加味柴胡桂枝汤通过抑制JAK2/STAT3信号通路改善慢性不可预见性温和应激模型小鼠的焦虑和抑郁状态

Modified Chaihu Guizhi Decoction alleviates anxiety- and depression-like behaviors in mice with chronic unpredictable mild stress by inhibiting the JAK2/STAT3 signaling pathway

摘要

目的 探讨加味柴胡桂枝汤（MCGD）对慢性不可预见性温和应激模型（CUMS）小鼠焦虑抑郁的干预作用及机制。 方法 通过文献检索获取加味柴胡桂枝汤的主要化学成分，使用多重数据库分析预测药理机制。动物实验验证：选用雄性SPF C57BL/6J小鼠，每日给予小鼠2次随机应激刺激，共持续28 d，制备CUMS模型。以加味柴胡桂枝汤灌胃或氟西汀腹腔注射进行干预，根据干预方式的不同将小鼠分为对照组（Control）、慢性不可预见性温和应激模型组（CUMS）、氟西汀阳性对照组（FLX）、加味柴胡桂枝汤低剂量组（MCGD-L）、加味柴胡桂枝汤高剂量组（MCGD-H），15只/组。利用蔗糖偏好、强迫游泳实验评估小鼠抑郁状态，利用旷场、高架十字实验评估小鼠焦虑状态，RT-qPCR检测时钟基因、炎症因子，Western blotting检测JAK2/STAT3通路表达水平，免疫荧光检测小胶质细胞的活化水平。 结果 网络药理学结果显示，加味柴胡桂枝汤改善焦虑抑郁的主要活性成分为槲皮素、金合欢素、芒柄花素、川陈皮素、黄芩素等；GO功能富集分析共得到607条信号通路，其中生物过程447条，细胞组分61条，分子功能99条；KEGG富集分析显示，加味柴胡桂枝汤改善焦虑抑郁的通路主要涉及JAK2/STAT3和NF-κB信号通路。动物实验成功构建CUMS模型，氟西汀阳性对照组和加味柴胡桂枝汤治疗组小鼠焦虑、抑郁状态减轻。加味柴胡桂枝汤可降低Iba1的表达（P<0.01），改善炎症相关指标（P<0.01），逆转时钟基因昼夜节律紊乱（P<0.01）；下调JAK2、p-STAT3、p-NF-κB、IL-1β、IL-6蛋白表达水平（P<0.01）。 结论 加味柴胡桂枝汤能有效调节炎症通路，抑制JAK2/STAT3信号转导和小胶质细胞过度活化，改善焦虑抑郁状态。

Abstract

Objective To investigate the mechanisms of Modified Chaihu Guizhi Decoction (MCGD) for ameliorating anxiety- and depression-like behaviors in a mouse model of chronic unpredictable mild stress (CUMS). Methods The main chemical constituents of MCGD were identified through literature review, and network pharmacology analysis was performed to predict the potential pharmacological mechanisms of MCGD. For in vivo validation, male C57BL/6J mice were randomized into control group, CUMS model group, fluoxetine (FLX) treatment group, and low- and high-dose MCGD treatment groups (n=15), and in all but the control group, CUMS models were established by daily exposure to two randomized stressors for 28 consecutive days. Starting from 3 days prior to modeling, MCGD and fluoxetine treatments were administered daily via gavage and intraperitoneal injection, respectively. Depression- and anxiety-like behaviors of the mice were assessed using sucrose preference test, forced swim test, open field test and elevated plus maze test. The changes in mRNA expressions of the clock genes and inflammatory markers and expressions of the JAK2/STAT3 signaling proteins were detected using RT-qPCR and Western blotting, and immunofluorescence staining was used to detect microglia activation in the mice. Results The key active compounds in MCGD identified by network pharmacology analysis included quercetin, acacetin, formononetin, nobiletin, and baicalein. GO analysis identified 607 enriched pathways, and KEGG pathway enrichment revealed significant involvement of the JAK2/STAT3 and NF-κB signaling pathways. In the mouse models of CUMS, treatment with both fluoxetine and MCGD significantly alleviated anxiety- and depression-like behaviors. MCGD treatment significantly reduced Iba1 expression, improved the inflammatory markers, reversed the decrease in clock gene circadian rhythm amplitude, and obviously downregulated the expressions of JAK2, p-STAT3, p-NF-κB, IL-1β, and IL-6 proteins. Conclusion MCGD effectively alleviates anxiety- and depression-like behaviors in CUMS mice by modulating the inflammatory pathways and inhibiting the JAK2/STAT3 signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

