氧化应激（OS）是指机体内活性氧自由基（ROS）和抗氧化系统失衡导致的氧化损伤过程
［1， 2］，与糖尿病、心血管疾病及神经退行性疾病等多种慢性疾病的发生发展密切相关
［3-5］。研究发现，机体持续高血糖可通过激活晚期糖基化终末产物（AGEs）积累、蛋白激酶C（PKC）活化及促炎基因过度表达等通路，诱导ROS大量生成，加剧氧化应激，是促进糖尿病及其并发症进展的关键机制之一
［6， 7］。在中国庞大的高血糖人群背景下，探寻安全有效的抗氧化应激干预策略对延缓代谢性疾病进展具有重要临床意义
［8］。
益生菌作为宿主健康有益的活性微生物，其抗氧化作用已得到广泛关注。乳酸菌通过激活抗氧化酶系统和氧化还原系统，调节肠道菌群平衡及代谢物分泌方式，在缓解氧化应激中发挥显著的抗氧化能力
［9， 10］。鼠李糖乳杆菌GG通过提高机体本身的抗氧化功能和免疫防疫能力，减轻脂多糖诱导大鼠的肝脏损伤、氧化应激和免疫应激
［11］。发酵乳杆菌CQPC-11通过提高小鼠血清中的T-SOD、GSH-Px、CTA等抗氧化酶水平，降低活性炭冰水诱导的小鼠氧化应激损伤
［12］。植物乳杆菌H8通过上调SIRT1/SIRT3/Nrf2信号通路，促进
p53的泛素化和降解，减少ROS的生成，进而改善小鼠的氧化损伤
［13］。Wang等
［14］发现植物乳杆菌DP189通过激活Nrf2/ARE和PGC-1α通路，抑制NLRP3炎症小体，提高MPTP诱导帕金森小鼠体内的SOD、GSH-Px和IL-10水平，延缓因α-SYN在PD小鼠体内积累引起的神经退行性变。上述研究证实，乳酸菌在缓解氧化应激和氧化应激导致的炎症反应中发挥着重要的作用。植物乳杆菌作为乳酸菌的重要成员，其代谢产物短链脂肪酸（SCFAs）被证实参与葡萄糖代谢、脂质稳态及氧化应激应答
［15］。例如，植物乳杆菌MR1通过提高乙酸盐水平促进循环尿苷分泌，改善高碳水化合物饮食诱导的肝脏氧化应激损伤
［16］。然而，益生菌菌株的功能具有高度差异性，筛选高效抗氧化应激的特异性菌株仍需深入研究。
传统哺乳动物模型（如小鼠），存在实验周期长、成本高及通量低等局限，制约了益生菌功效筛选与机制研究效率。斑马鱼因与人类基因同源性高、生理代谢路径保守
［17］、个体透明且繁殖速度快等优势，已成为药物毒理研究和功能评价的模型生物
［18-20］氧化应激及代谢性疾病研究的理想模式生物
［18］。本研究以分离自健康婴幼儿粪便的植物乳植杆菌ZG03为研究对象，利用2%葡萄糖诱导的斑马鱼氧化应激模型，结合分子生物学与靶向代谢组学技术，系统探究ZG03的抗氧化应激功效，并通过SCFAs回补实验揭示其作用机制，为益生菌在代谢性疾病氧化应激干预中的应用提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
野生型AB系斑马鱼、转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼Tg（mpx：EGFP）购来自国家斑马鱼资源中心，斑马鱼种鱼进行胚胎繁殖后，胚胎置于斑马鱼养殖水中（5 mmol/L NaCl， 0.17 mmol/L KCl， 0.33 mmol/L CaCl2，和0.33 mmol/L MgSO4）。植物乳植杆菌ZG03（Lactobacillus plantarum ZG03）从健康婴幼儿粪便中分离，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心完成菌种保藏，保藏编号为CGMCC No. 31809。
