黄芪甲苷通过抑制PINK1/Parkin通路调控细胞线粒体自噬减轻D-半乳糖诱导的内皮细胞衰老

Astragaloside IV alleviates D-GAL-induced endothelial cell senescence by promoting mitochondrial autophagy via inhibiting the PINK1/Parkin pathway

摘要

目的 探究黄芪甲苷Ⅳ（AS-IV）通过PINK1/Parkin信号通路，调控细胞线粒体自噬水平减轻D-半乳糖（D-GAL）内皮细胞（HUVEC）衰老的作用机制。 方法 将体外培养的人脐静脉内皮细胞随机分为5组：空白对照组（NC组）、D-GAL（40 g/L D-GAL）组、AS-IV（200 μmol/L）组、D-GAL+AS-IV（40 g/L D-GAL+200 μmol/L）组，D-GAL+AS-IV+MTK458（40 g/L D-GAL+200 μmol/L+25 μmol/L）组，干预48 h。评估细胞增殖、迁移和血管生成能力；检测细胞凋亡、活性氧水平、线粒体膜电位，以及检测自噬相关蛋白（LC3-II/LC3-I）和PINK1/Parkin通路蛋白的表达。 结果 经AS-IV干预后，D-GAL对HUVEC细胞活力的抑制作用显著降低（P<0.05），AS-IV有效缓解D-GAL诱导的HUVEC管状结构形成障碍，促进血管生成（P<0.05）、恢复细胞的迁移能力（P<0.05），D-GAL诱导的HUVEC细胞中衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色阳性率也显著降低（P<0.05），并抑制衰老相关基因P21和P53的表达。AS-IV恢复D-GAL诱导的线粒体膜电位，降低细胞内活性氧水平（P<0.05）；并抑制D-GAL诱导的HUVEC细胞中自噬体与溶酶体的融合，阻止自噬流的完成。当加入线粒体自噬激动剂MTK458（25μmol/L）后，与D-GAL+AS-IV组相比，D-GAL+AS-IV+MTK458组中细胞黄色斑点明显增加（P<0.05），P21、P53、PINK1、Parkin、LC3、Beclin等蛋白表达上升（P<0.05）。 结论 AS-IV通过抑制PINK1/Parkin通路调控线粒体自噬，从而减轻D-GAL诱导的内皮细胞衰老。

Abstract

Objective To explore the mechanism by which astragaloside IV (AS-IV) alleviates D-galactose (D-GAL)-induced senescence in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Methods Cultured HUVECs were treated with D-GAL (40 g/L), AS-IV (200 μmol/L), D-GAL+AS-IV, or D-GAL+AS-IV+MTK458 (a mitochondrial autophagy agonist, 25 μmol/L) for 48 h, and the changes in cell proliferation, migration, and angiogenesis capacity were evaluated. Cell apoptosis, reactive oxygen species (ROS) levels, mitochondrial membrane potential, and expressions of autophagy-related proteins (LC3-II/LC3-I) and PINK1/Parkin pathway proteins in the treated cells were detected. Results AS-IV treatment significantly reduced the inhibitory effect of D-GAL on HUVEC viability, effectively alleviated D-GAL-induced impairment of tube-forming ability, and promoted angiogenesis and migration ability of the cells. AS-IV also significantly reduced the rate of D-GAL-induced HUVECs positive for senescence-associated β-galactosidase (SA-β-Gal) staining and inhibited the expression of senescence-related genes P21 and P53. AS-IV restored mitochondrial membrane potential and reduced intracellular ROS levels in D-GAL-induced HUVECs, and inhibited the fusion of autophagosomes and lysosomes to prevent the completion of autophagic flux. In HUVECs treated with both D-GAL and AS-IV, the application MTK458 significantly increased the number of yellow spots and enhanced the expressions of P21, P53, PINK1, Parkin, LC3, and Beclin proteins. Conclusion AS-IV alleviates D-GAL-induced endothelial cell senescence by inhibiting the PINK1/Parkin pathway to regulate mitochondrial autophagy.

