高度近视白内障患者晶状体前囊膜中circRNAs的差异性表达

Differential expression of circRNAs in anterior lens capsules of high myopic patients with cataract

摘要

目的 分析高度近视白内障（HMC）患者晶状体前囊膜组织中circRNAs的差异性表达及其生物学功能，探讨circRNA在高度近视白内障中的作用。 方法 通过白内障手术术中获取36例年龄相关性白内障（ARC）和36例HMC患者晶状体前囊膜标本，两组中各选取18例进行全转录组测序和生物学分析。余下36例采用RT-qPCR对circPDGFRA、circFOXJ3、hsa_circ_0004767、hsa_circ_0007528、ciCRIM1、circMAN1A2、circSLC5A3、circPTK2进行临床验证。随后选择hsa_circ_0007528进行细胞实验，检测hsa_circ_0007528对晶状体上皮细胞（LECs）增殖、迁移和凋亡的影响。 结果 两组患者标本中共检测出16192个circRNAs，其中62个circRNAs差异性表达（29个上调、33个下调）。GO和KEGG分析检测，差异性表达的circRNAs多集中在细胞质、核质和内质网中，参与Gap junction、PI3K-Akt signaling pathway、NF-kappa B signaling pathway、Jak-STAT signaling pathway、HIF-1 signaling pathway、MAPK signaling pathway等信号通路（P<0.05）。ceRNA网络预测多个靶基因。RT-qPCR验证与测序结果一致（P<0.01）。CCK-8、Transwell结果显示，hsa_circ_0007528上调抑制了细胞增殖（P<0.001）和迁移（P<0.01）。流式细胞术显示hsa_circ_0007528上调促进了细胞的凋亡（P<0.0001）。 结论 HMC患者晶状体前囊膜中circRNAs的表达谱与ARC存在差异。hsa_circ_0007528上调抑制LECs的增殖、迁移、促进细胞凋亡。

Abstract

Objective To analyze the differential expression and biological functions of circRNAs in the anterior lens capsules of high myopic patients with cataract and their pathogenic roles in the development of this condition. Methods Anterior lens capsule specimens were collected intraoperatively from 36 patients with age-related cataract (ARC) and 36 high myopic patients with cataract. Among these, 18 specimens from each group were selected for whole transcriptome sequencing and biological analysis, and the remaining 36 specimens were used for validation of circPDGFRA, circFOXJ3, hsa_circ_0004767, hsa_circ_0007528, ciCRIM1, circMAN1A2, circSLC5A3, and circPTK2 expressions using RT-qPCR. hsa_circ_0007528 was selected for cell experiments to examine its effects on proliferation, migration, and apoptosis of lens epithelial cells (LECs). Results A total of 16 192 circRNAs were detected in the specimens from both groups, among which 62 circRNAs were differentially expressed (29 upregulated and 33 downregulated). GO and KEGG analyses revealed that the differentially expressed circRNAs were primarily localized in the cytoplasm, nucleoplasm, and endoplasmic reticulum, and were involved in signaling pathways associated with Gap junction and the PI3K-Akt, NF-κB, Jak-STAT, HIF-1, and MAPK signaling pathways. The ceRNA network predicted multiple target genes. RT-qPCR validation results were consistent with the sequencing data. In the LECs, upregulation of hsa_circ_0007528 significantly inhibited cell proliferation and migration and obviously promoted cell apoptosis. Conclusion The expression profile of circRNAs in the anterior lens capsule of high myopic patients with cataract differs from that of ARC patients. Upregulation of hsa_circ_0007528 inhibits LEC proliferation and migration and promotes cell apoptosis.