加味柴胡桂枝汤 / 慢性不可预见性温和应激模型 / JAK2/STAT3 / 网络药理学 / 焦虑 / 抑郁

Key words

Modified Chaihu Guizhi Decoction / chronic unpredictable mild stress model / JAK2/STAT3 / network pharmacology / anxiety / depression

抑郁障碍（MDD）是一种高发且高复发率的情感性障碍，约有3.8%的人口受到其影响，是导致全球疾病负担和自杀死亡的主要原因之一^［1-3］。值得注意的是，约70 %的MDD患者伴随节律紊乱及睡眠周期异常，导致病情加重或复发，影响抑郁的治疗及预后^［4］。尽管现有的选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRIs）、5-羟色胺-去甲肾上腺素再摄取抑制剂（SNRIs）等多种抗抑郁的药物广泛应用于临床，但仍有1/3患者对一线抗抑郁药反应不佳，伴随胃肠道反应、加剧焦虑抑郁障碍等问题，最终发展为难治性抑郁（TRD）^［5-8］。可见，积极探寻MDD药物新靶点成为临床治疗亟需突破的一大难点。

传统中医药在情志疾病的治疗中具有长期实践基础和良好安全性。抑郁症属于“郁病”范畴，“肝之阴阳失和”是郁病及睡眠紊乱的共同致病因素，其体现在“肝主疏泄、藏血、舍魂”的功能失调。加味柴胡桂枝汤（MCGD）作为经方柴胡桂枝汤的加减化裁方，具有疏肝解郁、调和营卫的功效。谢炜教授运用柴胡桂枝汤治疗各种疑难杂症，尤其是失眠、焦虑和抑郁，疗效俱佳^{［9， 10］}。课题组前期研究表明柴胡桂枝汤及其活性成分能够改善小鼠的认知障碍，发挥抗炎及脑保护作用^{［11， 12］}。尽管MCGD的疗效已在临床实践中得到体现，但其作用机制尚未明确，特别是在调控神经炎症和昼夜节律方面的现代研究仍显不足。

神经炎症反应与昼夜节律系统之间存在双向调控关系^［13-15］，共同介导抑郁样行为的发生发展^［16］。Bmal1、Rev-erbα等节律蛋白可以负调控炎症因子的表达（如IL-6、TNF-α），维持中枢免疫稳态^{［17， 18］}。越来越多证据表明，抑郁动物模型常表现出昼夜活动节律减弱、睡眠-觉醒节律混乱、时钟蛋白节律紊乱等^{［19， 20］}。JAK2/STAT3作为炎症应答的重要调控轴，已被证实在中枢免疫激活及抑郁样行为中起关键作用^［21］，其不仅参与免疫和炎症反应，也与昼夜节律的调控密切相关^［22］。

本研究基于慢性不可预见性温和应激（CUMS）模型，旨在探讨MCGD是否通过调控JAK2/STAT3信号通路、抑制小胶质细胞活化和炎症因子释放，从而改善小鼠的焦虑抑郁样行为和昼夜节律紊乱，进而揭示其抗抑郁的潜在神经免疫机制。该研究不仅为加味柴胡桂枝汤抗抑郁作用提供现代药理学依据，也有望为抑郁障碍的干预提供新的思路和方向。

1 材料和方法

1.1 网络药理学方法

1.1.1 加味柴胡桂枝汤活性成分与靶点获取

加味柴胡桂枝汤由柴胡、黄芩、半夏、桂枝、白芍、人参、大枣、甘草、生姜、柏子仁、枳壳共11味中药饮片组成。其活性成分信息来源于中药系统药理学数据库（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）和BATMAN-TCM数据库（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/index.php）。在上述数据库中，活性化合物的筛选标准为口服生物利用度（OB）≥30%以及药物相似性（DL）≥0.18。

1.1.2 抑郁症疾病靶点基因获取

以“抑郁”为关键词，通过OMIM（https：//omim.org）、TTD （http：//db.idrblab.net/ttd/）和GeneCards（https：//www.genecards.org/）三个数据库中检索预测抑郁症相关的靶点基因数据。筛选疾病相关靶标的标准为相关性评分（Relevance Score）>1，并对结果进行整合与去重，最终获得抑郁症的疾病相关靶点。

