随着现代生活方式与饮食习惯的变迁，肥胖、2型糖尿病（T2DM）及代谢综合征的发病率持续攀升，代谢相关性脂肪性肝病（MAFLD）也跃升为全球最为普遍的慢性肝病之一
［1］。MAFLD相关的肝硬化、肝癌等晚期肝病以及肝外肿瘤的发病率亦显著增长
［2， 3］。从其命名由非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）向MAFLD乃至代谢功能障碍相关的脂肪变性肝病（MASLD）的演变中，不难发现对代谢紊乱逐渐重视，且诊断标准更为包容与非排他性
［4， 5］。乙型肝炎病毒（HBV）感染仍是全球公共卫生领域的一大挑战，尽管全球范围内已大力推广HBV疫苗接种与抗病毒疗法，但HBV感染仍呈地方性流行态势
［6， 7］。鉴于NAFLD与慢性乙型病毒性肝炎（CHB）与纤维化进展、肝硬化及肝细胞癌的发展密切相关，这两种疾病的共患现象引起了广泛关注。然而，NAFLD与HBV感染之间的确切相互作用至今仍未阐释清楚
［8］。
目前关于脂肪肝和乙型肝炎相互影响的研究结论不一，有研究显示在未接受治疗的HBeAg阴性CHB患者中，合并MASLD与更高的HBsAg血清清除率和血清转换率相关，这提示代谢功能障碍可能对CHB的功能性治愈具有正面叠加效应
［9］。另一项包含57 385例CHB和慢性丙型肝炎患者的全国性队列研究发现，脂肪肝与肝细胞癌（HCC）发生率和死亡率显著相关。伴随轻度脂肪肝的患者HCC风险增加50%，而重度脂肪肝患者的风险则增加至88%
［10］。既往感染HBV的NAFLD患者纤维化程度显著加剧，提示这两种病因的叠加可能有促进纤维化进展的作用
［11］。HBV感染者的肝脏微生物组与非感染者存在显著差异， HBV感染者的肝脏微生物组多样性较低，且某些有益菌的丰度显著下降，这可能促进了脂肪肝的发生和进展
［12］。
肠道-肝脏轴的双向调控机制在维持胃肠道健康与疾病状态中扮演着关键角色，通过环境与宿主介体发挥重要作用。营养物质、微生物抗原、代谢物及胆汁酸等因子可调节肠道与肝脏的代谢及免疫反应，而这些反应又反过来影响微生物群落的结构与功能。在NAFLD患者中，肠道微生态失衡与疾病的进展密切相关
［13］。与健康个体相比，NAFLD患者肠道中
Proteobacteria、
Escherichia及
Dorea的相对丰度显著增加，而
Ruminococcaceae 、
Anaerospacter、
Coprococcus、
Eubacterium、
Faecalibacterium 及
Prevotella 的丰度则显著降低
［14］。值得注意的是，HBV感染会进一步影响NAFLD患者的肠道菌群分布，有研究表明合并HBV感染的NAFLD和糖尿病患者肠道中
Faecalibacterium物种的丰度降低，而
Megasphaera的丰度增加
［15］。菌群的变化可诱发代谢物质及免疫状态的改变，从而影响疾病进程，尽管其具体机制尚待深入探索。
口腔微生物群的失调与慢性肝病的发生和发展也密切相关，口腔内的病原菌可以通过血液循环进入肝脏，导致肝脏的炎症反应，进而加重肝脏疾病的进展
［16］，口腔健康较差的患者更容易发展为非酒精性脂肪肝病（NAFLD）和肝纤维化
［17］。然而，HBV感染对MAFLD患者口腔微生态的影响尚未阐明。本研究通过多组学联合分析，揭示HBV感染对MAFLD患者口腔微生态及代谢物的调控作用，为探索肝病跨器官交互机制提供新视角。
1 资料和方法
1.1 研究对象
前瞻性收集2023年11月~2024年1月于解放军总医院诊断为MAFLD的患者，同时存在HBsAg阳性，HBVDNA<400 IU/mL归为合并HBV感染组（MAFLD+CHB）。该研究获得解放军总医院伦理委员会批准（伦理批号：KY-2033-2-4-1），所有患者签署知情同意书。