Graphical abstract

关键词

高度近视白内障 / circRNA谱 / 全转录组测序 / hsa_circ_0007528 / 晶状体上皮细胞

Key words

high myopia with cataract / circRNA spectrum / whole transcriptome sequencing / hsa_circ_0007528 / lens epithelial cells

高度近视白内障（HMC）是指合并屈光不正以及晶状体混浊的一种眼部疾病，伴有眼轴的过度增长，视力下降，严重影响人们日常生活^［1］。随着青少年人群患近视的风险增高，HMC的患病比例也呈现增长的趋势^{［2， 3］}。高度近视人群患黄斑变性、视网膜脱离、青光眼的风险也逐渐增加^{［4， 5］}。高度近视白内障作为白内障的一种特殊表型，具有比年龄相关性白内障（ARC）发病早，进展快的特点，具有严重的致盲性，其手术后治疗效果也低于ARC，成为危害人类视力最主要的眼病之一^{［6， 7］}。研究表明，高度近视白内障存在较为明显的眼内微环境的改变^［8］，且本课题组前期研究结果显示HMC患者晶状体前囊膜和房水中IL-6、MMP-1、TNF-α等炎症因子表达显著升高^{［9， 10］}，但其机制尚不清楚。

非编码RNA在多种疾病中发挥着重要作用，近年来成为研究热点。环状RNA（circRNA） 是一类特殊的非编码RNA分子，它是由外显子的mRNA反向剪切形成的环状的闭合的结构，由于其呈环状闭合，这导致基因具有强稳定性^［11］。CircRNAs参与多种眼部疾病的发生，相关研究表明circRNAs在白内障、视网膜病变、青光眼以及眼部血管病变等眼部疾病中发挥重要作用，促进疾病的发展进程^［12-15］。但有关circRNAs在HMC中的研究较少，且未能全面的分析circRNAs的作用和功能，相关机制尚不明确。

本研究利用全转录组测序技术检测HMC患者晶状体前囊膜中circRNAs表达谱，分析其差异表达的circRNAs及其功能，并对部分差异表达的基因进行临床验证，同时选择经过临床验证的hsa_circ_0007528进行细胞实验，观察该基因对晶状体上皮细胞（LECs）增殖、迁移、凋亡的影响，为HMC的发病机制研究和防治提供新的思路。

1 资料和方法

1.1 晶状体前囊膜组织的收集

选择在蚌埠医科大学第一附属医院行白内障手术的患者，将符合入选标准的患者纳入本研究，分为年龄相关性白内内障组（ARC组）和高度近视白内障组（HMC组），每组36例（36只眼）。所选患者术前均签署知情同意，该研究经蚌埠医科大学第一附属医院伦理委员会批准（伦理批号：伦科批字［2022］第181号），并遵循《赫尔辛基宣言》的原则。入选标准：年龄相关性白内障组：年龄≤80岁；轴长22~24.0 mm；白内障类型为核性，年龄与HMC组匹配。高度近视白内障组：年龄≤80岁；轴长>26.0 mm；近视度数<-6.00D。排除标准：排除青光眼、葡萄膜炎等眼部疾病和眼内手术史，糖尿病、风湿等可能导致眼部炎症反应的全身疾病。在白内障手术中获取晶状体中央直径5.5~6 mm的前囊膜（含有晶状体上皮细胞），均采用生理盐水冲洗表面的血迹和粘弹剂，以减少对实验的干扰，随即放入含有RNA保护液的无酶EP管中，-80 ℃冰箱冻存。两组患者中各选取18例前囊膜组织进行全转录组测序，其余的各18例前囊膜组织进行RT-qPCR临床验证。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和全转录组测序

为保证样本的总RNA浓度足够，每组将6个前囊膜混合成1个样本，每组设置3个重复样本。总RNA的提取使用Trizol试剂按照制造商的程序提取。采用生物分析仪2100和RNA 6000纳米LabChip试剂盒（安捷伦），RIN号>7.0。使用Ribo-Zero Gold核糖体RNA试剂盒去除rRNA（Illumina）。然后用逆转录酶II将裂解后的RNA片段进行逆转录，生成cDNA（Invitrogen）。获得cDNA后，使用PCR扩增连接产物：95 ℃处初始变性3 min；98 ℃处变性8圈15 s，60℃退火15 s，72 ℃处延伸30 s；最后在72 ℃处延伸5 min。最终cDNA文库的平均插入片段大小为（300±50）bp。最后，我们按照供应商推荐的协议，对IlluminaNovaseq™6000进行了2×150 bp的对端测序（PE150）。

