低氧环境下NLRP3信号通路促进非酒精性脂肪性肝炎小鼠的肝细胞焦亡

NLRP3 signaling pathway promotes hepatocyte pyroptosis in mice with nonalcoholic steatohepatitis in hypoxic environment

摘要

目的 探讨低氧环境下NLRP3信号通路在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）肝细胞焦亡中的作用。 方法 24只6周龄的雄性C57BL/6小鼠，随机分为低氧对照组（A组）、低氧NASH模型组（B组）、低氧NASH模型+NLRP3抑制剂组（C组）、低氧NASH模型+Caspase-1抑制剂组（D组），6只/组。小鼠在模拟海拔5000 m的低压氧舱中饲养6周。A组小鼠喂食基础饲料，B、C、D组小鼠喂食蛋氨酸胆碱缺乏（MCD）饲料，其中C、D组小鼠分别每隔1 d腹腔注射NLRP3抑制剂（20 mg/kg）、Caspase-1抑制剂（25 mg/kg）。实验终点时处死小鼠，收集小鼠血清和肝脏组织，检测小鼠血清空腹血糖（FBG）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平；HE染色、Masoon染色及透射电镜观察小鼠肝脏组织病理变化；ELISA法检测小鼠血清IL-1β、IL-18水平；免疫组化和Western blotting法检测小鼠肝脏组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β、消皮素D（GSDMD）蛋白表达水平。 结果 与A组相比，B组小鼠血清FBG、TC、TG、ALT、AST水平均增加（P<0.05）；肝脏脂质含量、炎性细胞浸润及胶原纤维沉积均增加；肝脏组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β、GSDMD蛋白表达水平均增加（P<0.05）；肝组织线粒体肿胀严重，嵴断裂，基质局部溶解、空泡化，部分线粒体外膜破裂，胞浆中可见部分核糖体丢失，核膜模糊，部分粗面内质网扩张成囊状。与B组相比，C、D组小鼠血清TC、TG、ALT、AST水平明显降低（P<0.05），FBG差异无统计学意义（P>0.05）；肝脏脂质含量、炎性细胞浸润及胶原纤维沉积均显著减少；肝脏组织NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β蛋白表达水平均降低（P<0.05）；肝组织线粒体肿胀、嵴断裂、空泡化程度减轻，部分线粒体外膜破裂，胞浆中可见部分核糖体丢失，粗面内质网形态结构正常。 结论 低氧环境下，NLRP3信号通路在促进NASH肝细胞焦亡中起关键作用，而通过抑制该通路可以有效减轻肝脏炎症，为NASH的治疗提供了潜在的治疗靶点。

Abstract

Objective To investigate the regulatory role of the NLRP3 signaling pathway in hepatocyte pyroptosis in nonalcoholic steatohepatitis (NASH) under hypoxia. Methods Twenty-four male C57BL/6 mice were randomized equally into hypoxic control (A), hypoxic NASH model (B), hypoxic NASH+NLRP3 inhibitor (C), and hypoxic NASH+caspase-1 inhibitor (D) groups. In groups B-D, the mice were fed a methionine choline-deficient (MCD) diet under hypoxic conditions (to simulate a 5000 m altitude) for 6 weeks; the mice in groups C and D received intraperitoneal injections of the respective inhibitors every other day. Results Compared with those in group A, the mice in group B showed significantly elevated serum levels of FBG, TC, TG, ALT and AST, increased liver lipid content, inflammatory cell infiltration and collagen fiber deposition, and enhanced hepatic expressions of NLRP3, caspase-1, IL-1β and GSDMD proteins, with obvious swelling, cristae breakage, vacuolization, and outer membrane disruption of the mitochondria, ribosome loss in the cytoplasm, destruction of the nuclear membrane, and pathological changes of the rough endoplasmic reticulum. Treatment with NLRP3 inhibitor and caspase-1 inhibitor both significantly lowered serum levels of TC, TG, ALT and AST (but without significantly affecting FBG) in the mouse models, and reduced liver lipid content, inflammatory cell infiltration, collagen deposition, and expression levels of NLRP3, caspase-1, GSDMD and IL-1β. The treatments also significantly improved pathological changes in the mitochondria, ribosomes and endoplasmic reticulum in liver tissues of the mice. Conclusion NLRP3 signaling pathway plays a key role in promoting hepatocyte pyroptosis in NASH mice under hypoxic condition, and inhibiting this pathway can effectively reduce liver inflammation, suggesting its potential as a therapeutic target for NASH treatment.