Graphical abstract

关键词

黄芪甲苷 / PINK1/Parkin信号通路 / 线粒体自噬 / D-半乳糖 / 内皮细胞 / 细胞衰老

Key words

astragaloside / PINK1/Parkin signaling pathway / mitochondrial autophagy / D-galactose / endothelial cells / cellular senescence

细胞衰老，作为生物体老化的核心机制之一，近年来其作为慢性疾病驱动因素的病理学价值受到深度关注。内皮细胞衰老在血管老化进程中具有重要作用，其功能障碍直接参与动脉粥样硬化斑块形成、血管弹性下降及高血压病理重构等关键环节^［1-3］。这些研究强调了细胞衰老不仅是生物体老化的标志，更是多种慢性疾病的驱动因素。特别是在内皮细胞中，衰老的内皮细胞呈现线粒体动力学失衡特征，表现为活性氧（ROS）过度蓄积、线粒体膜电位崩溃及生物发生障碍，直接影响血管的结构和功能，进而促进心血管疾病的发展^［4］。因此，寻找有效干预内皮细胞衰老的策略，对于延缓血管老化和相关疾病的进程具有重要意义。

线粒体自噬是细胞清除受损线粒体的重要途径，对于维持线粒体功能和细胞稳态至关重要^［5］。PINK1/Parkin通路作为核心调控轴，通过PINK1蓄积磷酸化线粒体外膜蛋白，招募Parkin泛素化标记受损线粒体，启动自噬体包裹降解。衰老微环境中，氧化应激致Parkin转位受阻、泛素连接酶活性丧失，引发线粒体功能衰竭与自噬失代偿^［6］。

黄芪甲苷（AS-Ⅳ）作为传统中药黄芪的主要活性成分，近年研究发现其可通过抑制PINK1/Parkin或者AMPK/SIRT3轴改善线粒体功能，但具体作用靶点尚未明确^{［7， 8］}。值得注意的是，D-半乳糖（D-GAL）诱导的亚急性衰老模型能精准模拟自然衰老的线粒体代谢表型，其通过半乳糖醇代谢途径产生过氧化氢等自由基，特异性攻击线粒体复合物I，导致mtDNA损伤和呼吸链解耦联，最终导致细胞衰老^［9］，但针对线粒体自噬修复的干预研究仍处于空白。

尽管现有研究已证实AS-Ⅳ具有调控线粒体自噬潜能，但其对D-GAL诱导HUVEC衰老的具体机制尚未明确。本研究创新性地提出：通过AS-Ⅳ干预，能够改善D-GAL诱导的HUVEC细胞衰老现象，并深入探究AS-Ⅳ通过抑制PINK1/Parkin通路从而调控线粒体自噬的分子机制，为临床延缓血管衰老及相关疾病提供了实验基础。

1 材料和方法

1.1 细胞株

人脐静脉内皮细胞（HUVEC）采购于上海中桥新舟生物有限公司。

1.2 主要试剂

AS-Ⅳ（PERFEMIKER）；D-GAL（索莱宝）；人脐静脉内皮细胞完全培养基（中桥新舟）；细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒（Beyotime）、CCK-8试剂盒（Abbkine）；JC-1试剂盒（翌圣生物）；LC3‑Ⅰ/Ⅱ、P62、Beclin、PINK和Parkin（Proteintech）；P21和P53（Invitrogen）；β-actin和GAPDH（Abcam）。

1.3 细胞培养及分组

HUVEC培养在含有10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和 100 mg/mL 链霉素的 DMEM-F12 培养基中，在37 ℃ 、5% CO₂ 培养箱中进行培养。将HUVEC随机分为5组：空白对照组（NC组）、加入40 g/L D-GAL（D-GAL）组、加入200 μmol/L AS-IV（AS-IV）组、40 g/LD-GAL干预24 h后加入200 μmol/L的AS-IV继续干预24 h（D-GAL+AS-IV）组，和D-GAL+AS-IV+MTK45（40 g/L D-GAL+200 μmol/L+25 μmol/L）组，干预48 h后收取细胞样本进行实验。

1.4 CCK-8检测细胞增殖

将干预48 h后的各组HUVEC收集重悬接种于96孔板中，每孔加10 μL CCK-8工作液，孵育3 h后酶标检测仪于450 nm波长处检测吸光值A_{450 nm}。

1.5 细胞划痕

将HUVEC细胞（1×10⁵/mL）接种在6孔板中并培养24 h后进行划痕实验，用无菌移液枪枪头垂直于孔板制造细胞划痕，于0和24 h拍照并测算细胞划痕的愈合率（%）。