1.2.2 CircRNA文库的构建与生物信息学分析

高质量的原始数据读取通过Cutadapt（https：//cutadapt.readthedocs.io/en/stable/，version：cutadapt-1.9）读取和过滤。采用FastQC（http：//www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/，0.11.9）对数据中Q20、Q30、GC的含量进行序列质量验证。我们使用HISAT2（https：//daehwankimlab.github.io/hisat2/，version：hisat2-2.2.1）对所有样本的reads进行对齐，然后将其映射到参考基因组。采用gffcompare software （http：//ccb.jhu.edu/software/stringtie/gffcompare.shtml，version：gffcompare-0.9.8）对两组患者前囊膜组织进行circRNAs的预测和circRNA的差异表达分析。其中，P<0.05或Fold-change>2的circRNAs、miRNA、mRNA被认为有差异性。生物信息学分析：所有差异性表达的circRNAs宿主编码基因均定位于基因本体数据库（http：//www.geneontology.org/）中。P<0.05被认为是差异性表达circRNAs显著富集的GO值，这主要确定了差异性circRNAs宿主编码基因运动的主要生物学功能。KEGG（通路富集分析）显示差异性circRNAs宿主编码基因中的代谢通路或信号转导通路显著富集，其中P<0.05定义为差异circRNAs宿主编码基因中显著富集的通路。

1.2.3 CircRNA的ceRNAs网络

ceRNA机制揭示了一种RNA间的相互作用，已知miRNA可以通过结合mRNA导致基因沉默，而ceRNAs可以通过竞争性地结合miRNA来调节基因的表达，使用TargetScan（5.0）和miranda（3.3a）预测差异表达的circRNAs的miRNA（miRBase，http：//www.mirbase.org）靶点。通过对受相同miRNA调控的mRNA和circRNAs进行鉴定分析，利用Cytoscape（v3.6.1，Otasek，La Jolla，CA，USA）软件可视化ceRNAs网络，P<0.05。

1.2.4 测序数据的可靠性

原始序列数据已提交到NCBI基因表达综合数据库（GEO）数据集，登录号为<GEO accession>或为<SRA accession>。

1.2.5 RT-qPCR

用于RT-qPCR验证的前囊膜组织中包含18例年龄相关性白内障，18例高度近视白内障，以6个前囊膜为1个样本，ARC组3个样本，HMC组3个样本。每个样本提取RNA，以GAPDH为参照内参（正向：GGAGCGAGATCCCTCCAAA，反向：GGCTGTTGT CATACTTCTCATGG），使用All-in-One™ cDNA第一链合成试剂盒［GeneCopoeia（Cat.No.QP006）］进行反转录，实验操作按试剂说明书操作，针对选定的circRNA使用2×Color SYBR Green qPCR Master Mix ［Vazyme（Cat.No.Q712-03）］试剂盒进行扩增，然后用Roche LightCycler480荧光定量PCR仪，采用2^-△△CT法对数据进行相对定量分析。所用circRNA的引物由擎科生物合成，序列见表1。

1.2.6 细胞培养

人晶状体上皮细胞（LECs）（SRA 01/04）在Gibico DMEM高糖培养基中培养，加入15%胎牛血清（普诺赛）和1%青霉素/链霉素/两性霉素（biosharp，兰杰科技），置于37 ℃，5%二氧化碳的培养箱中孵育。

1.2.7 构建质粒转染细胞系

携带hsa_circ_0007528（pcDNA3.1（+）-hsa_circ_0007528）和对照（pcDNA3.1（+））的质粒由吉玛基因获得，并对序列进行验证。纯化过表达质粒并用于转染LECs（SRA 01/04细胞系），用于后续实验分析。

1.2.8 细胞增殖实验

根据试剂说明书，使用细胞计数试剂盒8（CCK-8）分析细胞增殖。以2×10³/孔的细胞密度接种于96孔板中。在孵育终止前2 h，每孔中各加入10 μL的CCK-8溶液。使用酶标仪（在0、24、48 h）测定吸光度A_{450 nm}值。0 h时相对于各组450 nm的细胞增殖水平为0。

1.2.9 Transwell细胞迁移实验

将密度为2×10⁴/孔的细胞接种于不含胎牛血清的培养基的上室，定容200 μL。在下室中加入600 μL含有20%胎牛血清的培养基。在37 ℃下孵育24 h后，用4%多聚甲醛（PFA）固定细胞，用结晶紫溶液染色。利用倒置显微镜捕获迁移至下室的细胞，拍照记录，用ImageJ进行细胞计数。