Graphical abstract

关键词

低氧 / 非酒精性脂肪性肝炎 / 肝细胞焦亡 / NLRP3炎症通路

Key words

hypoxia / nonalcoholic steatohepatitis / hepatocyte pyroptosis / NLRP3 inflammatory pathway

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一种由于胰岛素抵抗、遗传易感性等因素引起的慢性肝脏损伤性疾病，可进展为非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝硬化甚至肝癌^{［1， 2］}。随着全球NAFLD发病率的上升，已成为公共卫生的重大挑战^{［3， 4］}。核苷酸结合寡聚化结构域样受体3（NLRP3）炎症小体在NASH的发展中扮演着关键角色^［5-7］，其激活可触发由消皮素D（GSDMD）介导的细胞焦亡，这一过程可通过炎症小体激活Caspase-1的经典途径或脂多糖（LPS）激活Caspase-4/5/11的非经典途径实现^［8-10］。

研究发现，在NASH患者和小鼠模型中，NLRP3表达显著上调，伴随Caspase-1和IL-1β水平升高^［11］。NLRP3基因缺陷的小鼠可避免肝损伤和纤维化，而NLRP3基因敲入的小鼠则出现严重肝脏炎症和早期肝硬化^［12］。研究表明，抑制Caspase-1、GSDMD的激活或阻断NLRP3可减轻肝脏炎症和纤维化^［10］。此外，某些中药制剂通过抑制NLRP3通路改善NASH和肝纤维化^{［13， 14］}。尽管NLRP3炎症通路在NASH中的重要性已得到确认，但低氧对NASH的影响研究不足。肝脏对低氧极为敏感，低氧可能导致肝脏微循环障碍，引发肝细胞损伤和脂肪变性。在严重低氧下细胞内结构如线粒体受损，触发肝细胞程序性死亡^{［15， 16］}。目前，关于低氧对NASH影响的研究有限，特别是低氧环境下NLRP3炎症通路与肝细胞焦亡的关系及机制尚不明确^{［17， 18］}。本研究旨在探讨低氧环境下NLRP3炎症通路对肝细胞焦亡的影响及其机制，为NASH治疗提供新思路，并揭示低氧在NASH发病中的作用，为防治策略提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物与分组

24只6周龄SPF级C57BL/6雄性小鼠，购自江苏华创信诺医药科技有限公司，实验动物许可证号：SCXK（苏）2020-0009。小鼠饲养于青海大学高原医学中心实验室，适应性饲养1周后随机分为低氧对照组（A组）、低氧NASH模型组（B组）、低氧NASH模型+NLRP3抑制剂组（C组）、低氧NASH模型+Capase-1抑制剂组（D组），6只/组。本研究经青海大学附属医院伦理委员会批准（伦理批号：P-SL-2023-275）。

1.1.2 主要试剂

NLRP3抑制剂、Caspase-1抑制剂（MCE）；NLRP3、Caspase-1、GSDMD兔一抗、HRP-羊抗兔二抗、BCA蛋白定量试剂盒（proteintech）；羊抗鼠二抗、IL-1β、IL-18 ELISA试剂盒（Elabscience）。

1.1.3 主要实验仪器

包埋机（常州郊区中威电子仪器厂）；显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司）；刀片（日本羽毛安全剃刀株式会社）；脱水机（常州市中威电子仪器有限公司）；离心机（北京大龙兴创实验仪器公司）；酶标仪（德国TECAN公司）；透射电子显微镜（日本电子JEOL）；干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；电泳仪、转膜仪（Bio-rad）；低压氧舱（中航风雷）；转轮式切片机（德国徕卡公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 造模及取材