MRS培养基（青岛高科技工业园海博生物技术有限公司），异硫氰酸荧光素（FITC Sigma-aldrich），DCFH-DA（SIGMA），总蛋白定量测试盒（BCA法）、超氧化物歧化酶（SOD）测试盒、丙二醛（MDA）测试盒（南京建成生物工程研究所），葡萄糖、乙酸钠、丙酸钠、己酸钠（上海源叶生物科技有限公司）。
1.2 植物乳植杆菌ZG03菌株特性测定
取-80 ℃冻存的植物乳植杆菌ZG03解冻后，接种于MRS肉汤培养基中，放置于37 °C恒温培养箱中培养24 h后，4 000×g离心10 min，收集沉淀，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2次，并重悬于PBS中，调整菌液浓度为1×109 CFU/mL备用。
1.2.1 生长曲线测定
取一定量的菌液接种于MRS固体培养基中，37 ℃培养24 h，挑取单个菌落接种于MRS液体培养基中继续培养24 h，设置3个平行组，每2 h取样测定A600 nm值，绘制生长曲线。
1.2.2 细胞形态测定
收集植物乳植杆菌ZG03菌体，置于2.5%戊二醛中室温固定2 h，转移至4 ℃保存，然后使用0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗3次，1%锇酸4 ℃固定2 h，磷酸漂洗液漂洗，乙醇梯度脱水，临界点干燥仪干燥及离子溅射仪镀膜后，置于扫描电镜仪拍照。
1.2.3 菌株全基因组学测序、组装和注释
取一定量植物乳植杆菌ZG03种子液离心并用PBS洗涤菌泥2次，再次离心弃去上清液，将菌体送至苏州金唯智生物科技有限公司进行全基因组测序，基因组测序通过Illumina novaseq 6000和Pacbio sequelⅡe平台，具体步骤包括提取基因组DNA、基因组打断、末端修复、加测序接头、纯化DNA和上机测序。结果分析包括基因组装分析、基因组注释、基因功能注释、特殊结果预测等方面，其中基因功能注释使用了非冗余蛋白质（NR）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）、基因本体论（GO）、同源蛋白质群（COG）、致病菌毒力因子（VFDB）等数据库。
1.3 植物乳植杆菌ZG03在斑马鱼肠道定植
取500 μL植物乳植杆菌ZG03菌液（1×109 CFU/mL）离心（10 000×g，5 min），弃上清液，加入500 μL FITC溶液（1 mg/mL），混匀，避光孵育1 h后，离心（10 000×g，5 min），弃上清液，PBS洗涤3次，重悬于PBS中备用。挑选受精后3 d（3 dpf）健康野生型AB系斑马鱼置于6孔板中，10尾/孔。实验设置空白组（E3养殖水）、植物乳植杆菌ZG03菌组（1×104、1×105、1×106 CFU/mL），置于生化培养箱中28.5 ℃孵育48 h（每24 h更换溶液）后，E3养殖水洗涤3次，置于荧光显微镜下拍照记录植物乳植杆菌ZG03在斑马鱼肠道中的定植情况。
1.4 斑马鱼缓解氧化应激功效实验
1.4.1 样品配制
使用E3养殖水配制质量分数为2%的葡萄糖溶液，置于4 ℃备用。用二甲基亚砜（DMSO）配制摩尔浓度为10 mmol/L的DCFH-DA溶液，置于-20 ℃备用，实验时调整DCFH-DA溶液摩尔浓度为5.0 μmol/L。取1.2节的种子液5 mL，离心弃上清E3养殖水重悬，分别配置成浓度为 1×104、1×105、1×106 CFU/mL的植物乳植杆菌ZG03菌液用于后续实验。
1.4.2 模型构建与药品干预
