食管癌是一种高度侵袭性的恶性消化道肿瘤，是全球第7大常见癌症，也是全球癌症相关死亡的第6大常见原因
［1， 2］。中国食管癌的年发病率和死亡率占全球总病例数的一半以上
［3］。在中国，食管癌是第6大最常见的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第4大原因
［4］。食管癌主要分为食管鳞状细胞癌和食管腺癌两种组织学亚型，在高收入国家，大多数食管癌患者患有食管腺癌。食管鳞状细胞癌主要分布于东亚地区，在中国，超过90%的食管癌病例是食管鳞状细胞癌
［5， 6］。尽管近年来食管癌的治疗取得了长足的进步，但食管鳞状细胞癌的预后仍然很差，5年生存率不到30%，在过去的30年里，FDA只批准了3种针对食管腺癌的靶向疗法，而对食管鳞状细胞癌的靶向药物未见进展
［7， 8］。食管鳞状细胞癌的查出时间较晚；淋巴结转移较早；手术治疗难以根除； 治疗后容易复发转移是导致食管鳞状细胞癌预后不良的主要原因
［9］。因此，进一步了解食管鳞状细胞癌增殖、侵袭和转移的分子机制对于改进治疗方法和策略以及改善临床预后具有深远的科学意义和价值。
长链非编码RNA（lncRNA）是一种转录长度超过 200个核苷酸且不具有蛋白质编码能力的调节RNA
［10］。LncRNA已被证明与肿瘤的发生和发展密切相关。LncRNA通过多样化的机制在转录调控、转录后调控、表观遗传学等多个方面调控编码基因的表达，从而在驱动恶性表型和调节细胞信号转导等方面发挥着重要作用
［11］。目前，lncRNA在肿瘤中的作用是一个研究热点，包括乳腺癌
［12］、胃癌
［13］和膀胱癌
［14］。此外，lncRNAs在食管鳞状细胞癌中的作用也已有少量报道。例如，lncRNA KLF3-AS1通过调节miR-185-5p/KLF3轴影响食管鳞状细胞癌的侵袭转移
［15］。研究发现LINC00261是一种肿瘤抑制因子，并发现它在甲状腺癌等癌症中发挥着重要作用，但其在食管鳞状细胞癌中的表达情况及其在食管鳞状细胞癌中的作用机制仍不清楚
［16］。本研究从临床样本及生物测序结果出发，从细胞、分子生物学及动物体水平探讨了LINC00261对食管鳞状细胞癌的增殖、侵袭转移等生物学过程的影响及可能调控通路的研究，为食管鳞状细胞癌的靶向治疗和改善患者预后奠定了实验基础。
1 材料和方法
1.1 材料
人食管鳞状细胞癌细胞系Eca150、Eca9706、TE-1和Eca109以及正常食管上皮细胞HEEC细胞由河北医科大学第四医院提供，20对临床食管鳞状细胞癌及正常食管组织标本由河北医科大学第四医院胸外科提供，并收集了食管鳞状细胞癌患者的生存时间信息。pcDNA和pcDNA-LINC00261（吉玛生物科技有限公司），LINC00261和GAPDH引物（生工生物工程股份有限公司），RNA提取试剂盒（ThermoFisher），反转录试剂盒（诺唯赞生物科技有限公司），荧光定量PCR试剂盒（广州易锦生物技术有限公司），ZNF292兔抗人单克隆抗体（江苏亲科生物研究中心有限公司），GAPDH鼠抗人单克隆抗体、Ki67兔抗人单克隆抗体、Vimentin兔抗人单克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司），Transwell膜嵌套（本生（天津）健康科技有限公司），CCK-8试剂盒（大连美仑生物技术有限公司），凋亡试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 生物信息学分析
从GEO（
https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）网站下载GSE149612数据集信息，通过服务器linux进行指控、比对、定量、压缩，并通过DESeq2进行差异分析，再通过R语言进行绘图。通过ENCORI（
https：//rnasysu.com/encori/）数据库下载食管癌组织及正常组织中LINC00261的表达信息。通过ENCORI网站下载食管癌中LINC00261、miR-23a-3p与ZNF292的相关性分析结果。DIANA（
https：//dianalab.e-ce.uth.gr/html/diana/web/index.php？r=tarbasev8）和miRDB（
https：//mirdb.org/）以及ENCORI网站对miR-23a-3p的下游靶点进行分析。
1.2.2 细胞培养和转染