1.1.3 Venn图制作

将加味柴胡桂枝汤的相关靶点与抑郁症的疾病靶点取交集，获得加味柴胡桂枝汤对抑郁症的共同靶点，通过微生信-在线生物信息学分析、可视化云平台（www.bioinformatics.com.cn）构建Venn图，直观展示靶点重叠情况。

1.1.4 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建

将加味柴胡桂枝汤与抑郁症的共同靶点基因导入STRING数据库（wwww.string-db.org）进行蛋白质-蛋白质相互作用分析，分析模式设定为“Multiple proteins”，物种限定为“Homo sapiens”。经过数据预处理，设定置信度（Confidence Score）≥0.4。

1.1.5 GO功能富集和KEGG通路富集分析

GO注释从生物过程（BP）、细胞成分（CC）和分子功能（MF）3个方面描述和定义基因产物的功能；KEGG是一个整合基因组、化学和系统功能信息的数据库。将共同靶点导入Metascape数据库（https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1）进行GO功能富集和KEGG通路分析，筛选标准为调整后的P≤0.05，以明确可能的作用机制和通路。

1.1.6 分子对接

将加味柴胡桂枝汤的核心活性成分与PPI网络中筛选出的核心靶点进行分子对接。在RCSB PDB数据库获取核心靶点蛋白三维结构，并使用Molecular Operating Environment（MOE）软件（版本：2019.0102）对受体蛋白三维结构进行去水和加氢等预处理，建立靶蛋白数据库。使用MOE软件将活性成分和受体蛋白进行分子对接，然后得到活性成分与受体蛋白之间结合的活性位点及结合能，对接结果以3D图像展示。以上数据库检索时间为2025年7月。

1.2 动物实验

1.2.1 试剂及仪器

中药饮片（南方医科大学南方医院中药房）；生理盐水（万物生物科技有限公司）；4%多聚甲醛溶液（科隆化学品有限公司）；OCT包埋胶（Sakura）；Iba1抗体（Synaptic systems）；p-STAT3、STAT3、p-NF-κB、NF-κB、IL-1β、IL-6抗体（Cell Signaling Technology），JAK2抗体（Proteintech），β-actin抗体（赛维尔），Goat Anti-Rabbit IgG （H+L） HRP、Goat Anti-Mouse IgG （H+L） HRP抗体（Affinity）； 5417R台式冷冻高速离心机（Bio.Tck）；冰冻切片机（上海徕卡显微系统贸易有限公司）；蔡司荧光共聚焦显微镜LSM980（ZEISS）。

1.2.2 实验动物及分组

SPF级C57BL/6J小鼠，雄性，6~8周龄［南方医科大学实验动物中心提供，合格证号： SYXK（粤）2021-0167］。经南方医院动物实验伦理委员会批准（伦理批号：IACUC-LAC-20250402-004）。根据干预方式的不同，小鼠共分为5组：对照组（Control）、慢性不可预见性温和应激模型组（CUMS）、阳性对照药物氟西汀组（FLX）、加味柴胡桂枝汤低剂量组（MCGD-L）、加味柴胡桂枝汤高剂量组（MCGD-H），15只/组。氟西汀组和加味柴胡桂枝汤低、高剂量组造模前提前3 d开始给药。给药方式如下：氟西汀组通过腹腔注射，10 mg/kg，1次/d；加味柴胡桂枝汤组通过灌胃，1次/d，0.3 mL/次。

1.2.3 小鼠慢性不可预测性温和应激模型的构建

以慢性、不可避免且不可预测的方式使小鼠每天暴露于不同类型的压力源数次，持续28 d^［23］。应激刺激因素包括：异味污染笼6 h；异物放置6 h；湿笼17 h（潮湿垫料）；空笼17 h（垫料撤除）；合笼2 h；鼠笼45°倾斜12 h；彻夜光照；光照周期干扰（如昼夜节律反转、黑暗期突然开灯或光照期突然关灯）；噪声刺激（15 min）；闪光（10 min）；冰水游泳5 min（15 ℃）等。应用半随机方法将上述刺激因子随机分配，每天安排2种刺激。连续接受28 d的应激刺激，相同刺激因子不得连续出现。将正常对照组小鼠置于另外房间，5只/笼，于正常室温及光照条件下给予正常喂养。

