芪黄健脾滋肾颗粒通过AIM2/Blimp-1/Bcl-6轴抑制B细胞分化改善MRL/lpr小鼠肾损害

Qihuang Jianpi Zishen Granules improves renal damage in MRL/lpr mice by inhibiting B cell differentiation via the AIM2/Blimp-1/Bcl-6 axis

摘要

目的 分析芪黄健脾滋肾颗粒（QJZ）抑制MRL/lpr 小鼠肾B细胞分化的疗效并探讨其潜在机制。 方法 30只8周龄雌性MRL/lpr小鼠随机分为5组：模型组、QJZ组、泼尼松（Pred）组、QJZ+Pred组、黑素瘤缺乏因子2（AIM2）抑制剂组，6只/组，8周龄雌性C57BL/6小鼠为正常组，各组按相应方法连续处理8周。采用生化仪检测尿液尿总蛋白/尿肌酐（TPCR）、尿白蛋白/尿肌酐（ACR）及血清中肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）水平；组织病理学染色（HE、Masson、过碘酸-雪夫）观察小鼠肾脏病理结构的变化；电镜观察肾脏超微结构变化；酶联免疫吸附测定抗dsDNA、细胞因子、趋化因子的变化；免疫组化观察肾脏中补体C3、C4沉积情况；免疫荧光观察肾脏中AIM2、CD19、CD27、CD138表达情况；流式细胞术分析脾脏 B 淋巴细胞亚群的变化，Western blotting检测B淋巴细胞诱导成熟蛋白1（Blimp-1）/B细胞淋巴瘤6蛋白（Bcl-6）信号轴的影响。 结果 QJZ改善了MRL/lpr小鼠的Cr、BUN、TPCR、ACR水平（P<0.05），并改善肾脏的病理变化，降低抗双链DNA抗体（ds-DNA）、B细胞活化因子（BAFF）、白细胞介素（IL）-21、CXC 趋化因子受体（CXCR）-12、CXCR-19、C3、C4表达，提高IL-10水平（P<0.05）；Western blotting结果显示QJZ降低B细胞关键转录蛋白Blimp-1、X-box结合蛋白1（XBP-1）的表达，升高Bcl-6、配对盒5（PAX5）的表达（P<0.05）；流式细胞术结果显示QJZ影响B细胞的分化，免疫荧光结果显示QJZ 可降低AIM2、CD27、CD138、CD69的表达。AIM2抑制可降低B细胞关键转录蛋白Blimp-1、XBP-1的表达，升高Bcl-6、PAX5的表达（P<0.05），抑制B细胞的分化，减少IgG生成，减少C3、C4的沉积，改善肾脏的病理变化。 结论 QJZ可能通过抑制AIM2/Blimp-1/Bcl-6信号通路影响B细胞分化抑制系统性红斑狼疮肾损害。

Abstract

Objective To investigate the efficacy of Qihuang Jianpi Zishen Granules (QJZ) for inhibiting renal B cell differentiation in MRL/lpr mice and explore its underlying mechanism. Methods Thirty 8-week-old female MRL/lpr mice were randomly divided into model group, QJZ group, prednisone (Pred) group, QJZ+Pred group, and AIM2 inhibitor group (n=6), with 6 8-week-old female C57BL/6 mice as the normal control group. After treatments with normal saline, QJZ, Pred, or AIM2 inhibitor for 8 weeks, the mice were examined for urinary total protein-to-creatinine ratio (TPCR) and albumin-to-creatinine ratio (ACR), serum creatinine (Cr) and blood urea nitrogen (BUN) levels, and renal histopathology (with HE, Masson, and PAS staining) and ultrastructural changes (with electron microscopy). ELISA, immunohistochemistry, immunofluorescence staining and flow cytometry were used to detect blood levels of anti-dsDNA antibodies, cytokines and chemokines, renal deposition of complement components C3 and C4, renal expressions of AIM2, CD19, CD27 and CD138, and changes in splenic B lymphocyte subsets. The effect of QJZ on the AIM2/Blimp-1/Bcl-6 signaling axis was examined using Western blotting. Results QJZ treatment significantly improved Cr, BUN, TPCR and ACR in MRL/lpr mice, ameliorated renal pathologies, reduced the expressions of ds-DNA, BAFF, IL-21, CXCL12, CXCL13, C3 and C4, and increased IL-10 levels. QJZ significantly downregulated renal expressions of the key B-cell transcription factors Blimp-1 and XBP-1, upregulated Bcl-6 and PAX5 expressions, inhibited B-cell differentiation, and lowered the expressions of AIM2, CD27, CD138 and CD69. Inhibition of AIM2 similarly reduced renal Blimp-1 and XBP-1 expressions, increased Bcl-6 and PAX5 levels, suppressed B-cell differentiation, decreased IgG production, reduced C3 and C4 deposition, and alleviated renal pathology in MRL/lpr mice. Conclusion QJZ inhibits B cell differentiation and alleviates renal damage in systemic lupus erythematosus possibly by suppressing the AIM2/Blimp-1/Bcl-6 signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

