以相应的系数。根据TCGA和GSE14520队列中的中位风险评分将PLC患者分为高风险组和低风险组。使用多变量Cox回归分析评估风险特征的独立性。

1.4 预后特征的验证

使用“Survival”和“ROC”R 包进行时间依赖性受试者工作特征 （ROC） 曲线分析。使用“survival”和“survminer”R 包应用 Kaplan-Meier 生存曲线。

1.5 基于DAI的列线图的建立

使用“rms”R 包根据风险评分和其他临床特征创建了基于 DAIs 的列线图，以预测病例的临床结果。通过将列线图的预测能力与观察到的生存结果进行比较，绘制了校准曲线以估计 DAIs 的可靠性。

1.6 基因集富集分析（GSEA）

使用R软件包“DESeq2”识别高风险与低风险组之间的DEGs（|log2FC|>1且P<0.05），然后应用GSEA对基于Hallmark基因集的生物学通路进行检测。经过1000次替换后，收集P<0.05、FDR P<0.25的富集基因集。使用Omicshare网站（www.omicshare.com）对通过上述方法获得的TCGA数据库中的PLC差异基因进行GO和KEGG分析。

1.7 免疫特征分析

为探讨高风险组与低风险组患者的免疫浸润状态差异，我们使用CIBERSORT工具量化了22种免疫细胞比例，阈值为P<0.05。此外，我们还使用肿瘤免疫功能障碍和排斥（TIDE）网站（http：//tide.dfci.harvard.edu）来预测免疫治疗反应。

1.8 风险特征中的体细胞突变和 TMB

使用R包“mafool​​s”中的函数tmb从突变数据中计算TMB值，根据TMB中位数将患者分为高低TMB组，使用Wilcoxon检验比较高、低风险组的TMB评分。

1.9 药物敏感性分析

基于TCGA数据库，利用“pRRophetic”R包计算PLC药物的半数抑制浓度（IC₅₀），采用Wilcoxon符号秩检验分析高低风险组、TP53突变组与非突变组之间的差异。

1.10 免疫组化和人类蛋白质图谱分析

获取PLC患者的肿瘤及癌旁组织样本，按照标准免疫组化染色程序检测肿瘤及癌旁组织中SEMA7A的蛋白表达。将PLC组织及癌旁正常肝组织经10%甲醛固定、石蜡包埋、切片，选取最佳组织切片进行脱脂及标准免疫组化染色，最后脱水封片、镜检、图像采集及分析。抗体信息如Immunoway所述：SEMA7A（CD108；稀释度1∶100）。随机选取5个肿瘤组织显微镜视野，采用考虑染色强度和比例的半定量系统对所有标本进行分级。未染色、淡黄色、棕色和棕褐色细胞的阳性染色记为0、1、2、3分。阳性细胞比例以<10%、10%~25%、26%~75%、>75%分别记为0、1、2、3分。将上述两个分数相乘计算最终染色分数。两位研究者独立对选定区域的显微镜视野进行评分。然后将两组分数取平均值得到最终分数。0~3.5分代表“阴性或低表达”，4~9分代表“高表达”。

利用人类蛋白质图谱（HPA：https：//www.proteinatlas.org/）数据库探讨PLC与正常样本中DAIs的表达情况。

1.11 统计学分析

单因素及多因素分析使用Cox比例风险回归模型。对于两组间连续变量的比较采用独立样本t检验，数据不满足正态性、样本量小时，采用Wilcoxon检验；分类变量的组间差异通过卡方检验评估。多个组别采用单因素方差分析（ANOVA）进行组间差异检验。生存分析采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，并通过log-rank检验比较组间差异。所有统计分析均在SPSS 24.0和R 4.2.2软件平台上完成，统计显著性阈值设定为P<0.05。

2 结果

2.1 PLC和癌旁正常肝组织中DAI的获得和表达

从TCGA数据库下载PLC患者RNA表达及临床信息，通过将表达信息与临床信息进行匹配，选取至少50%样本表达的基因，获得404例PLC患者的临床信息及20 420个基因（图1）。

对TCGA临床资料进行整理，排除无生存信息、生存时间小于30 d、无病理分期的病例，获得351例样本。利用R软件包GESeq2在TCGA队列中鉴定DEGs。共鉴定出4182个DEGs，其中上调基因3135个，下调基因1047个（图2A）。然后，将这些DEGs与下载的失巢凋亡相关基因ARGs和IRGs进行交集，得到43个共同基因，即DAIs（图2B）。

蛋白质相互作用网络显示DAIs之间有很强的相关性（图2C）。同时，从GSE14520数据库中获取225例PLC患者的测序和临床信息进行验证。从TCGA和GEO数据库下载的PLC患者临床数据，包括年龄、性别、肿瘤分期等（表1）。