1.2.10 流式细胞术

根据试剂盒说明书，使用Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡试剂盒（贝博试剂）分析细胞凋亡，并使用流式细胞仪（贝克曼BD Celesta）进行定量。

1.3 统计学分析

所有实验均进行3次重复。通过GraphPad软件（v9.3.1）使用t检验进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示。当P<0.05时认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高度近视白内障晶状体前囊膜（包含晶状体上皮细胞）中总circRNAs的表达

在两组患者的晶状体前囊膜组织中，共检测到16192个circRNAs，ARC组有6525个circRNAs唯一表达，HMC中有6169个circRNAs唯一表达，其中3498个circRNAs在ARC和HMC中共同表达（图1A）。在检测到的总circRNAs中存在62个差异性表达的circRNAs，其中在HMC中29个上调，33个下调（图1B、C）。根据circRNAs组成类型可分为外显子型、内含子型、基因组间型，其中86%的circRNAs为外显子型，12%的为内含子型，2%的为基因组间型circRNAs（图1D）。大多数circRNAs的长度都集中在100~800个核苷酸之间（图1E）。热图显示了62个差异性表达的circRNAs在HMC中的表达水平，按P值由小到大进行排序分析（图1F）。

2.2 高度近视白内障患者晶状体前囊膜中差异性circRNAs的GO和KEGG富集分析

GO分析结果显示HMC中上、下调基因多集中在细胞质、核质和内质网中，主要参与蛋白质转运、正调控GTPase活性、肺发育、MAPK、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路、多细胞生物发育、DNA模版转录调控、细胞连接等生物学过程，并参与蛋白结合、DNA结合以及发挥蛋白酪氨酸酶的活性等的分子学功能（图2A、C）。KEGG结果显示上调的基因主要参与癌症、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路等（图2B），下调的基因主要参与单纯疱状病毒1型感染细胞质通路、DNA感应通路以及NF-kappa B信号通路（图2D）。其中Gap junction、PI3K-Akt signaling pathway、NF-kappa B signaling pathway、Jak-STAT signaling pathway、HIF-1 signaling pathway、MAPK signaling pathway与白内障的发生发展密切相关。

2.3 高度近视白内障患者晶状体前囊膜中差异性circRNAs的ceRNA网络的建立以及靶基因的预测

对于circRNA、miRNA、mRNA三者可能存在的互作关系，本研究建立了含有14个circRNAs、10个miRNAs、146个mRNAs的ceRNA网络图，预测出circRNAs的潜在结合靶点，在网络图中我们可以发现一些不同的circRNAs可以和同一个miRNA进行结合、甚至是一个circRNA可以和多个miRNAs结合，如circRNA4418（SLC5A3）、circRNA4508（SUCO）、hsa_circ_0007528均可以与miR-146b-5p结合，其中circRNA4508（SUCO）还可以和miR-224-3p、miR-767-5p、miR-30c-2-3p等不同的miRNA相结合，同时miRNA也对应多个mRNA（图3）。

2.4 RT-qPCR验证筛选的差异性表达的circRNAs

根据全转录组测序结果，筛选出4个上调的差异性表达的基因［circRNA10422（PDGFRA）、circRNA12432（FOXJ3）、hsa_circ_0004767、hsa_circ_0007528］，4个下调的差异性表达的基因［ciRNA374（CRIM1）、circRNA4906（MAN1A2）、circRNA4418（SLC5A3）、circRNA4927（PTK2）］。利用RT-qPCR技术对这些基因进行验证，并采用2^-△△CT法对数据进行相对定量分析，结果显示circRNA10422（PDGFRA）、circRNA12432（FOXJ3）、hsa_circ_0004767、hsa_circ_0007528在HMC中表达上调；ciRNA374（CRIM1）、circRNA4906（MAN1A2）、circRNA4418（SLC5A3）、circRNA4927（PTK2）在HMC中表达下调。RT-qPCR验证结果与测序结果一致（图4A、B）。