芪黄健脾滋肾颗粒 / 系统性红斑狼疮 / 肾损害 / B细胞 / AIM2/Blimp-1/Bcl-6

Key words

Qihuang Jianpi Zishen Granules / systemic lupus erythematosus / renal damage / B cells / AIM2/Blimp-1/Bcl-6

系统性红斑狼疮（SLE）是自身免疫介导的以免疫性炎症为突出表现的弥漫性结缔组织病，常累及肾脏，继而发展为狼疮肾炎（LN）^{［1， 2］}。B细胞过度分化导致自身抗体产生和免疫复合物在肾脏沉积，激活补体导致肾脏损害是最为直接的原因^［3-5］。黑色素瘤缺乏因子2（AIM2）是一种模式识别受体，参与炎性小体组装和激活，并调节先天性和适应性免疫反应^［6，7］。B细胞分化过程主要受B淋巴细胞诱导的成熟蛋白1（Blimp-1）-B细胞淋巴瘤6蛋白（Bcl-6）轴的调节^［8］。研究报道，SLE患者中AIM2异常增加，通过Blimp-1/Bcl-6轴介导B细胞分化，对SLE肾脏产生致病作用^［9］，表明AIM2/ Blimp-1/Bcl-6信号通路是SLE免疫的潜在调节机制，这可能为SLE 的治疗提供新的思路。目前SLE肾脏损害病因及发病机制尚未明确，现有的治疗方案尚不能有效控制病情发展，临床缺乏特效药物干预疾病进展。因此对SLE肾脏损害进行深入研究意义重大。

芪黄健脾滋肾颗粒（QJZ）由经方“六味地黄丸”临床应用加减而成，由黄芪、菟丝子、熟地、山药、麸炒白术、茯苓、覆盆子、金樱子肉组成。脾肾亏虚是SLE的基本发病机制，QJZ（专利号：ZL202011227827.8）为我院特色医院制剂，具有“健脾滋肾”之功效，临床广泛应用。既往研究表明，可以有效治疗SLE肾损害并调节免疫，改善肾脏系膜细胞增殖等作用^［10-14］。然而，QJZ影响B细胞分化的具体机制尚未得到充分阐述。基于此，本研究旨在评估QJZ是否通过介导AIM2/Blimp-1/Bcl-6信号通路抑制B细胞分化以改善MRL/lpr小鼠肾损害的机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物和实验设计

30只8周龄雌性MRL/lpr小鼠，体质量20±2 g；6只8周龄雌性C57BL/6小鼠，体质量21±2 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司［许可证号码：SCXK（沪）2022-0004］。所有小鼠均饲养于合肥综合性国家科学中心人工智能研究院SPF级别动物房。

8周龄雌性C57BL/6小鼠作为正常组（Control）；将30只MRL/lpr小鼠采用随机数字表法随机分成5组：模型组（Model）、芪黄健脾滋肾颗粒组（QJZ组，7.8 g/kg）、泼尼松组（Pred组，4.55 mg/kg）、芪黄健脾滋肾颗粒加泼尼松组（QJZ+Pred组）、AIM2抑制剂组（AIM2 Inhibitor），6只/组。适应性饲养1周。动物实验中的剂量根据小鼠和成人临床等效剂量的转换因子9.1计算。对照组及模型组小鼠均予以等量生理盐水灌胃，小鼠灌胃量按0.1 mL/10 g体质量计算。Pred组予以4.55 mg·kg·d^-1的泼尼松溶液灌胃，QJZ组的灌胃量根据前期课题组实验获得的最佳剂量^［15］，予以7.8 g·kg^-1·d^-1的QJZ灌胃；JZ+Pred组予以4.55 mg·kg^-1·d^-1的Pred溶液7.8 g·kg^-1·d^-1的QJZ灌胃；AIM2抑制剂组予以ODN TTAGGG Sodium溶液100 μg/只，连续腹腔注射7 d。连续给药8周。