将每组50尾受精后3 dpf的野生型斑马鱼（或每组10尾受精后3 dpf的Tg（mpx：EGFP）转基因斑马鱼）置于6孔板中，空白组加入4 mL E3养殖水，其余组加入4 mL 2%葡萄糖溶液，每组均喂食正常饲料，28.5 ℃孵育24 h，通过荧光显微镜观察斑马鱼体内ROS荧光强度判定氧化应激模型是否构建成功。完成模型构建后，弃去上述溶液，空白组加入4 mL E3养殖水，模型组加入4 mL 2%葡萄糖溶液，ZG03低浓度组加入4 mL菌液（1×104 CFU/mL），ZG03中浓度组加入4 mL 菌液（1×105 CFU/mL），ZG03高浓度组加入4 mL菌液 （1×106 CFU/mL）。各组于28.5 ℃孵育48 h，每孔每天投喂5 mg饲料并更换新鲜溶液。
1.4.3 斑马鱼尾部造血组织（CHT）处中性粒细胞生成
孵育结束后，将Tg（mpx：EGFP）转基因斑马鱼幼虫在荧光显微镜下观察并拍照，统计斑马鱼尾部造血组织处中性粒细胞的数量。
1.4.4 活性氧自由基（ROS）测定
实验干预结束后，每组随机挑选10尾斑马鱼幼虫置于6孔板中，E3养殖水清洗2次后，弃上清，每孔加入5 mL DCFH-DA溶液，28.5 ℃避光孵育1 h。孵育结束后，使用E3养殖水冲洗斑马鱼3次（避光），置于荧光显微镜下观察并拍照。采用ImageJ 6.0软件进行图像分析并采集数据，分析统计斑马鱼荧光强度以评价植物乳植杆菌ZG03的抗氧化作用。
1.4.5 SOD、MDA测定
干预结束后，E3养殖水洗涤2次，将斑马鱼幼鱼转移至2 mL EP管中（40尾/管），加入200 μL PBS，匀浆，10 000 r/min离心10 min后取上清液，按照试剂盒说明书分别测定SOD、MDA含量。
1.4.6 靶向代谢组学分析
干预结束后，E3养殖水洗涤2次，将斑马鱼转移至2 mL EP管中（每组30尾/管），依次加入10 μL内标（L-2-氯-苯丙氨酸，0.3 mg/mL，甲醇配置）、400 μL提取液（甲醇∶乙腈∶水=2∶2∶1， V/V/V）和两个小钢珠，在-80 ℃冰箱中静置5 min后，使用研磨机中研磨（60 Hz，2 min），冰水浴中超声提取10 min，-20 ℃静置30 min，低温离心15 min（13 000 r/min，4 ℃），上清液与沉淀分开保存后，装入带内衬管的LC-MS进样小瓶中，运用LC-MS检测上清液中短链脂肪酸乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸的含量。
1.5 短链脂肪酸斑马鱼体内SOD活性的影响实验
构建氧化应激斑马鱼模型，设置空白组（E3养殖水）、模型组（2%葡萄糖溶液）、乙酸钠组（2%葡萄糖溶液+100 μmol/L乙酸钠）、丙酸钠组（2%葡萄糖溶液+400 μmol/L丙酸钠）、己酸钠组（2%葡萄糖溶液+1600 μmol/L己酸钠）和混合液组（100 μmol/L乙酸钠+400 μmol/L丙酸钠+1600 μmol/L己酸钠），各组在28.5 ℃ 条件下孵育48 h。干预结束后，收集斑马鱼于2 mL EP管中（每组30尾/管），每管加入200 μL PBS溶液，使用组织均质研磨仪器将斑马鱼匀浆破碎（无明显组织碎块），4 ℃，10 000 r/min离心10 min后取上清液，按照试剂盒说明书测定SOD活性。
1.6 统计学分析
用GraphPad Prism 10软件统计处理数据，结果用均数±标准差表示。多组间比较采用单因素方差分析加Tukey多重比较检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 植物乳植杆菌ZG03的菌株生长特性
在37 ℃的培养条件下，植物乳植杆菌ZG03的对数生长期为4~12 h，之后进入稳定期（