1.2.4 行为学检测小鼠焦虑抑郁样行为

所有行为实验均在上午9点~下午6点进行。实验过程中的行为通过配备红外感光CCD摄像机的自动行为追踪系统（Smart 3.0.06）进行记录、存储和分析。

1.2.4.1　蔗糖偏好实验 （SPT）

快感缺乏是抑郁症的主要症状之一。测试前2 d，将小鼠单笼饲养，在笼内随机左右对称放置两瓶水供小鼠自由饮用，其中一个装有清水，另一个装有1%的蔗糖溶液。测试前禁食禁水16 h，测试当天12 h/次交换瓶子的位置，并记录24 h内两个水瓶的液体消耗量。小鼠的蔗糖偏好以蔗糖摄入量占总液体摄入量的百分比计算。蔗糖偏好度的计算公式如下：蔗糖偏好指数（%）=（蔗糖摄入量/总液体摄入）×100%。

1.2.4.2　强迫游泳实验（FST）

在直径12 cm，高40 cm的透明游泳桶中注入新鲜的水（24±1） ℃，水位高度为25 cm，确保小鼠进入游泳桶时鼠尾不会接触桶底。依次将每只小鼠置于游泳桶中，视频记录。实验时进行强迫游泳6 min，小鼠首先适应1 min，从第2分钟开始记录后续5 min内小鼠的不动时间（即小鼠在水中停止挣扎，或动物呈漂浮状态，四肢偶尔划动以保持头部浮在水面）。实验结束后，迅速将小鼠从水中取出，在温室烘干，轻放回饲养笼内。

1.2.4.3 旷场实验（OFT）

敞箱装置是长宽各为50 cm、高50 cm，内壁为白色。将小鼠放入中心方格内，观察实验小鼠的活动，记录每只小鼠5 min内活动总距离及中央区域的活动距离和时间。完成每只小鼠实验后均用酒精将装置清洁干净，以免上次动物残留的信息（如动物的尿液、粪便、气味）影响下次测试结果。

1.2.4.4 高架实验（EPM）

将小鼠放入标准高架十字迷宫：两个开放臂和闭合臂互相垂直呈十字交叉，距离地面高100 cm，每个臂长30 cm，宽5 cm，其中闭合臂有高15 cm不透明隔板包围。实验持续5 min，记录小鼠在开放臂和闭合臂的停留时间及探索次数。

1.2.5 实时荧光定量PCR

测量时钟蛋白基因表达水平的昼夜变化需要在24 h内分5个时间点进行取材，ZT0为早晨6点，ZT6为中午12点，以此类推^{［20， 24］}。各组小鼠于24 h内每隔6 h（ZT0、ZT6、ZT12、ZT18和ZT24）取材海马组织，每个时间点3只/组。使用TRIzol试剂提取海马组织总RNA，提取和上机操作同前。本实验涉及的引物由北京擎科生物科技有限公司合成制作（表1）。

1.2.6 Western blotting

使用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液提取海马组织总蛋白。提取的蛋白质通过SDS-PAGE分离后，转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。使用5% BCA封闭溶液在室温下封闭膜以阻断非特异性结合。随后，将膜与稀释的一抗孵育，在4 ℃条件下过夜。一抗包括：JAK2（1∶1000）、p-STAT3（1∶1000）、STAT3（1∶1000）、p-NF-κB（1∶1000）、NF-κB（1∶1500）、IL-1β（1∶1000）、IL-6（1∶1000）及 β-actin（1∶1500）。次日，用 HRP 偶联的二抗［Goat Anti-Rabbit IgG （H+L） HRP 和 Goat Anti-Mouse IgG （H+L） HRP，1∶7000］在室温下孵育。最后，通过Western blotting分析系统获得相关数据。

1.2.7 免疫荧光染色

首先，将组织切片在室温下用4%多聚甲醛固定15 min，随后用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗。接着，用0.1% Triton X-100 透化切片15 min，并使用2.5%山羊血清封闭1 h，以阻断抗体的非特异性结合。随后，将切片与Iba1抗体（1∶300）在4 ℃下孵育过夜。次日，用PBS清洗切片后，在室温下与荧光标记的Alexa Fluor 488偶联抗大鼠IgG抗体孵育1 h。最后，用DAPI对切片进行复染，并使用蔡司荧光共聚焦显微镜进行观察和成像。