1.2 实验药品

芪黄健脾滋肾颗粒（黄芪、菟丝子、熟地黄、山药、白术、茯苓、覆盆子、金樱子组成，配比为2∶1∶1∶1.5∶1∶1∶1∶1）由安徽中医药大学第一附属医院制剂中心提供（皖药制备字Z20220041000，批号：20231124），规格10 g/包，30 g/袋。醋酸泼尼松片（天津天药药业有限公司，批号：H12020689），5 mg/片，100片/瓶。ODN TTAGGG Sodium（MCE，货号 HY-150751C），剂量100 μg/只，连续腹腔注射7 d）。

1.3 实验取材

治疗8周后，将小鼠放入代谢笼中采集小鼠尿液。4 ℃、2000 r/min，离心5 min，吸取上清于-80 ℃保存。称取小鼠体质量，腹腔注射3%戊巴比妥钠（20 μL/10 g）麻醉小鼠，通过眼底静脉取血收集小鼠血液，室温静置2 h。4 ℃、3000 r/min，离心15 min，吸取血清并分装，-80 ℃保存备用。剪开小鼠腹部皮肤充分暴露腹腔，用镊子分离小鼠脾脏及肾脏，剥除周围脂肪及结缔组织。脾脏称重、计算脾脏指数（脾脏指数=脾脏质量/小鼠体质量）并拍照后，放入含10% FBS的RPMI 1640培养基中备用。留取肾脏标本，右肾液氮冻存后置于-80 ℃保存备用，左肾福尔马林固定保存，同时留取3~4块芝麻大小的同侧同方向肾组织戊二醛固定，用于后续实验。本研究获得安徽中医药大学实验动物伦理委员会审查与批准（伦理批号：AHUCM-mouse-2024200）。

1.4 生化指标检测

采用日立3100全自动生化分析仪检测小鼠尿液中尿白蛋白（南京建成生物工程研究院，C035-2-1 & 20240522）、尿总蛋白（南京建成生物工程研究院，A045-4 & 20240522）、尿肌酐含量，对尿白蛋白/尿肌酐（ACR）、尿总蛋白/尿肌酐（TPCR）进行测定；对小鼠血清中肌酐（Scr）和血尿素氮 （BUN） 水平检测。

1.5 酶联免疫吸附测定（ELISA）检测自身抗体、细胞因子

使用ELISA试剂盒测定抗双链DNA抗体（dsDNA）、白细胞介素（IL）-10、IL-21、B细胞激活因子（BAFF，武汉基因美）水平；CXC趋化因子受体（CXCR）-12、CXCR19（上海酶联生物科技有限公司）水平。

1.6 苏木精-伊红（HE）、过碘酸-雪夫（PAS）、Masson染色观察肾脏病理情况

取小鼠新鲜肾皮质组织，将肾脏组织放入4%多聚甲醛溶液冰箱固定3 d，依次脱水、包埋、组织切片（切片厚度约3 μm）、脱蜡、脱水后，分别进行HE、PAS和Masson染色，常规酒精脱水、二甲苯透明，中性树胶封片后，显微镜下观察结果。在400倍数的光学显微镜下随机计数带有尿极或血管极的20个肾小球横切面细胞数目，并取其平均值；用Austin法计算狼疮鼠肾组织活动性指数（AI）评分及肾组织慢性化指数（CI）评分。AI根据Austin评分标准，观察肾小球内皮细胞增殖、细胞新月体、炎症细胞浸润、核碎裂坏死、清晰血栓 或白金耳改变、间质炎症细胞浸润6项指标。各指标按病变程度（-）~（+++）分为0、1、2、3分。新月体形成、纤维样坏死评分可双分，AI总分为24分。CI主要包括肾小球硬化、纤维新月形形成、间质纤维化和肾小管萎缩4个指标。按病变程度轻、中、重度分为0、1、2、3分，总分为12分。