1.2 诊断标准及纳入、排除标准
MAFLD诊断标准参考2020年欧洲肝病学会发布的国际标准
［18］，该标准与2020年亚太肝病研究学会标准一致且更加细化
［19］，具体诊断标准：影像学或肝脏病理的基础上发现脂肪病变大于5%，并至少符合以下条件中的一项：体质量指数（BMI）≥23 kg/m
2；患有2型糖尿病；体质量正常或偏瘦者，至少存在两种代谢风险异常：腰围男性≥90 cm，女性≥80 cm；血压≥130/85 mmHg或正接受高血压治疗；血浆甘油三酯（TG）≥1.70 mmol/L或正接受降脂药治疗；血浆高密度脂蛋白胆固醇，男性<1.0 mmol/L，女性<1.3 mmol/L，或正接受降低胆固醇药物治疗； 糖尿病前期，即空腹血糖5.6~6.9 mmol/L，或餐后2 h血糖时7.8~11.0 mmol/L，或糖化血红蛋白HbA1c 5.7% ~6.4%；胰岛素抵抗评分的稳态模型评估≥2.5；血浆高敏C反应蛋白水平>2 mg/L。
纳入标准：年龄18~75岁；HBV感染超过6个月，病情稳定（ALT/AST<3倍正常值上限）；近2周未口服中药/中成药以及抗生素；签署知情同意书同意加入本研究的患者。排除标准：合并肝硬化、恶性肿瘤以及妊娠期或哺乳期女性。本研究通过超声影像诊断脂肪肝及其程度，由两名高年资超声专业医生同时判断得出结果。
1.3 临床信息收集
基线信息：身高、体质量、腰围、合并疾病等；化验指标：血常规，肝功、肾功、血糖、血脂、甲状腺功能、心肌酶、CRP、糖化血红蛋白、嗜肝病毒标记物等。影像学信息：腹部B超，肝脏弹性监测。
1.4 舌苔标本采集
收集晨起空腹的舌苔样本，使用舌苔拭子将舌头从根部刮到尖端5次，将拭子放入装有1 mL磷酸缓冲盐水（PBS）的无RNase Eppendorf管中，搅拌拭子，重复2次确保舌苔充分采集。将试管在5000×g下离心5 min。上清液和沉淀物分别保存在无菌试管中，并在-80 ℃下储存。
1.5 16s rDNA测序
通过CTAB法提取样本总DNA，经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测质量后，使用由上海百趣生物医学科技有限公司合成的特异性引物341F （5'-CC TACGGGNGGCWGCAG-3'）和 805R（5'-GACTACH VGGGTATCTAATCC-3'）靶向扩增16S rRNA基因V3-V4区（反应体系含Phusion Hot Start Mix，循环条件为98 ℃预变性30 s，32个循环的98 ℃ 10 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，终延伸72 ℃ 10 min）；扩增产物经AMPure XT磁珠纯化、Qubit定量及凝胶电泳验证后，使用Agilent 2100生物分析仪和Illumina文库定量试剂盒评估文库质量（浓度≥2 nmol/L），合格文库经变性后上机进行2×250 bp双端测序（NovaSeq 6000 SP试剂盒）。生物信息分析包括：Cutadapt去除接头、FLASH拼接序列、fqtrim过滤低质量读段（窗口平均质量<20，长度≥100 bp）、Vsearch去嵌合体，DADA2去噪生成ASV，基于SILVA数据库（v138）进行物种注释，并通过PICRUSt2预测功能通路。实验全程设置超纯水阴性对照，数据经严格质控（如嵌合体过滤、单例ASV剔除），确保结果可靠性。V3-V4区选择基于其高分类分辨率及对口腔菌群的覆盖度，双端测序策略提高了序列拼接准确性。
1.6 非靶向代谢组学检测