将Eca150、TE-1和Eca109和 Eca9706食管鳞状细胞癌细胞系细胞均在含有10%胎牛血清的RPMI 1640中培养，并在5% CO2、37 ℃的培养箱中进行培养。pcDNA-LINC00261过表达载体、pcDNA对照组载体按照Lipofectamine 3000说明书将这些质粒转染到细胞中。
1.2.3 qRT-PCR法检测基因的表达
将各组细胞按提取试剂盒说明书提取总RNA，然后按照反转录试剂盒说明书配体系上机进行反转录。按照荧光定量PCR试剂盒的说明书配体系进行 qRT-PCR定量分析。该值使用2
-∆∆Ct方法进行计算，以 GAPDH作为内参。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列（
表1）。
1.2.4 CCK-8
将每组细胞以1×103/孔的浓度加入96 孔板中，每组3个重复孔。将每组细胞在37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养0、24、48、72、96 h。在每个时间点加入10 μL CCK-8溶液，并在37 ℃的温度下孵育2 h。然后测量吸光度值A450 nm。
1.2.5 菌落形成实验
将每组对数生长细胞以1×103细胞/孔的浓度接种到 6孔板中，并在5% CO2、37 ℃培养箱中孵育7 d。然后，用PBS清洗6孔板，用4%多聚甲醛在室温下固定20 min，在用PBS清洗6孔板，再用结晶紫溶液染色20 min。最后，晾干计算相对菌落形成。
1.2.6 Transwell侵袭转移实验
将各组转染好的细胞按5×104浓度溶解到不含胎牛血清的基础培养基中，然后接种在Transwell的上室中总体积不超过300 μL。下室中加入含胎牛血清的完全培养基600 μL。然后将细胞放到培养箱中孵育24 h。然后洗去Transwell上室中的溶液，用4%多聚甲醛进行固定15 min，用PBS清洗后用结晶紫染色15 min，用PBS清洗晾干后在显微镜下进行计数拍照。侵袭实验需要在前1 d将Matrigel胶溶解涂到Transwell上室中并放到培养箱中使其凝固。
1.2.7 流式细胞术检测细胞凋亡
收集各组食管鳞状细胞癌细胞并悬浮在100 μL缓冲溶液中。每管细胞加用FITC和PI染料5 μL，避光染色20 min。之后向每管中加入400 μL结合缓冲液，并在1 h内通过流式细胞仪评估细胞凋亡。
1.2.8 细胞核RNA和细胞质RNA的分离
按照试剂盒的说明书，使用细胞质和核RNA纯化试剂盒分离细胞核和细胞质RNA。纯化和DNaseI处理后，如上所述，将分离的细胞核或细胞质RNA逆转录并用于PCR。
1.2.9 双荧光素酶测定
通过查阅文献结合targetscan网站（
https：//www.targetscan.org/vert_80）的结合位点信息构建了相应的突变质粒，使用 Lipofectamine 3000将LINC00261-WT或LINC00261-MUT与miR-23a-3p模拟物或NC共转染到Eca150细胞中。使用 Lipofectamine 3000也将ZNF292-WT或ZNF292-Mut 与 miR-23a-3p 模拟物或NC共转染到Eca150细胞中。48 h后，根据方案通过双Glo荧光素酶测定系统检测相对荧光素酶活性。海肾信号用于使荧光素酶活性标准化。
1.2.10 Western blotting
使用含有1%蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解每组细胞获取每组的蛋白质。然后使用10% SDS-PAGE 凝胶分离它们并通过冰水浴转移到PVDF膜上。将膜在室温下用快速封闭液密封半h。然后加入一抗并在4 ℃下孵育过夜。第2天用TBST洗膜后加入对应二抗孵育2 h，最后用ECL试剂显色。使用抗体分别为GAPDH（1∶50 000）、ZNF292（1∶1000）。
1.2.11 裸鼠皮下移植瘤
动物实验均符合《实验动物护理和使用指南》（伦理批号：20240318），裸鼠购自思研（北京）生物技术有限公司，取10只6周龄、体质量18~22 g的雄性 BALB/c裸鼠。这些小鼠在SPF级标准的无菌环境中饲养。将各组构建好的稳定转染的Eca150细胞按5×106的浓度注射到小鼠的腋下，5只/组。接种后观察小鼠的肿瘤重量变化。注射后3周左右，对小鼠实施安乐死，并提取肿瘤组织进行称重及免疫组化实验。
1.2.12 免疫组织化学