1.7 透射电镜下观察肾脏超微结构情况

将若干块1 mm³组织立刻固定到2.5%戊二醛中24 h，把固定液倒入PBS缓冲液6 h，放入1%锇酸后固定2 h。用30%、50%乙醇及70%乙醇醋酸铀（包埋前染色）3 h，80%、89.5%、100%乙醇2次、环氧丙烷脱水处理。纯环氧树脂包埋后入烤箱，后进行切片，铜网捞片。电子染色后（铅染色）采用透射电镜（日本电子，JEM1400）拍照。

1.8 流式细胞术检测脾脏B细胞各亚群水平

首先制备脾细胞悬液，进行流式细胞术操作，剩余脾细胞悬液分装、离心后-80 ℃冻存备用。每个样本均吸取100 μL 细胞悬液至5 mL圆底流式管用于制备样本管。从各组样本取出适量的细胞悬液混匀，吸取100 μL用于制备空白管、抗体单染管。按各抗体说明书要求于细胞悬液中加入1.25 μL的PerCP抗小鼠CD19抗体（BioLegend，B401260）、1.25 μL的PerCP抗小鼠CD27抗体（BioLegend，B310542），1.25 μL的PE抗小鼠CD138（BioLegend，B351080）、CD69（BioLegend，B341205）抗体，轻柔涡旋混匀；于4 ℃避光孵育30 min。洗涤后过膜及上机，使用CytoFLEXS流式细胞仪进行检测，利用CD19⁺和CD27-圈出初始B细胞，再根据CD19⁺和CD27⁺表示记忆B细胞，进行圈门；利用CD19⁺和CD69⁺圈出活化B细胞，CD19^-和CD138⁺表示浆细胞，进行圈门。

1.9 Western blotting测定相关转录因子的相对表达情况

取肾脏组织，加入RIPA裂解液进行裂解，提取总蛋白后，依次经过样品处理以充分变性蛋白、上样与电泳、转膜后加入5%脱脂奶粉室温封闭2 min；加入Blimp1一抗（Bioss，bsm-60268M，1∶1000）、Bcl-6一抗（Abcam，ab33901，1∶2000）、Pax5一抗（Bioss，bsm-60221R，1∶1000）、XBP-1一抗（Bioss，bs-23973R，1∶2000），GAPDH抗体（Zsbio，TA-08，1∶1000），4 ℃缓慢摇动孵育过夜；按照1∶20 000用二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗室温孵育1.2 h；PBST洗膜3次，HRP化学发光底物曝光，使用ECL发光试剂盒来检测蛋白，全自动化学发光成像分析系统显影成像，拍照，保存图像。采用ImageJ图像分析软件统计分析条带蛋白灰度值。

1.10 免疫荧光染色观察肾脏IgG、AIM2、CD19、CD138水平

取肾组织切片，依次进行二甲苯和乙醇的处理，清洗，使用柠檬酸盐修复液进行抗原修复，用阻水笔在每张样本上画疏水圈，然后滴加3%过氧化氢溶液，室温避光孵育10 min，去除内源性过氧化物酶，滴加山羊血清封闭液进行非特异性靶标封闭，分别滴加稀释后的兔属AIM2（Bioss，bs-5986R，1∶300）、CD19（武汉三鹰，27949-1-AP，1∶2000）、CD138（武汉三鹰，10593-1-AP，1∶2000）、IgG（武汉三鹰，30000-0-AP，1∶500）孵育60 min，PBST溶液冲洗后，滴加二抗（HRP标记的山羊抗兔/鼠IgG，1∶400），孵育30 min，滴加TSA荧光染料反应液反应以及适量Dapi染液复染切片，用抗荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜下观察并采集IgG、AIM2、CD19、CD138免疫荧光图像。

1.11 免疫组化测定肾脏C3、C4表达

取肾组织切片，依次进行二甲苯和乙醇的处理，清洗，使用柠檬酸盐修复液进行抗原修复，切片放入3% H₂O₂中室温孵育10 min，滴加兔源C3（Affinity，DF13224，1：200）、C4（武汉三鹰，22233-1-AP，1∶200）一抗孵育60 min，PBST溶液冲洗后，滴加HRP标记的山羊抗兔/鼠二抗（福州迈新， KIT-5220，即用型试剂）试剂孵育30 min，滴加DAB显色剂后，苏木素衬染2 min，水洗干净后分别1%盐酸酒精分化10 s以及碳酸锂溶液蓝化30 s，水洗干净。常规脱水，二甲苯透明后中性树胶封片，显微镜观察C3、C4表达情况。