采用基于 LC-MS/MS 系统结合四极杆-静电场轨道阱 Orbitrap 质谱仪（Thermo Fisher Scientific）的技术对人舌苔拭子样本进行代谢组学检测。样本处理时，先离心取 100 μL 上清液旋干，用含同位素标记内标的提取液（甲醇∶乙腈∶水 = 2∶1∶1 （V/V））复溶，经涡旋混匀、超声、静置、离心后取上清上机检测，并将所有样品等量上清混合成质量控制（QC）样品一同检测。上机检测使用Vanquish超高效液相色谱仪，通过特定色谱柱对目标化合物进行色谱分离，Orbitrap Exploris 120质谱仪在控制软件下进行一级、二级质谱数据采集。
1.7 统计学分析
计量资料用均数±标准差（正态分布）或中位数（四分位间距）（非正态分布）表示，组间比较采用
t检验或非参数检验；计数资料用百分比表示，组间比较采用χ
2检验。舌苔微生态分析包括数据拆分、拼接和过滤、DADA2去噪、多样性分析、物种注释、差异分析和高级分析等，方法参考文献［
20］。舌苔代谢组学分析包括对原始数据进行偏离值过滤、缺失值过滤、缺失值填补和数据标准化处理，接着运用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）等多元变量统计分析，结合
t检验等筛选差异代谢物，再对差异代谢物进行层次聚类分析、Box-plot分析、相关性分析等多种可视化分析，并利用KEGG数据库进行功能注释和富集分析，以探究其参与的生物学通路。差异性比较、小提琴图、PCoA分析、LeFse分析、热图、相关性分析等，使用R-3.4.4软件。PICRUSt2 软件用于基于标记基因序列来预测功能丰度。
P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 一般资料比较
本研究共纳入95例符合MAFLD诊断标准的患者，其中单纯MAFLD组48例，MAFLD+CHB组47例。两组在年龄、性别、BMI、腰围以及合并疾病的差异无统计学意义，且多数血液学指标差异亦无统计学意义。与单纯MAFLD组相比，MAFLD+CHB组在空腹血糖水平、谷氨酰转移酶（GGT）、总胆固醇水平以及甘油三酯与葡萄糖比值方面均较低（
P<0.05），经超声诊断的脂肪肝程度也较轻。通过计算天冬氨酸氨基转移酶与血小板比值指数（APRI）及纤维化-4指数（FIB-4），结果显示两组在纤维化程度上的差异并无统计学意义（
表1）。
MAFLD+CHB组8例患者HBVDNA弱阳性（<400 IU/mL），其余均阴性，有4例未抗病毒治疗，其余4例接受一线口服抗病毒药治疗；HBVDNA阴性的39例患者接受一线抗病毒药治疗。
2.2 两组患者舌苔差异菌群分析
2.2.1 序列聚类分析
对两组患者的舌苔标本进行16S rDNA V3-V4区基因片段的扩增，扩增产物经过1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示片段大小550~650 bp。随后对原始序列进行过滤，并在相似度为100%的水平上对过滤后的序列进行聚类分析，共获得6058个扩增子序列变体，以及4 332 061个高质量序列。
2.2.2 多样性分析
相较于单纯MAFLD患者，合并HBVDNA感染的患者舌苔菌群多样性呈现出下降的趋势，然而该差异无统计学意义（图1A~C）。PCoA结果显示，两组在Beta多样性层面存在差异性（图1D）。
2.2.3 物种丰度注释
基于物种相对丰度表，选取在各分类水平上相对丰度排名前30的群落组成数据，依据分类单元的丰度分布特征或样本间的相似程度进行聚类分析。根据聚类结果，对分类单元和样本分别进行排序，通过热图形式呈现。在门水平上，表达丰度较高的优势菌主要包括Proteobacteria、Bacteroidota、Firmicutes、Patescibacteria、Fusobacteriota、Actinobacteriota以及Depedentiae等（图1E）。在属水平上，Prevotella_7、Veillonella、Neisseria、Streptococcus及Fusobacterium等呈现出较高的表达丰度（图1F）。