1.3 统计学分析

采用Cosinor软件的昼夜节律余弦拟合法对时钟蛋白基因昼夜表达水平进行测定，计算时钟蛋白基因mRNA振荡的节律振幅。分析采用非线性回归方程：y=baseline+amplitude×cos（（frequency×x）+phase shift），该方法可精确量化数据中的节律性变化模式。在GraphPad Prism 8软件中，利用24 h昼夜节律周期的余弦变换对时钟蛋白基因mRNA振荡的时间变量数据进行分析^{［20， 24］}。

所有统计分析均使用GraphPad Prism 8软件完成。除非另有说明，数据均以均数±标准差表示。统计检验包括Kruskal-Wallis检验、非配对t检验以及单因素方差分析（ANOVA），并结合事后多重比较检验以进一步分析组间差异。统计学显著性水平设定为P<0.05。所有实验都重复3次。

2 结果

2.1 网络药理学结果

2.1.1 加味柴胡桂枝汤活性成分及其靶点的筛选

通过检索TCMSP数据库，获得单味药的活性成分，共得到活性成分244个。其中柴胡17个、桂枝7个，白芍13个，黄芩36个，半夏13个，人参22个，大枣29个，生姜5个，甘草92个，枳壳5个，柏子仁5个。剔除重复单体33个，最终获得211个活性成分。其中，槲皮素、黄芩素、芒柄花素、川陈皮素等为MCGD的核心活性成分。

2.1.2 加味柴胡桂枝汤改善抑郁症核心靶点的筛选

将加味柴胡桂枝汤活性成分的276个药物靶点与焦虑、抑郁相关的9143个潜在疾病靶点进行交集分析，得到233个共同靶点。通过STRING数据库生成PPI网络后，导入Cytoscape软件进行可视化和网络分析，识别出排名靠前的核心靶点蛋白，如IL-1β、IL-6、TNF、AKT1、STAT3、TP53等。

2.1.3 “成分-靶点-疾病”网络图构建

将加味柴胡桂枝汤的单味药物、药物对应的有效化学成分、化学成分对应的靶点信息导入Cytoscope软件中，绘制“药物-成分-靶点-疾病”可视化网络图（图1）。中部方形节点为疾病与药物的共同靶点，四周椭圆形节点代表药物成分，按中药来源分类排列，节点之间的连线代表靶点与药物活性成分之间的作用关系。

靶点与药物成分之间的关联度由低到高，如图例所示节点由黄色变化为紫色，由此获得加味柴胡桂枝汤治疗抑郁症的关键药物成分。以关联度≥30为标准，筛选获得关键药物成分包括quercetin（槲皮素）、acacetin（金合欢素）、kaempferol（山奈酚）、7-Methoxy-2-methyl isoflavone（7-甲氧基-2-甲基异黄酮）、formononetin（芒柄花素）、nobiletin（川陈皮素）、isorhamnetin（异鼠李素）、Medicarpin（美迪紫檀素）、baicalein（黄芩素）等，这些关键药物成分主要来自加味柴胡桂枝汤中的柴胡、黄芩、白芍、半夏、甘草、枳壳等中药（表2）。

2.1.4 GO功能富集和KEGG通路分析

GO功能富集分析共得到607条信号通路，其中生物过程447条，细胞组分61条，分子功能99条，靶基因涉及生物过程包括细胞对炎症的反应，蛋白激酶结合等；KEGG共富集到185条通路，关键靶点涉及JAK2/STAT3及NF-κB相关信号通路。

2.1.5 分子对接

选取JAK2和STAT3反向追溯其关联活性化合物，将这2个靶点与加味柴胡桂枝汤核心活性成分单体进行分子对接（表3），加味柴胡桂枝汤的主要活性成分与2个靶点的结合能均较低，提示药物可能通过JAK2、STAT3发挥作用。

JAK2与CH9（quercetin），CH10（isorhamnetin），HQ1（acacetin），BS4（kaempferol）和ZK4（nobiletin）亲和力较佳，化合物与靶蛋白结合效果良好。其中，JAK2与CH9结合能为-6.45 kcal/mol，CH9的3，4-二羟基与JAK2的Leu551形成氢键；JAK2与CH10结合能为-6.7 kcal/mol，CH10的3，4-二羟基与JAK2的Asn782形成氢键；JAK2与HQ1结合能为-6.48 kcal/mol，HQ1的3，4-二羟基与JAK2的Gly632形成氢键；JAK2与BS4结合能为-6.4 kcal/mol，BS4的3，4-二羟基与JAK2的Leu551形成氢键；JAK2与ZK4结合能为-6.27 kcal/mol，ZK4的3，4-二羟基与JAK2的Thr576形成氢键发生相互作用（表3，图2）。