1.12 统计学分析

采用SPSS26.0和GraphPadPrism10.1.2软件对数据进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，多组间数据比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 QJZ对MRL/lpr狼疮鼠SCr、BUN、TPCR、ACR水平的影响

与Control组相比，Model组MRL/lpr狼疮鼠尿液中TPCR、ACR水平，血清中SCr、BUN水平均升高（P<0.05）；与Model组相比，QJZ组小鼠血清中TPCR、ACR、SCr、BUN水平降低（P<0.05）。与Pred组相比，QJZ在降低ACR、TPCR更有优势（P<0.05）。与Pred组相比，QJZ+Pred组在降低TPCR、ACR、SCr、BUN水平更明显（P<0.05）。

2.2 QJZ对抗双链DNA抗体、细胞因子、趋化因子水平的影响

与Control组相比，Model组小鼠血清中ds-DNA、BAFF、IL-21、CXCR-12、CXCR-19水平升高（P<0.05），IL-10水平降低（P<0.05）；与Model组比较，QJZ组小鼠血清中ds-DNA、BAFF、IL-21、CXCR-12、CXCR-19水平降低（P<0.05），IL-10水平升高（P<0.05）；与Pred组、QJZ组比较，QJZ+Pred组ds-DNA、BAFF、IL-21、CXCR-12、CXCR-19水平降低（P<0.01），IL-10水平升高（P<0.05，图2）。

2.3 QJZ对MRL/lpr狼疮鼠肾脏病理的影响

小鼠肾脏 HE、PAS和Masson染色结果及病理学评分结果显示，LN是免疫复合物沉积导致的肾疾病，侵犯部位主要为肾小球。正常组小鼠肾小球大小正常、轮廓清晰，基底膜呈细线状，周围肾间质炎性细胞浸润较少；PAS染色可见肾小球结构清晰，基底膜和肾小管等部位糖原沉积不明显；Masson染色下见肾小球及周围无明显胶原沉积。Model组狼疮小鼠肾脏中见肾小球大小及形态不规则，肾小囊扩张，系膜细胞和基底膜增生，肾间质炎性细胞浸润明显增加；PAS染色可见明显增厚的基底膜及增生的系膜基质；Masson染色可见肾小球毛细血管内皮下广泛的条带状胶原沉积，肾小球出现局灶性硬化及纤维性新月体形成；AI及CI评分较Control组升高，差异有统计学意义（P<0.05）。与 Model组相比，QJZ组及Pred 组以及芪黄健脾滋肾颗粒加泼尼松组肾小球大小、形态恢复，系膜细胞增生情况好转，基底膜厚度降低，炎性细胞浸润减少；糖原及胶原沉积情况好转，AI评分及CI评分均下降，差异有统计学意义（P<0.05，图3）。

2.4 QJZ对MRL/lpr狼疮鼠肾小球超微结构的影响

透射电镜示Model组小鼠肾小球系膜细胞、基底膜厚度正常，细胞质内常见发达的高尔基体与丰富的核糖体，内质网较丰富；Model组可见系膜区散在或团块状高电子密度物质、系膜基质增厚、细胞外基质增多、细胞核染色质浓缩、边集，胞质空泡化，胞膜完整性破坏；与Model组小鼠相比较，Pred组、QJZ组，基底膜异常增厚有所减轻，团块状高电子密度物质减少，胞质空泡化现象改善，细胞核形态改善，胞膜较完整（图4）。

2.5 QJZ对MRL/lpr狼疮鼠肾脏中C3、C4沉积的影响

与Control组相比，Model组小鼠肾脏组织中C3、C4沉积增多；与Model组比较，QJZ组、Pred组、QJZ+Pred组小鼠肾脏中C3、C4水平均降低（P<0.05）。QJZ+Pred组与Pred组及QJZ组相比，C3、C4表达降低（P<0.05，图5）。