2.2.4 差异性分析
在门水平上，两组间存在显著差异的菌群包括候选门
Patescibacteria、梭杆菌门和
Depedentiae（
图2A）。在属水平上，差异最显著的5种菌群依次为隐匿杆菌目
Absconditabacteriales、
Megasphaera、
Hydrogenophaga、双歧杆菌属和埃希-志贺氏菌属（
图2B）。进一步采用结合秩和检验与线性判别分析的LEfSe分析结果显示，与单纯MAFLD组相比，合并HBV感染组中
Patescibacteria、
Absconditabacteriales和
Hydrogenophaga的丰度升高，而
Megasphaera的丰度则降低。
2.2.5 差异菌群的相关性分析
相关性分析显示，
Patescibacteria与谷氨酰转移酶、总胆固醇、谷丙转氨酶、碱性磷酸酶负相关（
P<0.05，
图3A）；
Absconditabacteriales与碱性磷酸酶、谷氨酰转移酶、总胆固醇负相关，
Hydrogenophaga与血红蛋白正相关，与总胆红素正相关，
Megasphaera与载脂蛋白B、低密度脂蛋白、总胆固醇正相关（
P<0.05，
图3B）。
Hydrogenophaga与
Megasphaera负相关，
Megasphaera与
Absconditabacteriales负相关（
P<0.05，
图3C）。
2.2.6 功能注释
基于16S rDNA基因测序数据，对差异检验
P<0.05的前30个功能进行STAMP分析，与具体的KEGG功能通路进行映射，显示两组差异菌主要参与了多种氨基酸及物质的降解，包括缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等人体必需的支链氨基酸、柠檬烯、萜品烯、香叶醇、氨基苯甲酸、赖氨酸的降解以及丁酸和脂肪酸的代谢，合并HBV感染组上述功能路径中相关菌群丰度含量更高（
图4）。
2.3 两组患者舌苔差异代谢物分析
对符合以下标准的样本进行非靶向代谢组学的分析（MAFLD组、 MAFLD+CHB组各37例）：代谢物提取浓度≥10 ng/μL；QC样本的峰面积相对标准偏差（RSD）<30%；色谱峰保留时间漂移<0.1 min。差异代谢物的筛选基于多重校正（FDR<0.05）和VIP>1.0的严格标准，最大程度降低了样本量差异对结果的影响。
2.3.1 两组患者舌苔非靶向代谢组学的变化
OPLS- DA显示两组样本在代谢物层面的存在差异（
图5A），火山图显示与单纯MAFLD组相比，合并CHB组舌苔中检测到上调的代谢物有469种，下调的代谢物达2306种（
图5B），进一步筛选出变量重要性投影（VIP）和 log₂Fold Change（|FC|>1）等指标上表现突出且排名前 10 的上调和下调代谢物（
图5C），合并CHB组多种代谢物上调，其中包括脂质及类脂质分子、氨基酸和肽类、生物碱类及有机氧、有机杂环等，下调代谢物主要脂质及类脂质分子及有机氧、有机杂环等，这些分子与代谢、炎症、免疫及肿瘤形成有关。菌群和代谢物的相关性分析提示上调代谢物基本与
Patescibacteria、Absconditabacteriales、Hydrogenophaga正相关，与
Megasphaera负相关，反之亦然（
图6）。
2.3.2 舌苔非靶向代谢组学通路富集情况分析
KEGG通路富集差异丰度得分结果显示（