从肿瘤组织中去除蜡并恢复其水分后，使用0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）进行抗原修复。添加抗Ki-67（1∶400）、抗 Vimentin（1∶400）和抗ZNF292（1∶200），在4 ℃的温度下持续1晚。在此之后，使用HRP二抗和DAB显影剂进行免疫测定。
1.3 统计学分析
本文将实验数据表示为均数±标准差。GraphPad Prism 8用于分析和绘制所有数据。采用t检验比较两组之间的差异，以P<0.05认为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 LINC00261在食管鳞状细胞癌中明显低表达
GSE149612数据集的分析结果显示LINC00261在食管鳞状细胞癌组织中明显低表达（
图1A、B）；通过ENCORI网站信息同样发现LINC00261在食管癌组织明显低表达（
图1C）；qRT-PCR结果显示LINC00261在食管鳞状细胞癌组织中表达降低（
P<0.0001，
图1D），相比于正常组。LINC00261表达量明显降低（
P<0.05），相比于正常食管上皮HEEC细胞（
图1E~H）。将LINC00261的表达量按中位数进行排序分为高表达组和低表达组，结果显示高表达组患者生存时间明显延长（
P=0.0332，
图1I）。
2.2 过表达LINC00261可以明显抑制食管鳞状细胞癌的增殖、侵袭转移
qRT-PCR结果显示，与对照组相比，pcDNA-LINC00261 组中LINC00261表达明显增加（Eca150：
P<0.0001，Eca9706：
P=0.0071，
图2A）。CCK-8（Eca150：
P<0.0001，Eca9706：
P=0.0057，
图2B）和克隆形成实验（Eca150：
P=0.0058，Eca9706：
P=0.0010，
图2C）显示，LINC00261 的过表达组明显抑制了细胞活力并减少了细胞中的集落数量。Transwell侵袭转移实验结果显示相比对照组，LINC00261的过表达组细胞的侵袭（Eca150：
P<0.0001，Eca9706：
P<0.0001，
图2D）和转移能力（Eca150：
P<0.0001，Eca9706：
P<0.0001，
图2D）明显降低。此外，流式细胞术检测凋亡的结果显示，与对照组相比，pcDNA-LINC00261组的凋亡细胞显著增加（Eca150：
P=0.0024，Eca9706：
P<0.0001，
图2E）。
2.3 LINC00261通过结合miR-23a-3p靶向作用ZNF292
LINC00261主要位于细胞质中（
图 3A），生物信息学预测显示，LINC00261和miR-23a-3p在食管癌中是负相关关系（
r=-0.512，
P=3.28e-12，
图3B），通过ENCORI、DIANA和miRDB三个网站对靶基因进行预测并取交集发现530个可能的靶基因（
图3C）；通过查阅文献及相关性分析我们确定ZNF292作为miR-23a-3p的靶点，ENCORI网站分析中miR-23a-3p与ZNF292成负相关（
r=-0.468，
P=3.33e-10，
图3D），LINC00261与ZNF292成正相关（
r=0.323，
P=2.69e-05，
图3E），LINC00261序列和miR-23a-3p序列之间存在特异性结合位点，同时miR-23a-3p序列和ZNF292序列之间存在特异性结合位点（
图3F）。相比于对照组，miR-23a-3p组LINC00261-WT（
P<0.0001）、ZNF292-WT（
P<0.0001）的荧光素酶活性明显降低，但LINC00261-MUT、ZNF292-MUT荧光素酶活性没有变化（
图3G）。Western blotting检测显示pcDNA-LINC00261组ZNF292的表达相比于pcDNA组明显升高（
P=0.0027）。
2.4 体内实验验证LINC00261在食管鳞状细胞癌中的作用
与pcDNA组相比，pcDNA-LINC00261组肿瘤质量明显降低（
P=0.0009，
图4A）。免疫组化结果显示增殖指标Ki67明显降低，转移指标Vimentin表达明显降低（
图4B）。
3 讨论
本研究首先通过分析食管鳞状细胞癌及正常食管组织的测序结果创新性地发现了LINC00261在食管鳞状细胞癌组织中明显低表达，并通过生物信息学网站、临床组织样本及细胞实验进行了验证，证实了测序结果的准确性。LINC00261的转录位点位于第20条染色体上
［17］。研究发现LINC00261在多种癌症中发挥着抑制肿瘤的作用，涉及多种细胞过程。例如，一项研究发现LINC00261是子宫内膜癌预后的潜在生物标志物