2.6 QJZ对MRL/lpr狼疮鼠B细胞分化关键转录蛋白的影响

与Control组相比，Model组Blimp-1、XBP-1的表达升高、Bcl-6、PAX5的表达下降（P<0.05）。与Model组比较，QJZ组小鼠Blimp-1、XBP-1的表达下降，Bcl-6、PAX5表达上升（P<0.05）。与Pred组相比，QJZ在升高Bcl-6方面表达更显著（P<0.05）。与QJZ组及Pred组比较，QJZ+Pred组Blimp-1、XBP-1表达降低，Bcl-6、PAX5表达升高（P<0.05，图6）。

2.7 QJZ影响MRL/lpr小鼠的B细胞活化

与Control组相比，Model组脾脏指数升高；与Model组比较，QJZ组、Pred组、QJZ+Pred组小鼠脾脏指数的表达均下降（P<0.05）。QJZ+Pred组与Pred组比较小鼠脾脏指数的表达均下降义（P<0.05，图7）。各组小鼠脾脏主要B细胞亚群比例方面，与Control组相比，未经治疗的模型组小鼠脾脏中活化B细胞、记忆B细胞、浆细胞比例升高（P<0.05）；与Model组相比，QJZ组、Pred 组以及QJZ+Pred组小鼠脾脏活化B细胞、记忆B细胞、浆细胞比例降低（P<0.01，图8）。

2.8 QJZ对MRL/lpr狼疮鼠肾组织 IgG、AIM2、CD19、CD138水平的影响

与Control组相比，Model组小鼠肾组织IgG、AIM2、CD19、CD138荧光强度增加；与Model组相比，QJZ、Pred、QJZ+Pred组小鼠肾组织中IgG、AIM2、CD19、CD138表达降低。且QJZ组相较于Pred组，降低IgG、AIM2光密度更显著（图9）。

2.9 QJZ调节AIM2/Blimp-1/Bcl-6抑制B细胞分化

Western blotting结果显示，与模型组相比，AIM2抑制剂组Blimp-1、XBP-1蛋白相对表达量降低，Bcl-6蛋白相对表达量升高（P<0.01，图10A~E）。病理结果显示，与模型组相比，AIM2抑制剂组肾小球大小、形态恢复，系膜细胞增生情况好转，基底膜厚度降低，炎性细胞浸润减少；糖原及胶原沉积情况好转（图10F）。流式细胞术结果显示，AIM2抑制剂组活化B细胞比例、浆细胞比例降低（图10H）。IF结果显示，AIM2抑制剂组IgG表达相对模型组降低（图10G）。免疫组化结果显示，AIM2抑制剂组C3、C4沉积减少（图10I）。

3 讨论

肾损害是SLE最常见的系统损害，是SLE总体发病率和死亡率的主要危险因素，尽管有有效的抗炎和免疫抑制疗法，但仍有太多患者以慢性肾脏病或终末期肾病（5%~20%）告终，早期干预和改善SLE的预后具有重要意义^［16］。在中医认识中，SLE归属于“阴阳毒”、“红蝴蝶疮”等范畴，出现肾损害表现又称为“肾痹”，总体核心病机呈现“脾肾亏虚为本”的特点。芪黄健脾滋肾颗粒具有健脾滋肾、益气固元的功效，在临床应用中疗效明显。有研究对QJZ进行质谱分析以及药物代谢学检测发现^［17］，QJZ含有如槲皮素、金丝桃苷、山柰素（山柰酚）、芍药苷、毛蕊异黄酮苷、紫云英苷、鞣花酸、山柰酚-3-0-芸香糖苷等多种成分。有研究表明，槲皮素治疗可降低BUN、Scr、24 h UP、肾脏肥大指数、肾小球评分、肾小管间质评分以及肾小管评分，有效保护系统性红斑狼疮肾脏功能，改善其免疫功能，且可能通过下调AKT/mTOR通路来抑制初始T细胞向Tfh细胞分化，并减少衰老的Tfh细胞的比例，进而改善MRL/Lpr鼠的狼疮样表型，可能作为SLE治疗的潜在药物^［18-20］。 金丝桃苷^［21］可通过抑制Yes相关蛋白（YAP）发挥缓解肾小管间质纤维化作用，保护肾组织。山柰素（山柰酚）^［22］可以减轻肾小管上皮细胞炎症因子的分泌，增加相关氧化还原酶的表达，进而减轻肾损伤，保护肾功能。 芍药苷^［23］具有广泛的抗炎和免疫调节作用，抑制淋巴细胞增殖和活化，广泛用于SLE的治疗。本研究发现，QJZ降低了 MRL/lpr小鼠的抗dsDNA、IgG、CREA、BUN、TPCR、ACR的水平，降低了肾脏组织中C3和C4的沉积，HE染色及电镜下结果均表明，QJZ对SLE肾损害明显的保护作用。