图5D），合并HBV感染组显著富集且总体上调的通路包括：核苷酸代谢、嘧啶代谢及前列腺癌通路，显著富集且下调的通路有半胱氨酸和蛋氨酸代谢、果糖和甘露糖代谢。
3 讨论
本研究探讨单纯MAFLD与合并低病毒载量或病毒阴性的HBV感染的MAFLD患者在口腔菌群和代谢物方面的差异，通过多组学联合分析，揭示了MAFLD-CHB组的空腹血糖、总胆固醇、GGT、甘油三酯/葡萄糖指数及脂肪肝程度显著降低，这一发现与以往研究一致
［9］，但本研究进一步从口腔微生态视角揭示了潜在的跨器官调控机制。HBV对代谢相关性脂肪肝的脂类代谢的正向调节作用与另一研究结论也相似
［21］，该研究指出HBV感染会增加肝纤维化的总体风险，但不论是与健康对照组比较还是与合并MAFLD组比较，HBV感染组的代谢指标如总胆固醇、甘油三酯、血糖等水平均偏低，遗憾的是该研究未收集HBV病毒载量及抗HBV治疗的相关数据。
分析口腔微生态发现，合并CHB组中
Patesci-bacteria、
Absconditabacteriales以及
Hydrogenophaga的丰度显著升高，而
Megasphaera的丰度则显著下降。相关性分析进一步揭示了这些菌群与生化指标之间的关联：
Patescibacteria与谷氨酰转移酶、总胆固醇呈负相关关系；
Absconditabacteriales同样与谷氨酰转移酶、总胆固醇呈负相关；而
Megasphaera则与载脂蛋白B、低密度脂蛋白、总胆固醇呈正相关。Patescibacteria作为一种新发现的细菌门，Patescibacteria在小鼠的溃疡性结肠炎组中丰度下降，中药及柳氮磺吡啶组丰度上升，且其表达与IL-18、IL-1β、TNF-α、IL-6等验证因子密切相关
［22］。针对
Absconditabacteriales与人体健康的专门报道较少，研究提示健康人唾液中的
Absconditabacteriales可被新型氟喹诺酮类药物拉舒氟沙星短暂下调，提示其可能是抗生素作用的靶点
［23］。
Hydrogenophaga一类重要的嗜水性细菌，广泛存在于多种环境中，研究提示室内空气微生物的
Hydrogenophaga 丰度升高与肺部疾病有关
［24］。有研究报道
Megasphaera与免疫性及代谢性疾病的相关，银屑病患者粪便该菌丰度升高，且与全身炎症以及肝功异常有关，该菌可能是银屑病关节炎患者肠道菌群与附着点炎和（或）指（趾）炎之间的一个关联因素
［25］。
Megasphaera是伴有胃肠道自主神经病变的 2 型糖尿病患者的特征菌属，可能参与细菌对上皮细胞的侵袭以及致病性大肠杆菌感染
［26］。
代谢组学揭示合并CHB组脂质类及氨基酸类代谢物显著上调，而Patescibacteria与这些代谢物的正相关提示其可能通过降解复杂脂质生成游离脂肪酸，从而改善脂代谢紊乱。值得注意的是，Hydrogenophaga与芳香族氨基酸的正相关可能通过调节宿主BCAAs循环，增强胰岛素敏感性，这与MAFLD+CHB组空腹血糖水平降低一致。相反，Megasphaera的丰度降低与脂肪酸代谢物负相关，可能减少丁酸等促炎代谢物的产生，抑制炎症通路激活，进而缓解肝脏炎症。上述发现支持“口腔菌群-代谢物-肝脏”轴的存在，为HBV感染改善MAFLD提供了跨器官调控证据。基于上述多组学联合分析结果，合并低病毒载量或经治HBV感染的MAFLD患者，其口腔菌群结构（如Patescibacteria、Hydrogenophaga等丰度升高，Megasphaera降低）及代谢物谱（脂质、氨基酸类代谢物上调）发生显著改变，且这些变化与血糖、血脂、肝脏酶学等代谢指标的较低水平及较轻的肝脏脂肪变性程度相关。这提示，慢性HBV感染或其相关的管理方式可能与MAFLD患者口腔微生态及代谢物功能的调节有关，进而影响其代谢表型，为“口腔-肝脏轴”在病毒-代谢共病中的潜在作用提供了初步证据。然而，该关联是否具有因果性及其临床意义仍需进一步研究验证。