2.5 过表达hsa_circ_0007528抑制LECs的增殖和迁移，促进细胞凋亡

通过构建hsa_circ_0007528过表达质粒（pcDNA3.1（+）-hsa_circ_0007528），并成功转染至人LEC（SRA 01/04），设立正常组（LEC^NC）、空载组（LEC^vector）、hsa_circ_0007528过表达组（LEC^{hsa_circ_0007528}）（n=3）。经过转染24 h后，RT-qPCR结果显示hsa_circ_0007528转染倍率约为400倍，且LEC^NC组与LEC^vector组之间差异无统计学意义（P>0.99），LEC^{hsa_circ_0007528}组中hsa_circ_0007528的表达相较于LEC^vector组增加了404.31±85.39倍（P<0.01，图5A）。

CCK-8细胞增殖实验检测hsa_circ_0007528对细胞增殖的影响：培养48 h后，结果显示LEC^NC组与LEC^vector组之间无统计学差异（P>0.24），LEC^{hsa_circ_0007528}组（1.14±0.30）相较LEC^vector组（1.95±0.04）细胞增殖率明显降低58%（P<0.001，图5B），hsa_circ_0007528抑制了LECs的增殖。

Transwell细胞迁移实验检测hsa_circ_0007528对细胞迁移的影响：结果显示LEC^NC组与LEC^vector组之间差异无统计学意义（P>0.83），LEC^{hsa_circ_0007528}组（94±2.16）相较于LEC^vector组（250.33±35.31）降低约2.6倍（P<0.01，图5C），hsa_circ_0007528抑制了LECs的迁移。

利用流式细胞术检测hsa_circ_0007528对细胞凋亡的影响，结果显示LEC^NC组与LEC^vector组之间差异无统计学意义（P>0.29），hsa_circ_0007528促进了LECs的凋亡，LEC^{hsa_circ_0007528}组凋亡率（12.45±1.45）相较于LEC^vector组（2.60±0.67）升高约4.8倍（P<0.0001，图5D），hsa_circ_0007528促进了LECs的凋亡。

3 讨论

circRNAs为新型的非编码RNA，因其闭环的结构特点，具有高度稳定性和组织特异性，使其成为一种特殊的非编码RNA，具有复杂的生物学功能。众多研究表明，circRNAs可以与蛋白质相互作用，隔离和改变蛋白质内之间的结合功能，破坏其原有的表达，或海绵吸附miRNA调控下游基因的表达等机制，在白内障、青光眼、眼部新生血管等眼科疾病中发挥重要作用^［16-19］。

HMC作为白内障的一种特殊表型，相较于ARC具有更为显著的眼内炎症微环境，本课题组前期的研究^{［9， 10］}也表明 IL-6、MMP-1、TNF-α等炎症因子在HMC患者的房水和前囊膜组织中显著升高，HMC晶状体囊膜中 lncRNAs、miRNAs的表达谱与ARC也存在差异^{［20， 21］}。近年研究认为，HMC眼内炎症微环境，可能是导致HMC术后并发症高的主要原因^［22］。但是circRNAs在HMC中的表达水平，对HMC患者眼内炎性微环境及白内障发生发展的影响，目前报道甚少。因此本研究采用全转录组基因测序的方法检测HMC患者晶状体前囊膜中circRNAs的表达谱，分析其与ARC患者的差异性表达及其功能，为进一步HMC的靶向治疗提供数据支持。