图1A）。ZG03在MRS固体培养基上呈圆形，表面光滑，湿润，中央向上隆起，边缘整齐，颜色为乳白色的单菌落，场发射扫描电镜下菌体呈杆状（
图1B、C）。
2.2 植物乳植杆菌ZG03全基因组测序分析
动物双歧杆菌NX-6的全基因组长度为3 613 757 bp，GC碱基占比为46.42%，含有3 231个编码基因，占总基因数目的80.70%（
图2A、
表1）；非编码RNA共123个，包括16个rRNA和70个tRNA。KEGG数据库基因功能通路进行注释和统计，结果表明ZG03基因主要聚集在新陈代谢、遗传信息处理和环境信息处理，其中新陈代谢通路主要包括碳水化合物代谢（463个基因）、氨基酸代谢（195个基因）、核酸代谢（112个基因）、辅助因子与维生素代谢（105个基因）、脂质代谢（89个基因）、糖的生物合成与代谢（39个基因）等（
图2B）。COG数据库注释结果同样表明，代谢相关的基因功能主要集中于氨基酸（262个）、碳水化合物（323个）、脂质的转运与代谢（75个）（
图2C）。
2.3 植物乳植杆菌ZG03在斑马鱼肠道的定植情况
当ZG03浓度为1×10
5、1×10
6 CFU/mL时，在斑马鱼肠球、中肠和后肠部位均清晰可见FITC标记植物乳植杆菌ZG03的绿色荧光（
图3）。
2.4 植物乳植杆菌ZG03对斑马鱼CHT处中性粒细胞生成的影响
当ZG03浓度为1×10
4、1×10
5、1×10
6 CFU/mL时，斑马鱼CHT处中性粒细胞数量分别为26.50±4.53个、24.40±2.55个、22.70±2.31个，随着ZG03浓度的增加，斑马鱼体内中性粒细胞数量减少，与模型组33.30±3.80相比数量显著降低（
P<0.001，
图4A、B）。
2.5 植物乳植杆菌ZG03对斑马鱼体内ROS水平、SOD活性、MDA含量的影响
当ZG03浓度为1×10
5、1×10
6 CFU/mL时，斑马鱼体内的荧光强度降低，测得斑马鱼体内的ROS水平分别为（105.10±12.95）%、（103.74±17.67）%，与模型组（132.93±18.66）%相比显著降低（
P<0.05），且随着植物乳杆菌浓度的升高，ROS水平呈现降低的趋势（
图5A、B）。当ZG03浓度为1×10
4、1×10
5、1×10
6 CFU/mL时，斑马鱼体内超氧化物歧化酶酶（SOD）活性分别为27.80±0.31、30.44±1.04、（33.39±1.62 U/mg），显著高于模型组［（23.70±0.33 U/mg），
P<0.01］，且随着ZG03的浓度增加，SOD活性升高（
图5C）。脂质氧化代谢物MDA含量分别为0.19±0.06、0.11±0.01、（0.89±0.02 μmol/g），与模型组（0.16±0.05 μmol/g）相比差异无统计学意义（
图5D）。
2.6 植物乳植杆菌ZG03对斑马鱼体内短链脂肪酸含量的影响
靶向测定ZG03干预后氧化应激模型斑马鱼体内的短链脂肪酸含量（
图6），当植物乳植杆菌ZG03浓度为1×10
6 CFU/mL时，斑马鱼体内的短链脂肪酸乙酸含量为（4323.70±63.15）ng/mL、丙酸含量为（143.94±3.43）ng/mL、己酸含量为（8.52±0.07） ng/mL，与模型组（（3989.13±77.25）、（135.10±3.85）、（7.88±0.30）ng/mL）相比，均显著增加（
P<0.05）。
2.7 短链脂肪酸对斑马鱼体内SOD活性的影响