课题组前期研究主要围绕在其对肾小球系膜细胞增殖、炎症、足细胞凋亡、自噬等方面^［12-15］，尚未对B细胞分化展开研究。但B细胞过度分化在LN的发病机制中起关键作用^［24］。B细胞分化水平与LN疾病活动呈正相关，靶向B 细胞的治疗具有重要意义^［25］。因此本研究主要观察QJZ对B细胞分化的影响及作用机制，首先评价了脾脏指数以评估淋巴细胞增殖程度，结果显示模型组明显升高，但QJZ给药后脾脏指数降低；流式细胞术分析显示，QJZ可抑制B细胞分化，减少了浆细胞的形成，说明QJZ可以通过抑制B细胞过度分化，改善狼疮肾损害。

AIM2是干扰素诱导型PYHIN蛋白家族的成员^［26］，在免疫细胞中，AIM2主要存在于先天免疫细胞中，其功能是感知病原体相关或宿主衍生的胞质dsDNA，募集其他炎性小体成分，并诱导caspase依赖性炎性小体形成^［27-29］。成人中，AIM2主要在B细胞中表达^{［30， 31］}，在SLE B细胞中高表达^［32-34］。Blimp-1、Bcl-6均是控制B细胞分化的关键转录因子^{［35， 36］}，Blimp-1抑制 Bcl-6、Pax5的基因转录，进而抑制浆细胞分化^［37］。既往有研究显示，活动性 SLE B细胞中发现AIM2的表达升高，IL-10的刺激增加了AIM2的蛋白表达。CD19⁺B细胞中AIM2的沉默导致Bcl-6、Pax5的mRNA表达降低，Blimp-1、Xbp1的表达增加，结果表明，AIM2 可能通过直接相互作用负向调节 Blimp-1 表达，正向调节 Bcl-6 表达^［15］。本研究发现，AIM2在SLE模型组中表达增加，而QJZ干预后可减少AIM2的表达，抑制B淋巴细胞分化关键转录蛋白Blimp-1、XBP-1的表达，增加Bcl-6、Pax-5的表达。因此，本研究进一步分析了QJZ改变B细胞群可以缓解SLE疾病的机制。本研究显示，使用AIM2抑制剂后，B细胞分化关键转录因子blimp-1水平降低，Bcl-6水平升高，浆细胞比例减少，IgG生成减少，有效改善了肾损害水平，减少了C3、C4的沉积。

B淋巴细胞的存活、成熟和分化也受到各种B细胞相关细胞因子的影响，例如B细胞活化因子（BAFF）、IL-21^［38］。IL-21是浆细胞分化和增殖的关键驱动因素。从SLE患者中分离的B淋巴细胞在用自体CD3⁺ T淋巴细胞和IL-21刺激时，IgG产生显著增加，而用针对IL-21受体的Fc融合蛋白治疗会抑制B淋巴细胞分化为浆细胞^［39］，本研究显示，QJZ干预后降低了IL-21、BAFF、CXCR-12、CXCR-19的表达，提高了IL-10水平。

综上所述，芪黄健脾滋肾颗粒可下调MRL/lpr小鼠 AIM2、Blimp-1、Bcl-6、免疫学和肾损害指标，改善C3、C4沉积水平，改善MRL/lpr小鼠免疫稳态及肾损

害，其机制可能是通过AIM2/Blimp-1/Bcl-6轴抑制B细胞分化从而改善SLE的肾损害。本研究为中医药干预SLE提供一定的科学依据，但也存在不足，由于中药组方存在多成分、多靶点的特点，在机制研究上需要更多的实验验证。课题组后续将补充细胞功能验证，为今后临床广泛应用奠定理论基础。

参考文献

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基金资助

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安徽省临床医学研究转化专项项目(202304295107020114)

安徽省临床医学研究转化专项项目(202304295107020115)

大健康研究院新安医学与中医药现代化研究所专项(2023CXMMTCM015)

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