热图显示了TCGA数据库中PLC组织与癌旁组织中DAIs的表达情况（图2D），可以看出PLC组织与癌旁组织中DAIs的表达水平存在一定的差异。柱状图显示了DAIs的增益和丢失改变的频率（图2E），增益改变频率前5位的基因为S100A8、PTGS2、IL10、S100A11、TGFB2，而丢失改变频率最高的基因为AR、PAK3、TUBB3、EGF、SPP1。

2.2 基于7个DAIs的预后风险模型构建

排除TCGA数据中的正常样本，对323例PLC样本进行单因素Cox分析，探讨DAIs在PLC预后中的价值。森林图显示，20个DAIs与预后相关（图3A）。基于20种DAIs （NR4A3、NDRG1、NR4A1、PTHLH、EDNRB、SEMA7A、CXCL12、TDGF1、IL11、AR、BIRC5、GDF2、NGFR、EGF、SPP1、NTF3、CAT、S100A11、MDK、MMP9）（图3B、C）进行LASSO-Cox回归分析构建预后模型，其中7个基因呈显著相关（P<0.05）。以下公式量化了风险评分（图3D）：风险评分=［-0.205773061×mRNA NR4A3表达水平］+［-0.022891938×mRNA SEMA7A表达水平］+［0.021222834×mRNA IL11表达水平］+［0.143759252×mRNA AR表达水平］+［0.618601244×mRNA BIRC5表达水平］+［0.006599213×mRNA EGF表达水平］+［0.256184618×mRNA SPP1表达水平］。

2.3 DAIs的预后价值评价及列线图的构建

根据公式计算所有患者的风险评分，以DAIs风险评分中位数作为截止值，将诊断为PLC的患者分为高风险和低风险两组，使用了时间相关的ROC曲线分析。TCGA组预测1年、3年和5年生存率的ROC曲线下面积（AUC）分别为0.766、0.739和0.713（图4A）。使用相同的公式计算GSE14520中PLC患者的DAIs评分，以验证DAIs预测预后的能力。GSE14520得到的结果与TCGA数据相同，GEO数据的ROC曲线分析结果分别为0.622、0.652和0.674（图4B）。kaplan-Meier生存曲线显示，两组患者高风险组总生存期（OS）均低于低风险组（P<0.01，图4C、D）。图4E及图4F为DAIs评分和生存状态在TCGA和GEO数据集中的分布。

本研究应用多变量Cox回归分析来研究TCGA和GEO队列中风险特征的独立预后价值。风险评分和分期是两组患者重要的独立预后指标（图4G、H）。在TCGA队列中建立了一个基于DAIs、TNM分期、年龄和性别的列线图（图4I）。如校准曲线所示，估计的生存概率和实际的生存概率非常匹配（图4J）。C-index结果显示该列线图预后能力强且可靠（TCGA队列C-index为0.707）。

2.4 不同风险人群间富集通路的综合分析

GSEA富集分析显示，高风险组标记基因在20条通路中显著富集，如CHECKPOINT pathway、E2F_TARGETS、MITOTIC_SPINDLE、BILE_ACID_METABOLISM、XENOBIOTIC_METABOLISM、faty_ acid_metabolism（图5A）。GO分析结果显示，这些DEGs通过以下方式富集：单生物过程、质膜固有组分、单生物细胞过程、质膜整体组分和细胞外空间（图5B）。

2.5 PLC中DAIs与免疫细胞浸润的相关性探讨

TCGA数据中PLC高风险组的Treg细胞、中性粒细胞、M0细胞的浸润明显高于低风险组（图6A、B），T细胞CD4记忆性静息细胞、单核细胞、巨噬细胞M1、幼稚B细胞明显低于低危组。GEO中中性粒细胞、M0细胞、T细胞CD4记忆性静息细胞、单核细胞的浸润结果与TCGA相同（图6C、D）。免疫检查点阻断（ICB）的癌症免疫治疗旨在帮助免疫系统识别和攻击癌细胞。免疫检查点阻断治疗的主要靶点为程序性死亡配体1（PD-L1）、程序性死亡1（PD1）和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA4）。TIDE分析（肿瘤免疫功能障碍与排斥）能有效预测患者对ICB的疗效，反映肿瘤免疫逃逸的潜在能力。TIDE评分越高，ICB疗效越差。我们在TCGA高风险组和低风险组进行了TIDE分析以比较其对ICB的疗效差异。高风险组的TIDE评分和Exclusion评分明显升高，而Dysfunction评分和MSI评分较低（图6E~H）。这一结果在GEO数据中得到验证（图6I~L）。