［18］。同样有研究报道LINC00261表达还可以减少乳腺癌细胞的增殖和迁移
［19］。
为了进一步明确LINC00261在食管鳞状细胞癌中的作用，我们通过在食管鳞状细胞癌细胞系Eca150和Eca9706中过表达LINC00261，结果发现通过过表达LINC00261可以明显抑制肿瘤的增殖、侵袭和转移。Yi Li等在乳腺癌中同样发现LINC00261表达明显降低，并研究发现LINC00261可以吸附miR-550a-3p来调节SDPR，从而抑制乳腺癌细胞的活力和微球形成，并降低乳腺癌干细胞生物学特性，而起到抗肿瘤的作用
［19］。Zou等
［20］同样研究发现LINC00261在胰腺癌组织和细胞中低表达。LINC00261在胰腺癌细胞中通过靶向FOXP3对SCP2的负调节发挥抑制血管生成和阻滞细胞周期进程的作用。Liao等
［21］同样发现LINC00261在非小细胞肺癌组织和细胞系中的表达显著低于邻近正常组织或对照细胞系，通过过表达LINC00261其可以通过下调 Snail表达来影响上皮间质转化过程来抑制细胞增殖和转移。这些结果均表明LINC00261在多种肿瘤中发挥着肿瘤抑制因子的作用，现有研究并未明确报道LINC00261在食管鳞状细胞癌中的作用，本研究创新性的发现了LINC00261在食管鳞状细胞癌的抗肿瘤作用。
LncRNA可通过与细胞核或细胞质中的染色质、蛋白质或RNA相互作用，通过基因组表达调节、表观遗传修饰和顺式或反式转录后调控参与各种生理和病理的细胞活动
［22］。越来越多的报告表明，lncRNAs通过与特异性miRNA结合的ceRNA机制而对肿瘤的发生发展产生影响
［23］。并且在骨肉瘤
［24］、结肠癌
［25］等多种肿瘤中发现LINC00261均通过ceRNA机制发挥着抗肿瘤作用。因此，为了进一步挖掘并找到靶向的miRNA，我们进行了一系列的后续研究。本研究通过亚细胞分离实验，发现LINC00261主要定位于食管鳞状细胞癌细胞的细胞质中，表明LINC00261可能通过作用miRNA调节其下游基因表达。我们通过生物信息学网站预测了LINC00261的靶标miRNA并确定了miR-23a-3p，据报道它在多种癌症中发挥促进肿瘤进展的作用，例如结肠癌
［26］、肝细胞癌
［27］和口腔鳞状细胞癌
［28］等。此后，我们进一步探讨了miR-23a-3p对食管鳞状细胞癌进展的机制。我们进一步通过生物信息学网站预测了miR-23a-3p的靶基因，鉴定出ZNF292作为其靶点。ZNF292是一种生长激素依赖性锌指转录因子，属于kruepel C2H2型锌指蛋白家族。ZNF292被认为是候选的肿瘤抑制基因。已在肝癌、结肠癌和骨髓癌中发现其突变
［29］。Gong等
［30］研究发现ZNF292的低表达与食管鳞状细胞癌的不良预后相关，ZNF292通过SKP2/P27信号抑制食管鳞状细胞癌的增殖。本研究又通过信息网站发现LINC00261与miR-23a-3p之间和miR-23a-3p与ZNF292之间存在负相关关系，同时LINC00261与ZNF292之间存在正相关关系，间接验证了LINC00261与miR-23a-ap/ZNF292的靶向作用，最后本研究又通过裸鼠体内实验进一步说明了过表达LINC00261可以抑制食管鳞状细胞癌的增殖转移。Wang等
［31］仅在胰腺癌中发现LINC00261过表达通过降低胰腺癌细胞中miR-23a-3p的表达来抑制细胞活力和侵袭，并增强了细胞凋亡，但miR-23a-3p具体通过作用何种分子并未明确报道。并且在食管鳞状细胞癌的研究中仅研究了LINC00261对食管鳞状细胞癌顺铂、5-氟尿嘧啶等化疗耐药方面的机制研究
［4， 32］，并且其调控耐药的机制与本研究研究的miR-23a-3p/ZNF292通路是不同的，而本研究创新性的明确了LINC00261在食管鳞状细胞癌中的抗肿瘤作用及其可能通过miR-23a-3p/ZNF292通路发挥抗肿瘤的作用。
本研究发现，在食管鳞状细胞癌组织和细胞中LINC00261水平均显著降低。过表达LINC00261可通过调节miR-23a-3p/ZNF292通路在体内和体外抑制肿瘤的增殖侵袭转移。因此，本研究表明，LINC00261可能作为食管鳞状细胞癌治疗的潜在靶点。本研究尚缺乏临床多中心数据的验证，以及ZNF292作用的具体通路均有待接下来的研究中进一步地探索。
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