STAT3与CH9（quercetin），CH10（isorhamnetin），GC9（7-Methoxy-2-methyl isoflavone），GC63（lico-chalcone a）和ZK4（nobiletin）亲和力较佳，化合物与靶蛋白结合效果良好。其中，STAT3与CH9结合能为-5.48 kcal/mol，CH9的3，4-二羟基与STAT3的Lys548形成氢键；STAT3与CH10结合能为-5.64 kcal/mol，CH10的3，4-二羟基与STAT3的Lys548形成氢键；STAT3与GC9结合能为-5.9 kcal/mol，GC9的3，4-二羟基与STAT3的Asp371形成氢键；STAT3与GC63结合能为-5.8 kcal/mol，GC63的3，4-二羟基与STAT3的Asn489形成氢键；STAT3与ZK4结合能为-7.44 kcal/mol，ZK4的3，4-二羟基与STAT3的Asn489形成氢键发生相互作用（表3，图3）。

2.2 动物实验结果

2.2.1 加味柴胡桂枝汤改善CUMS小鼠的抑郁样行为

与对照组比较，CUMS模型组出现明显的抑郁样行为，表现为蔗糖偏好指数下降（P<0.01），强迫游泳不动时间显著增加（P<0.01），游泳时间减少（P<0.01）。与CUMS模型组比较，加味柴胡桂枝汤低、高剂量组和氟西汀组改善小鼠抑郁样行为，提升糖水偏好指数和游泳时间（P<0.05，P<0.01），降低强迫游泳不动时间（P<0.01，图4）。

2.2.2 加味柴胡桂枝汤改善CUMS小鼠的焦虑样行为 与对照组比较，CUMS模型组出现明显的焦虑样行为，表现为旷场中心区域活动时间占比减少（P<0.01），总活动距离没有差异（P>0.05）；高架十字实验开放臂活动时间占比和探索次数减少（P<0.01）。与CUMS模型组比较，加味柴胡桂枝汤低、高剂量组和氟西汀组改善小鼠焦虑样行为，增加旷场中心区域活动时间占比（P<0.01），增加开放臂活动时间占比和探索次数（P<0.01，图5）。

2.2.3 加味柴胡桂枝汤下调小鼠海马组织炎症水平

与对照组比较，CUMS模型组小鼠海马组织促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ表达水平升高（P<0.01），抑炎因子IL-4、IL-10表达水平下降（P<0.05，P<0.01）。与CUMS模型组比较，加味柴胡桂枝汤低、高剂量组和氟西汀组小鼠可下调促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ表达水平（P<0.05，P<0.01），上调抑炎因子IL-4、IL-10表达水平（P<0.05，P<0.01，图6）。

2.2.4 加味柴胡桂枝汤下调JAK2/STAT3信号通路

与对照组比较，CUMS模型组小鼠JAK2、p-STAT3/STAT3、p-NF-κB/NF-κB、IL-1β、IL-6蛋白表达水平升高（P<0.01）。与CUMS模型组比较，加味柴胡桂枝汤低、高剂量组和氟西汀组小鼠可下调JAK2、p-STAT3/STAT3、p-NF-κB/NF-κB、IL-1β、IL-6蛋白表达水平（P<0.05，P<0.01，图7）。

2.2.5 加味柴胡桂枝汤可逆转 CUMS 小鼠的昼夜节律蛋白表达紊乱

与对照组比较，CUMS模型组小鼠Bmal1、Clock、Per1、Per2昼夜振荡水平降低（P<0.05），Cry1、Cry2无变化（P>0.05）。与CUMS模型组比较，加味柴胡桂枝汤低、高剂量组和氟西汀组可部分逆转Bmal1、Clock、Per1、Per2昼夜振荡水平的降低（P<0.05，图8）。