小鼠于低压氧舱（海拔5000 m，温度22~25 ℃，相对湿度60%±10%饲养6周，保持12 h昼夜交替，自由进食和饮水。A组小鼠予以基础饲料（北京科澳协力饲料公司）饲养，B、C、D组小鼠予以蛋氨酸胆碱缺乏（北京科澳协力饲料公司，MCD）饲料饲养，其中C、D组小鼠分别每隔1 d腹腔注射NLRP3抑制剂（20 mg/kg）、Caspase-1抑制剂（25 mg/kg）。实验终点时麻醉后摘取眼球取血，离心（4 ℃、3000 r/min、15 min），收集血清于-80 ℃冰箱留置待用。颈椎脱臼处死小鼠，剪开小鼠腹部暴露腹腔取出肝脏组织，分别留取石蜡包埋组织样本，剩余部分迅速液氮冷冻后转入-80 ℃冰箱待用。

1.2.2 生化指标检测

采用全自动生化分析仪测定血清FBG、TC、TG、ALT和AST水平。

1.2.3 ELISA法

按照说明书操作，向96孔板中加入标准品和样品（50 μL/孔），37 ℃恒温箱中孵育2 h，PBS-T洗液（pH 7.4）清洗ELISA板3次，加入生物素标记抗体（50 μL/孔），37 ℃的恒温箱再次孵育1 h，清洗3次后，添加底物溶液（100 μL/孔）、避光孵育15~30 min，添加终止溶液（50 μL/孔）终止显色反应，采用酶标仪进行精确测定吸光度A_{450 nm}值。通过计算得出样本中IL-1β、IL-18的确切浓度值。

1.2.4 HE染色

组织经4%多聚甲醛固定24 h，常规脱水透明（75%、85%、95%、无水乙醇各1 h，二甲苯I、II各15 min），浸蜡包埋，切片（4 μm厚）与贴片，二甲苯脱蜡（I、II各10 min），梯度乙醇水化（100%、95%、85%、75%乙醇各5 min），苏木精染色（5 min），1%盐酸酒精分化（5 s），伊红染色（3 min），二甲苯（I、II各5 min）、梯度乙醇（100%、95%、85%、75%各3 min）脱水，切片晾干，中性树胶封片，光学显微镜镜检，图像采集分析。

1.2.5 Masson染色

组织切片脱蜡至水，1%重铬酸钾溶液37 ℃过夜孵育，切片置60 ℃烘箱加热30 min，Weigert铁苏木精染色10 min，0.2%盐酸酒精分化5 s，丽春红品红染色10 min，磷钼酸溶液褪色5 min，苯胺蓝染色5 min，1%醋酸分化1 min，梯度酒精脱水（95%、无水乙醇各2 min），二甲苯透明（I、II各5 min），中性树胶封片并在光学显微镜下观察。

1.2.6 免疫组织化学染色

组织切片（4 μm厚）经二甲苯脱蜡（I、II各10 min）水化（100%、95%、85%、75%乙醇各5 min），柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）抗原修复（95 ℃，15 min），3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶（室温，10 min），5%BSA封闭非特异性结合（室温，30 min），加入一抗（NLRP3、Caspase-1、IL-1β、GSDMD，稀释比例=1∶100）孵育（4 ℃过夜），加入HRP标记二抗（稀释比例=1∶100）孵育（37 ℃，30 min），二氨基苯联胺（DAB）显色（室温，3~5 min），苏木素复染（3 min），梯度乙醇（75%、85%、95%、100%各3 min）、二甲苯（I、II各5 min）脱水，中性树胶封片，光学显微镜下观察切片，Image J软件分析，得出结果。

1.2.7 Western blotting检测

组织称质量后加RIPA裂解液（组织：RIPA裂解液=1∶10）充分裂解（冰上30 min），离心（10 min，4 ℃，12 000 r/min），提取上清，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，加入5×Loading Buffer（蛋白：Loading Buffer=4∶1），水浴变性（100 ℃，10 min），制胶（分离胶10%，浓缩胶5%），上样（20 μg/孔），电泳（浓缩胶：80 V，20 min，分离胶：110 V至bromophenol blue至胶底部），转膜（PVDF膜，200 mA，90 min），5%脱脂奶粉封闭（室温，60 min），加入一抗（NLRP3、IL-1β稀释比例=1∶1000；Caspase-1、GSDMD稀释比例=1∶5000）孵育（4 ℃，过夜），TBST洗涤（3次，10 min/次），加入HRP标记二抗（稀释比例=1∶10 000）孵育（室温，1 h），TBST洗涤（3次， 10 min/次），加入ECL发光液显影，Image J软件定量分析，得出结果。