2.6 体细胞突变和肿瘤突变负荷特征的比较

对比高风险组和低风险组的体细胞突变数据，结果显示高风险组的TP53突变频率高于低风险组（38% vs18%；图7A、B）。致癌信号通路分析结果显示，高风险组中，突变最多的基因来自RTK-RAS通路，占样本比例最大，而低风险组中，突变最多的基因来自PI3K通路，且WNT通路基因在样本中占比最大（图7C、D）。Wilcoxon 检验结果显示，高风险组和低风险组之间的肿瘤突变负荷（TMB）评分没有显著差异（P=0.46；图 7E）。根据TMB评分将样本分为高TMB组和低TMB组。随后将样本分为高风险高TMB、高风险低TMB、低风险高TMB、低风险低TMB 4组，4组生存分析显示差异有统计学意义（P<0.05，图7F），低风险低TMB组生存率较高，高风险高TMB和高风险低TMB组生存率较差。

2.7 不同风险人群化疗药物敏感性的差异

Wilcoxon符号秩检验结果显示，低风险组患者对多西他赛的敏感性高于高风险组患者（P=0.0047，图8A），对阿霉素的敏感性低于高风险组患者（P<0.05，8B），但顺铂、博来霉素和吉西他滨在两组之间差异无统计学意义（P>0.05，图8C~E）。体细胞突变数据显示，TP53在高风险组中突变频率最高，因此我们根据TP53是否发生突变将PLC患者分组比较。结果显示，与TP53突变组相比，TP53非突变组对多西他赛、顺铂、吉西他滨的敏感性更高（P<0.05，图8F、H、J），而对阿霉素和博来霉素的敏感性差异无统计学意义（P>0.05，图8G、I）。

2.8 PLC及癌旁组织中DAIs基因的表达

SEMA7A蛋白在PLC组织中的表达量高于癌旁组织（图9A）。正常组织中NR4A3和AR的表达量高于PLC组织，而SPP1、BIRC5和SEMA7A则相反（图9B）。采用卡方检验比较PLC组织和癌旁组织中SEMA7A的表达水平（表2）。结果显示，SEMA7A在28例PLC组织中呈阳性表达，在9例癌旁正常组织中呈弱阳性或阴性表达。PLC和邻近癌旁组织中SEMA7A的表达差异有统计学意义（P<0.05），此结果在HPA网站上得到了确认（图9B）。

3 讨论

PLC是发生在肝脏的恶性肿瘤，是人类最常见的恶性肿瘤之一，死亡率很高。大部分PLC患者确诊时已属晚期，且由于静脉侵犯和肝内、肝外多发转移而无法进行根治性手术。因此，仍需寻找生物标志物来预测预后和评估治疗反应，以优化PLC患者的临床决策。

细胞死亡是维持组织功能和形态所必需的过程^［15］。细胞死亡途径包括细胞凋亡、坏死性凋亡、自噬、铁死亡、细胞焦亡、坏死等。它们具有不同的形态学和生化特征。失巢凋亡是一种新的特殊细胞死亡形式，在机体发育、组织平衡、疾病发生以及肿瘤转移中起着重要作用。它通过整合素感知和向细胞外基质发出信号，参与控制细胞粘附和存活。研究表明，在A431表皮癌细胞中，表皮生长因子刺激可诱导细胞周期进程或细胞圆化，从而引发失巢凋亡。Chen等^［16］构建了5个与细胞凋亡相关的基因（BAK1、SPP1、BSG、PBK和DAP3）标记来预测HCC患者的生存率。Chi 等^［17］确定了包含7个基因（IKZF3、BAK1、MTDH、FN1、PRDX4、ERBB2和 LTF）的稳健风险评分特征，以建立头颈部鳞状细胞癌的风险预测模型。有研究整合了5个凋亡相关基因（CHEK2、PDK4、ZNF304、SNAI2和SRC）标签，建立了风险预测模型，作为透明细胞肾细胞癌患者的分层因素^［18］。肿瘤细胞表面具有可被免疫系统识别的肿瘤抗原，这是癌症免疫的基础。免疫系统在对抗癌症方面起着至关重要的作用。然而，很少有研究分析PLC中凋亡基因与免疫相关基因之间的关系。本研究系统研究了失巢凋亡及免疫基因在PLC中的预后和免疫学价值，为今后的研究提供了一定基础。

本研究评估了基于DAIs的风险模型在PLC患者中的预后价值。通过单变量和LASSO-Cox回归分析，构建了基于7个DAIs的预后模型，并建立了风险评分计算公式。然后在训练数据集（TCGA）和验证数据集（GSE14520）中测试DAIs的预后价值。将风险特征与临床特征相结合，构建了列线图以促进临床实践。这些结果表明，基于DAIs的风险模型可以作为预测PLC患者预后的有力工具。