当乙酸钠浓度为100 μmol/L、丙酸纳浓度为400 μmol/L、己酸钠浓度为1600 μmol/L和3种盐混合时，斑马鱼体内的SOD活性分别为（36.64±0.62）、（34.21±0.72）、（35.60±0.98）、（39.58±0.99）U/mg，均显著高于模型组（
P<0.001，
图7）。
3 讨论
斑马鱼作为氧化应激研究模型已有大量文献报道
［21-23］，本研究采用2%葡萄糖溶液浸泡斑马鱼幼鱼构建氧化应激模型，该模型能成功诱导斑马鱼体内ROS水平及中性粒细胞数量升高，为探究植物乳植杆菌ZG03的功能提供了可靠的实验基础。为了更好地探究ZG03的功能，我们对其全基因组展开分析，结果发现该菌株具有丰富的糖合成与代谢基因簇和新陈代谢通路基因簇。这一基因组特征提示，ZG03可能具备较强的代谢调节能力，有望通过调控机体的糖代谢及相关生理过程，在缓解氧化应激中发挥作用。
实验发现，植物乳植杆菌ZG03可定植在斑马鱼肠道内，且当其浓度为1×10
6 CFU/mL时，降低了葡萄糖诱导的氧化应激模型斑马鱼体内的中性粒细胞数量、同时使ROS水平下降20.9%，SOD活性升高40.9%，充分展现其缓解氧化应激的能力。进一步研究表明，ZG03降低斑马鱼体内的中性粒细胞数量，提示该菌株可能通过减轻中性粒细胞聚集从而缓解葡萄糖诱导的斑马鱼体内炎症反应，而炎症反应与氧化应激紧密相关
［24］，ZG03对炎症的缓解可能协同促进了氧化应激的改善。尽管脂质过氧化标志产物 MDA 含量有所降低，但未达到统计学意义，这可能与实验条件、检测灵敏度或其他未明确的调节机制有关。不过，综合来看，ZG03的这些作用表现与KEGG、COG数据库分析预测结果相吻合，表明其缓解氧化应激的能力与其基因组所蕴含的功能特征相符。
多项研究证明，肠道微生物发酵膳食纤维和抗性淀粉产生的代谢产物短链脂肪酸，可以通过影响抗菌蛋白、血清素、黏蛋白等物质的含量，参与机体碳水化合物代谢和脂质利用，进而缓解糖尿病和肥胖症状，限制炎症发展并抑制肿瘤细胞生长
［25-29］。WANG等
［30］探讨了植物乳杆菌、乳球菌、副干酪乳杆菌等14种益生菌可能的抗糖尿病机制，这些益生菌还通过提高SCFAs（丙酸和丁酸）的水平以及cluaudin-1和mucin-2的表达来改善肠道菌群的功能并降低大肠杆菌和脂多糖水平。TONUCCI等研究发现食用含嗜酸乳杆菌La-5和动物双歧杆菌BB-12的发酵牛奶后，增加了机体乙酸的含量，降低了糖化血红蛋白含量，改善了受试者的血糖控制
［31］，提示益生菌发酵产物可能通过调节SCFAs水平影响糖代谢。为探索SCFAs是否为植物乳植杆菌ZG03缓解葡萄糖诱导斑马鱼氧化应激的关键物质，我们对ZG03干预斑马鱼后的代谢产物进行检测，发现相比于模型组，斑马鱼体内的乙酸、丙酸、己酸水平升高，由此推测乙酸、丙酸和己酸可能是缓解斑马鱼炎症和氧化应激的关键代谢物质。为了验证此假说，我们继续利用斑马鱼氧化应激模型，通过回补乙酸钠、丙酸钠、己酸钠和短链脂肪酸盐混合物，发现斑马鱼体内的SOD活性显著上升，为短链脂肪酸在抗氧化应激中的直接作用提供了实验依据。
本研究首先发现植物乳植杆菌ZG03具有丰富的糖代谢基因簇，借助斑马鱼模型发现其可降低斑马鱼体内中性粒细胞数聚集、ROS水平和升高SOD活性，表现出了缓解炎症和氧化应激的能力，且乙酸、丙酸和己酸水平增加；回补短链脂肪酸盐后斑马鱼体内的SOD活性升高。这一结果说明ZG03可通过提高乙酸、丙酸和己酸的含量缓解氧化应激，但本研究未能明确其降低斑马鱼体内血糖水平、未确定乙酸、丙酸和己酸降低ROS水平的具体体作用靶点和分子机制，在蛋白组和转录层面存在着不足，需要进一步研究。
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