在本研究中，分别选择18例HMC和18例ARC患者（其中以6个晶状体前囊膜为一个样本，用来提高样本的RNA含量），通过全转录组测序的方法，确定了高度近视白内障患者前囊膜中的circRNAs的表达谱及较为全面的生物学信息。我们在ARC和HMC患者前囊膜中检测出16192个circRNAs，其中存在62个差异性表达的circRNAs。GO和KEGG分析结果显示这些差异性表达的circRNAs多集中在细胞质、核质和内质网中，可通过参与Gap junction、PI3K-Akt signaling pathway、NF-kappa B signaling pathway、Jak-STAT signaling pathway、HIF-1 signaling pathway、MAPK signaling pathway等与白内障发生发展密切相关的信号通路，这些通路的激活或失活对疾病发展至关重要。Liu等^［23］研究发现KGF-2（角质细胞生长因子-2）可以通过PI3K/Akt途径激活Nrf2/HO-1通路来抵抗LEC中H₂O₂介导的凋亡和氧化应激，对白内障的形成具有潜在的保护作用。众所周知，氧化应激是形成白内障的一个重要原因，ROS的升高与NF-kappa B、MAPK、HIF-1 信号通路密切相关^［24-26］。Ma等^［27］研究表明IL-6可促进TGF-β的表达诱导晶状体上皮细胞的上皮间充质转化（EMT），并通过影响Jak-STAT3信号通路促进后囊膜混浊（PCO），而Jak-STAT3抑制剂可逆转IL-6导致的晶状体上皮细胞的I型胶原的表达。此外，蛋白间的缝隙连接对维持晶状体透明性具有重要意义，当蛋白连接因受到外界刺激而遭到破坏时，细胞间通讯发生异常，导致晶状体上皮细胞之间代谢紊乱，晶体透明度降低，对白内障的形成具有一定促进作用^［28］。有关circRNAs通过哪些通路调控晶状体上皮细胞的生物学行为，从而影响HMC的发生发展，目前尚未见报道，本研究筛选出了差异性表达的circRNAs及主要的信号通路，为进一步研究circRNAs对HMC的影响提供了方向。此外，由于本研究所选的两组患者，除了高度近视这一因素的差别，其它指标均一致，因此测序结果也反映了高度近视眼与非高度近视眼之间的差别，对高度近视的研究也提供了一定的价值。

相关研究发现circRNA可以通过竞争性抑制内源RNA（ceRNA）的方式与RNA竞争结合miRNA，促进或抑制疾病的发展^［29-31］。基于circRNAs的这种作用方式，我们对一些差异表达的circRNAs进行了靶点预测，并利用Cytoscape软件对由14个circRNAs、10个miRNAs、146个mRNAs构成的ceRNA网络进行可视化分析，为circRNAs深层机制研究提供数据参考。随后，为验证测序结果的准确性，我们对筛选的8个差异表达的circRNAs，进行RT-qPCR的二次验证，结果显示各circRNAs在两组患者前囊膜组织中的表达水平与测序结果一致。

为进一步研究circRNAs在HMC疾病发展中可能发挥的生物学功能和作用，我们选择经过临床验证的hsa_circ_0007528来研究其对LEC的作用和影响，并进行了细胞实验。首先，我们在LEC（SRA 01/04）中转染hsa_circ_0007528过表达质粒，并设立实验分组（LEC^NC组、LEC^vector组、LEC^{hsa_circ_0007528}组）。然后，通过CCK-8细胞增殖实验，证实过表达hsa_circ_0007528可以抑制细胞增殖。其次，在Transwell细胞迁移实验中我们发现过表达hsa_circ_0007528可以抑制细胞迁移。最后，在细胞凋亡实验中，过表达的hsa_circ_0007528极大促进了LECs的凋亡，LECs的过度凋亡更是加速了LECs的死亡。本实验表明hsa_circ_0007528上调可显著抑制细胞的增殖和迁移，促进细胞凋亡，这可能与诱发晶状体蛋发生变性，细胞骨架塌陷有关，以及过度凋亡也可导致LECs结构功能受损，对白内障发生起重要推动作用^［23］。以上细胞实验结果说明circRNA在HMC的发生发展中起到重要作用。

综上所述，我们应用全转录组测序技术，初步获得HMC晶状体前囊膜中circRNAs的表达谱，并对circRNAs进行GO分析和KEGG通路分析，进一步了解其分子机制和作用。可视化circRNA-miRNA-mRNA网络图进一步分析circRNAs的分子机制及作用靶点。此外，通过CCK-8、Traswell、流式细胞术等细胞实验证明hsa_circ_0007528对LECs具有抑制其增殖、迁移，促进凋亡的作用。基于以上实验结果，我们对circRNAs的生物学功能进行了预测和总结，以及初步探讨了hsa_circ_0007528对LECs的生物学行为的影响，希望这一研究发现可以为进一步通过靶向基因位点治疗HMC提供新的治疗靶点和方向。

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基金资助

安徽省临床医学研究转化专项(202427b10020008)

安徽高校自然科学研究重点项目(KJ2021A0718)

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