2.2.6 加味柴胡桂枝汤下调海马CA1区小胶质细胞的活化

与对照组比较，CUMS模型组小鼠Iba1⁺阳性细胞数量升高（P<0.01）。小胶质细胞分支总长度明显减少（P<0.01）。与CUMS模型组比较，加味柴胡桂枝汤低、高剂量组和氟西汀组小鼠可降低Iba1⁺阳性细胞数量（P<0.01），增加小胶质细胞分支总长度（P<0.01，图9）。

3 讨论

抑郁症作为一种复杂的精神疾病，其病因涉及多种生理、心理及社会因素^［25］，其核心症状包括情绪低落，兴趣减退、失眠焦虑等。一项大型纵向队列研究的数据揭示了失眠和昼夜节律紊乱是抑郁症的独特风险因素^［26］。针对抑郁症的临床治疗提示，共病睡眠障碍的抑郁症患者的治疗预后往往较差^［27］。近年研究反复证实抑郁发作与失眠之间的双向联系^［28］，但睡眠-觉醒节律究竟如何参与抑郁的病理生理学途径仍未阐明。

目前，中枢神经系统的炎症反应与免疫激活，尤其是小胶质细胞的过度激活，已成为解释抑郁发病机制的重要理论基础^［29-31］。小胶质细胞作为大脑常驻的巨噬细胞，不仅表现出内在的昼夜节律，还能受生物钟基因，如Bmal1、REV-ERBα调节，影响其特定的功能，包括调节神经炎症，突触吞噬作用，营养支持及代谢等^［32］。因此，抑郁所引起的节律紊乱可能与小胶质细胞激活介导的免疫炎症失调有关。本研究通过构建慢性不可预见性温和应激（CUMS）小鼠模型，系统探讨了加味柴胡桂枝汤（MCGD）对其行为学改变及相关分子机制的干预作用，验证了其通过调控JAK2/STAT3信号通路发挥抗抑郁效应及逆转昼夜节律紊乱的科学依据，具有显著的创新性与实践意义。

加味柴胡桂枝汤既能宽胸散结，理气行中，改善焦虑抑郁，又能调和营卫阴阳，改善睡眠障碍^［10］。柴胡与黄芩配伍，一透一清，和解少阳；白芍与桂枝配伍，一散一收，一阴一阳，使营卫调和，血脉和利；半夏与生姜相须为用，且能助卫；人参、大枣、甘草三药合用，补益脾胃；在原方基础上，加枳壳理气宽中，加柏子仁养心安神^{［10， 33， 34］}。首先，本研究基于网络药理学方法系统探讨加味柴胡桂枝汤的关键活性成分及其潜在的作用机制。研究结果显示，该复方中的关键活性分子，包括槲皮素、金合欢素、山奈酚、黄芩素、川陈皮素等，主要通过抗炎、抗氧化及抗凋亡等特性对情绪和精神心理状态产生影响，协同发挥抗抑郁效应。这些关键活性成分的抗抑郁作用在不同抑郁症相关模型中也得到了验证。具体而言，槲皮素通过抑制活性氧（ROS）、增强超氧化物歧化酶 （SOD）、谷胱甘肽（GSH）和谷胱甘肽-转移酶 （GST） 活性，降低IL-6、IL-1β、TNF-α表达水平，抑制小胶质细胞活化发挥对抗抑郁症的神经保护作用^［35］。此外，槲皮素还能降低下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴的兴奋性，显著改善CUMS大鼠抑郁行为^［36］。山奈酚可促进小胶质细胞M2极化，显著减轻前额叶皮质的神经炎症，改善LPS诱导的抑郁样行为^［37］。黄芩素通过调控BDNF/TrkB/CREB信号通路，显著降低TNF⁃α、IL⁃6等促炎因子表达，调节突触可塑性，改善小鼠内毒素诱导的抑郁样行为^［38］。川陈皮素通过靶向 PKM2 和激活糖酵解信号通路减轻了斑马鱼夜间人工光诱发的抑郁样行为^［39］。综上，加味柴胡桂枝汤通过多组分协同调控免疫细胞活性及炎症反应网络，维持神经元正常生理功能，最终实现抗抑郁作用。