1.2.8 透射电镜

肝组织样品切取1 mm³大小，经3%戊二醛预固定（4 ℃，2 h），PBS洗涤3次，1%四氧化锇二次固定（4 ℃，2 h），PBS洗涤3次，梯度丙酮脱水（30%、50%、70%、80%、90%、100%各15 min），纯丙酮与Epon 812包埋剂（1：1）渗透（室温，1 h），纯包埋剂包埋（37 ℃，12 h；45 ℃，12 h；60 ℃，48 h），超薄切片机切片（70 nm厚），醋酸铀染色（20 min）、柠檬酸铅染色（10 min），透射电镜下观察拍照。

1.3 统计学分析

采用SPSS 25.0统计软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，事后两两比较采用LSD检验，P<0.05为差异有统计学意义。`

2 结果

2.1 小鼠生化指标

与A组小鼠相比，B组小鼠FBG、TC、TG、ALT、AST水平均有不同程度的升高（P<0.05）。与B组小鼠相比，C、D组小鼠TC、TG、ALT、AST水平均有不同程度的降低（P<0.05），FBG无明显变化（P>0.05，表1）。

2.2 小鼠血清L-1β、IL-18水平

与A组小鼠相比，B组小鼠IL-1ß、IL-18水平均有不同程度的升高（P<0.05）。与B组小鼠相比，C、D组小鼠IL-1β、IL-18水平均有不同程度的降低（P<0.05，表2）。

2.3 小鼠肝组织HE染色

A组小鼠的肝脏组织结构较为清晰，仅观察到少量脂肪空泡，未观察到炎症细胞的浸润现象；B组小鼠的肝脏组织结构出现紊乱，脂质沉积区域扩大，脂肪空泡数量增多，细胞浆呈现疏松化，伴少量气球样变性及炎症细胞的浸润；C组和D组小鼠的肝脏组织结构相对清晰，细胞浆的疏松化、气球样变性以及炎症细胞的浸润程度均有显著减轻，且仅见到少量的脂肪空泡（图1）。

2.4 小鼠肝组织Masson染色

A组小鼠肝组织几乎不可见蓝色胶原纤维沉积；B组小鼠肝组织可见明显增多的蓝色胶原纤维沉积，提示有肝纤维化的存在；C组、D组的蓝色胶原纤维沉积减少（图2）。

2.5 小鼠肝组织相关蛋白表达水平

与A组小鼠相比，B组小鼠肝脏组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、GSDMD蛋白表达水平明显增加（P<0.05）；与B组小鼠相比，C组、D组小鼠肝脏组织中NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β蛋白表达水平降低（P<0.05，图3~6）。

2.6 小鼠肝组织透射电镜

A组小鼠肝组织线粒体肿胀，嵴结构不清晰，粗面内质网形态结构未见明显异常；B组小鼠肝组织线粒体肿胀严重，嵴断裂，基质局部溶解、空泡化，部分线粒体外膜破裂，胞浆中可见部分核糖体丢失，核膜模糊，部分粗面内质网（RER）扩张成囊状；C组、D组小鼠肝组织，线粒体肿胀、嵴断裂、空泡化程度减轻，部分线粒体外膜破裂，胞浆中可见部分核糖体丢失，粗面内质网形态结构正常（RER，图7）。

3 讨论

NASH全球发病率不断上升，尤其在肥胖和代谢综合征高发地区^［19-21］。其病理进展涉及胰岛素抵抗、氧化应激、炎症反应、细胞焦亡等多种因素，尤以炎症反应和细胞焦亡为关键环节。细胞焦亡主要通过NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路实现，NLRP3炎症小体的激活与IL-1β的成熟释放是此过程的关键步骤^{［22， 23］}。既往研究表明，NLRP3炎症小体在NASH小鼠肝脏中的激活与肝损伤和脂质代谢异常密切相关^［24］。在NASH小鼠模型中，该通路蛋白的表达显著升高^［11］。使用NLRP3特异性抑制剂MCC950和Caspase-1抑制剂可有效减轻肝损伤^［25-27］，表明NASH发病与该信号通路激活密切相关。