用于建立模型的7种DAIs被报道与PLC的肿瘤发生和增殖有关。先前的研究表明SEMA7A可以降低小管膜胆汁酸转运体的表达，导致小鼠肝内胆汁淤积^［18］。SEMA7A通过将整合素β1与NF-κB p105连接起来，激活NF-κB p105加工和下游信号传导，从而促进肝脏炎症^［19］。但其与PLC相关性的研究较少。因此，我们对采集的PLC组织和癌旁正常组织进行了免疫组化染色分析，结果显示PLC组织中SEMA7A的表达水平高于癌旁组织，这与HPA网站上的结果一致。这为进一步研究SEMA7A与PLC发生、发展和转移的关系提供了基础。NR4A3能够调控细胞增殖、凋亡和迁移，在胃癌、乳腺癌、肺癌、白血病等细胞中常具有抑癌作用^{［20， 21］}。此外，无论是在细胞水平研究还是在动物研究中，都表明NR4A3对PLC的侵袭性特征有不利影响^［22］。研究还发现，NR4A3的表达水平与肝癌患者的无复发生存期相关^［23］。IL-11已被证实在胃癌和肾癌的进展中起重要作用，并促进肝癌的血液转移。IL-11升高通过STAT3信号转导在诱导肝癌术后复发中起关键作用^［24］，阻断IL-11-STAT3信号转导可预防术后复发^［25］。AR可以在早期促进肝癌的发生和发展，并在晚期抑制其侵袭。AR 的过度表达增加了恶性程度较低的肝癌细胞系的糖酵解^［26］，表明 AR 过度表达的癌细胞对代谢变化的依赖性。据报道，在几种癌症进展过程中，BIRC5 通过调节细胞凋亡来影响肿瘤细胞的增殖和分裂。BIRC5高表达与肝癌预后不良相关^{［27， 28］}。EGF能刺激细胞生长、增殖、存活和分化。EGF对hepG-2细胞有明显的增殖作用，可促进转移潜能较低的肝癌细胞增殖。同时，EGF能在转录水平上诱导肝癌中PD-L1的表达^［29］。分泌性磷蛋白1（SPP1）是肝癌中最重要的过表达基因之一^［30］，与肝癌进展密切相关^［31］。此外，SPP1水平与肝癌患者预后不良相关^［32］。

由于模型预后的预测评估有限，本研究基于DAIs的风险模型进一步研究了相关的信号通路和生物学功能。本研究的分析表明，G2M、E2F、MITOTIC和MYC等6个标记基因集在高风险组中富集。这些通路参与肿瘤进展和转移。

随后研究了风险评分与癌症免疫状态之间的关联。其中，高风险组的抑制细胞显著增加，免疫活性大大降低。TIDE 是一种预测免疫反应的方法，已用于评估近200个肿瘤队列样本中的T细胞功能障碍和排除^［33］，推断基因在调节肿瘤免疫中的功能，并评估生物标志物以预测对ICB的临床反应。我们的研究结果表明，高风险组的TIDE评分和排除评分显著增加，表明免疫逃逸能力强。这些结果提示，DAIs的特征可能影响PLC患者免疫治疗的疗效，该模型可作为免疫治疗的指标。

化疗是PLC治疗的关键。DOX是使用历史最悠久的常规化疗药物，全身性阿霉素治疗一直是PLC治疗的标准。TACE已被2021年NCCN指南正式推荐用于ChildPugh B级肝病患者。目前用于TACE的化疗药物包括阿霉素、丝裂霉素C、顺铂等^［34］。此外，体细胞突变分析发现TP53突变在高危人群中频率最高，据此将PLC患者分为TP53突变组和非突变组。我们选取了博来霉素、顺铂、多西他赛、阿霉素、吉西他滨，分析其在PLC高风险组与低风险组之间以及TP53突变组与非突变组之间的敏感性，结果显示多西他赛在两组中均表现出显著差异。这表明风险分组和TP53突变分组对PLC化疗效果具有一定的预测作用。验证了DAIs模型可能有助于PLC患者个体化治疗的制定。

本研究存在一些局限性。使用公共数据库的回顾性数据来构建和验证模型，缺乏独立的临床队列数据来证实。因此，需要更多前瞻性真实世界数据来验证其临床价值。

综上所述，本研究构建并验证了基于 DAIs 的PLC患者预后模型，发现了基于 DAIs 模型的PLC患者分组与不同的免疫状态、体细胞突变、富集途径和药物敏感性相关，为了解 DAIs 的潜在作用和指导PLC患者的个性化管理提供了一种有价值的方法。

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