CUMS作为一种广泛应用于抑郁症动物实验的模型，能诱发类似人类抑郁行为的表型，如快感缺失、活动减少等，其优势在于能较好模拟慢性应激导致的精神病理过程。本研究结果显示，CUMS小鼠表现出典型的抑郁样行为，包括蔗糖偏好下降、强迫游泳不动时间延长，以及焦虑样行为如旷场中心区域活动时间减少、高架十字迷宫开放臂探索降低等，表明模型构建成功。经MCGD干预后，行为指标明显改善，与阳性对照氟西汀组相近，提示该方具有良好的抗焦虑抑郁作用。该结果与前期临床经验报道一致，进一步支持其治疗情志病的有效性^［9］。

其次，进一步对MCGD-焦虑抑郁-炎症的潜在作用靶点进行GO功能及KEGG通路富集分析，结果显示JAK2/STAT3及NF-κB通路参与其中。JAK2/STAT3通路是介导中枢神经炎症反应的重要信号轴，其异常激活与小胶质细胞激活、神经元损伤及抑郁症状密切相关^［40-42］。王英等^［43］揭示温阳解郁方能抑制小胶质细胞向M1型极化以减少促炎因子释放而调节母婴分离结合束缚应激型小鼠的抑郁样行为；杨晓珊等^［44］发现下调IL-6，阻断JAK2/STAT3信号通路可改善海马突触可塑性损伤，进而减轻抑郁大鼠的病情。本研究发现，CUMS小鼠中小胶质细胞显著激活，总分支长度变短，伴随JAK2、p-STAT3、p-NF-κB表达显著上调。而MCGD干预可有效下调小胶质细胞过度激活和抑制JAK2/STAT3通路，并降低炎性因子IL-1β、IL-6表达，提示其可能通过阻断JAK2/STAT3信号激活过程，从而减轻神经炎症。这一结果揭示MCGD通过调控小胶质细胞激活和炎症信号通路在中枢发挥神经保护及抗抑郁作用，具有明确的机制基础。

此外，本研究关注抑郁障碍和昼夜节律之间的联系。近年来，越来越多证据表明昼夜节律失调与情绪障碍间存在双向关联性，其分子调控网络已成为潜在治疗靶点^{［19， 20］}。昼夜节律系统由下丘脑视交叉上核（SCN）中主时钟及外周组织时钟协同构成，Bmal1为维持正常昼夜节律核心时钟基因之一。课题组前期工作证实，SCN主时钟与外周时钟之间存在神经连接，外周组织的时钟蛋白节律改变参与焦虑抑郁样行为的调控^{［20， 24］}。亦有研究指出，脂多糖诱导的大鼠抑郁样行为模型中观察到神经炎症级联反应，其机制可能与Bmal1表达动态失衡相关^［45］。本研究结果发现，CUMS小鼠Bmal1、Clock等关键节律因子振荡节律受损。而MCGD干预可部分恢复其振幅，提示其具有调节节律基因表达的能力。这一发现与中医“调和营卫”理论中强调机体时序协调性的治疗思想形成呼应，为阐释中药复方在节律相关疾病中的作用机制提供了新的实验依据。

本研究在继承传统名方应用基础上，融合现代网络药理学与动物实验证据，具有以下创新点：（1）首次从分子水平明确了MCGD通过抑制JAK2/STAT3信号通路及小胶质细胞活化改善情绪障碍的作用机制；（2）观察到MCGD对节律基因表达异常具有调节作用，揭示了中医药在昼夜节律相关疾病领域的作用机制，为其临床应用提供科学依据；（3）结合网络药理学筛选活性成分与靶点，为中药复方药效物质基础研究提供了理论支撑。

需要指出的是，尽管本研究通过Western blotting等实验手段初步验证了MCGD可通过下调JAK2/STAT3信号通路相关蛋白表达，进而抑制小胶质细胞活化、改善炎症状态和焦虑抑郁样行为，但未进一步采用STAT3抑制剂或敲除模型进行反向验证，这是本研究的局限之一。由于实验周期和技术平台限制，尚未能在本研究中补充相应数据。我们已在后续课题设计中纳入STAT3特异性抑制剂的干预实验，以进一步明确MCGD作用是否依赖于该通路的激活状态，从而更加系统地阐明其作用机制。

综上所述，加味柴胡桂枝汤可通过调控JAK2/STAT3信号通路、抑制小胶质细胞活化、改善神经炎症状态以及恢复昼夜节律紊乱，有效缓解CUMS诱导的小鼠焦虑抑郁样行为。本研究为中医药干预情志疾病提供了科学依据，也为开发安全有效的天然抗抑郁药物提供了新的思路和潜在靶点。

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