低氧环境对肝脏的损害涉及多个方面，包括细胞凋亡、炎症反应、氧化应激和代谢紊乱^［28］_。研究显示，低氧可通过TNF-α/caspase-8/caspase-3通路致肝损伤^［29］，HIF-2α过表达损伤线粒体功能，促进脂肪变性^{［30， 31］}，表明低氧环境在肝损伤中发挥重要作用。基于此，本研究提出假设：低氧可能通过激活NLRP3信号通路诱导肝细胞焦亡，从而加剧NASH的病理损害。本研究结果显示，低氧NASH模型组小鼠的AST和ALT水平明显升高，表明存在明显肝功能损伤。这与先前的研究一致^［15］。值得注意的是，给予NLRP3抑制剂或Caspase-1抑制剂后，肝功能指标明显改善，证实了NLRP3信号通路在低氧NASH中的关键作用，这与Henao-Mejia J等在常氧环境中的发现相符^［32］。进一步比较发现，低氧NASH模型组TC、TG、FBG水平均显著升高，表明存在明显的糖脂代谢异常，与既往研究结果一致^［33］。抑制剂干预后TC、TG水平明显降低，表明抑制NLRP3信号通路对NASH的脂质代谢紊乱具有明显的改善作用。然而，尽管有研究报道NLRP3抑制剂可改善胰岛素抵抗^［34］，但本研究FBG水平在抑制剂干预后无显著变化，这可能与低氧环境下HIF-1α持续激活糖异生通路有关^［35］。具体而言，在低氧环境下，HIF-1α作为关键信号媒介，上调葡萄糖转运体（GLUT1）表达并促进糖酵解酶活性，增强肝脏糖异生功能，维持血糖稳定。同时，低氧可能导致肝细胞胰岛素抵抗，使肝脏糖异生更为活跃^［36］。因此，即使抑制NLRP3信号通路，低氧环境的持续影响仍可能维持较高的FBG水平。这种低氧特异性的代谢调控机制使血糖调节更为复杂，也为未来研究提供了新方向。本研究检测了炎症因子水平，结果显示低氧NASH模型中IL-1β和IL-18含量明显升高，抑制剂干预后显著下降。蛋白表达分析进一步证实，低氧NASH模型中NLRP3、Caspase-1、IL-1β及GSDMD表达显著上调，抑制剂干预后明显下降。这些结果与既往NLRP3炎症小体研究发现一致^［37］，证实了低氧环境下NLRP3介导的炎症通路被激活，并诱导肝细胞焦亡。肝细胞超微结构的病理改变与氧化应激和能量代谢障碍直接相关。透射电镜观察发现，低氧NASH模型组肝细胞线粒体肿胀严重，嵴断裂，基质局部溶解，部分线粒体外膜破裂，部分粗面内质网扩张成囊状，胞浆中可见部分核糖体丢失等超微结构损伤，提示存在严重的氧化应激和能量障碍。结合GSDMD焦亡蛋白表达上调，表明细胞处于严重应激状态，可能发生了焦亡。抑制剂干预后，这些超微结构损伤明显减轻。总的来说，本研究首次在低氧NASH模型中验证了NLRP3炎症小体-焦亡轴的核心作用，其与常规NASH模型的相似性支持该通路作为普适性治疗靶点的潜力，而低氧特异性调控机制的发现则为高原地区或慢性缺氧患者的精准干预提供了新思路。未来研究需进一步解析低氧与NLRP3激活的分子互作网络，并探索联合靶向炎症小体与线粒体保护的治疗策略。

综上所述，本研究发现，在低氧环境下，NASH模型小鼠展现出生化指标、血清中炎症因子水平的显著升高，同时伴随细胞焦亡现象及线粒体损伤。应用NLRP3及Caspase-1特异性抑制剂后，生化指标下降，病理损伤明显改善。这些发现表明，低氧环境通过激活NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号轴触发肝细胞焦亡，加重肝细胞损伤。此研究揭示了NLRP3信号通路在低氧诱发的代谢紊乱及肝脏病理进展中的重要作用，为理解NASH病理机制提供新视角，并将该信号通路确立为潜在治疗靶点，对开发针对低氧环境下NASH的治疗策略具有重要指导意义。虽然本研究已阐明NLRP3信号通路的关键作用，但低氧条件下NASH复杂病理网络的精确调控机制仍需深入探索，未来研究有望发掘更多参与此病理过程的信号通路，为NASH治疗开辟新策略。

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