基于KEGG通路富集差异分析，HBV感染组显著富集且总体上调的通路包括：核苷酸代谢、嘧啶代谢及前列腺癌通路，显著富集且下调的通路有半胱氨酸和蛋氨酸代谢、果糖和甘露糖代谢。HBV作为一种病毒，其在宿主细胞内的复制需要大量的核苷酸原料。因此，上调的核苷酸代谢和嘧啶代谢通路可能是为了满足 HBV复制对核苷酸的需求。对于脂肪肝而言，肝脏细胞在脂肪堆积的情况下，可能也需要通过调整核苷酸代谢来维持细胞的基本功能和修复受损的 DNA。在乙肝合并脂肪肝的情况下，半胱氨酸和蛋氨酸代谢下调，可能影响到肝脏内的甲基化平衡，进而影响基因表达调控和细胞膜的稳定性。此外，半胱氨酸是谷胱甘肽的重要组成成分，谷胱甘肽是肝脏内重要的抗氧化物质，该通路下调可能削弱肝脏的抗氧化能力，使肝脏更容易受到氧化应激损伤，这在乙肝和脂肪肝疾病进展中都可能起到重要作用。果糖和甘露糖是糖类代谢的一部分。在正常生理状态下，肝脏能够有效代谢果糖和甘露糖，为机体提供能量。然而，在合并 HBV 感染的脂肪肝患者中，这一代谢通路下调。一方面，HBV 感染可能干扰了肝脏细胞对糖类代谢的调控机制，另一方面，脂肪肝状态下肝脏内脂肪堆积可能影响了糖代谢相关酶的活性或表达。这种下调可能导致肝脏对果糖和甘露糖的利用效率降低，影响能量供应，同时也可能影响相关糖蛋白和糖脂的合成，进而影响肝脏细胞的正常功能和信号传导
［27-29］。而前列腺癌通路的显著富集可能与乙肝和脂肪肝引发的慢性炎症微环境以及细胞增殖调控紊乱有关，但这一通路与两种疾病的确切联系还需要更多研究去揭示。
综上所述，本研究提示MAFLD患者合并稳定期的HBV感染时机体代谢状态与内环境存在差异，这种差异从口腔部位已经有所表现，在临床诊疗中应对这两类患者分别提供精细化管理，积极抗病毒治疗和系统的MAFLD治疗均是必要的。针对本研究的局限性和未来可开展的研究分析如下：本研究仅纳入MAFLD患者（单纯组与合并CHB组），未设置健康对照组，因此对结果的诠释仅能体现HBV感染对MAFLD存在的可能影响，无法区分MAFLD本身的口腔菌群特征。后续研究需进一步完善健康对照组、单纯CHB组的检测，绘制比较健康人群、单纯MAFLD、单纯CHB以及MAFLD+CHB 4组间更加完整的菌群和代谢图谱。本研究合并HBV组中92%患者接受口服抗病毒治疗（如恩替卡韦、替诺福韦），已有研究提示抗病毒治疗可能对肠道微生态产生影响
［30］，也有研究表明核苷类似物可能影响宿主细胞代谢通路，进而影响口腔上皮细胞能量代谢，同时调节全身免疫状态（如Th17/Treg平衡），间接改变口腔微环境
［31］。本研究纳入的未接受抗病毒治疗的CHB患者比例较低（8%），导致难以通过亚组分析完全剥离药物效应与HBV感染本身的影响。这一局限性可能影响结果的解释，尤其是口腔菌群差异的归因（药物
vs 病毒），后续可开展抗病毒治疗前后的菌群及代谢分析，进一步细化单纯HBV感染及抗病毒治疗的影响；本文横断面研究通过排除了近2周内使用抗生素及中药等可能对口腔微生态影响的因素，但影响患者的微生态的因素较多，例如饮食结构、生活习惯等，本研究入组时同时采集了患者的特殊生活习惯及特殊饮食嗜好，除个别偏食辣味及晚睡外，未发现有特殊异常的患者，吸烟及少量饮酒情况在两组占比较少，且两组对比无差异。因此，可以认为本研究结果主要与慢性HBV感染及其相关的治疗有关。后续将开展可控的动物实验以及扩大样本量的多时点的临床研究对本结果进行验证和深入分析。
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