1.6 β-半乳糖苷酶染色

将HUVEC细胞（1×10⁵/mL）接种在12孔板（3个复孔/组）中培养48 h后，按照空白对照组、AS-IV组、D-GAL组和D-GAL+AS-IV组分组给药。第2天用β-半乳糖苷酶染色，用荧光显微镜拍摄记录其结果，计算并统计阳性染色率。

1.7 细胞成血管功能检测

先于96孔板中加入50 μL/孔基质胶，后将干预48 h的各组细胞收集重悬接种于胶上，继续孵育3 h后，镜下观察小管直径（mm），取其平均值，评价成管能力。

1.8 Tunel检测细胞凋亡情况

将分组干预后的各组HUVEC采用Tunel检测试剂盒（一步法）参照说明书指示，在样品上加50 μL TUNEL检测液，37 ℃避光孵育60 min，孵育完成后在倒置光学显微镜下观察拍照。

1.9 流式细胞仪检测ROS水平

干预48 h的各组细胞收集重悬后加入1∶1000无血清培养基稀释的ROS荧光探针，间隔混匀，孵育30 min后洗脱未结合的荧光探针，PBS重悬细胞上机进行检测。

1.10 线粒体膜电位检测

JC-1工作液按1∶1000用无血清培养基稀释稀释至10 μmol/L，在6孔板中培养的各组HUVEC细胞加入1 mL JC-1工作液，37 ℃孵育20 min后用JC-1缓冲液清洗，加入2 mL不含血清培养基后在荧光倒置显微镜下采集图片。

1.11 实时荧光定量PCR

使用快速提取试剂盒提取各组HUVEC 细胞RNA，测定RNA的纯度与浓度。随后反转录为cDNA，配制PCR反应体系进行基因扩增及定量检测分析。用2^-∆∆CT法推算各组HUVEC 细胞中目标基因的表达。详细操作步骤严格遵循试剂盒说明书，人源的基因引物序列详见表1（上海捷瑞生物工程有限公司）。

1.12 定表达自噬双标慢病毒（mRFP‐eGFP‐LC3）的构建

HUVEC细胞以10⁵/皿接种于共聚焦小皿，给予不同处理培养48 h后，根据制造商的说明用 mRFP‐EGFP‐LC3 慢病毒（海星生物）处理HUVEC细胞，于激光共聚焦荧光显微镜下观察红色和绿色 LC3 的荧光点变化，随机选取一个视野下所有细胞进行拍照，分析自噬变化。

1.13 Western blotting法检测自噬蛋白/衰老标记蛋白表达水平

干预48 h的各组细胞收集提取蛋白，BCA法测蛋白浓度，依次进行电泳、转膜、脱脂奶粉室温封闭；分别孵育一抗LC3Ⅱ/Ⅰ（1∶1000）、P62（1∶5000）、Beclin1（1∶1000）、PINK1（1∶500）、Parkin（1∶1000）及GAPDH（1∶2000）、后孵育兔二抗（1∶10 000）。通过ImageJ 软件对各个条带的灰度值进行比对分析。

1.14 统计学分析

Image J软件用于分析结果图及 Werstern blotting结果， GraphPadPrism9.0软件则用于数据的统计分析及绘图。采用SPSS26.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用one-way ANOVA分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AS-IV对D-GAL诱导HUVEC细胞活力的影响

0~20 g/L 浓度的D-GAL 对正常HUVEC细胞无显著影响，当浓度达到，40 g/L 时，细胞存活率降低（P<0.05），与NC组相比，D-GAL组细胞活力降低（P<0.05）；经AS-IV干预后，D-GAL+AS-IV组细胞活力升高（P<0.05，图1）。

2.2 AS-IV对D-GAL诱导的HUVEC管状结构形成能力的影响

与NC组相比，D-GAL组管腔长度显著缩短、分支点数减少，HUVEC细胞的管状结构形成能力受到抑制（P<0.05），但是，经AS-IV干预后，D-GAL+AS-IV组管腔长度和分支点数显著增加，HUVEC细胞的管状结构形成能力增强（P<0.05，图2）。

2.3 AS-IV对D-GAL诱导的HUVEC细胞迁移能力影响

与NC组相比，D-GAL组细胞迁移能力受到显著抑制，伤口愈合率在24 h低于NC组（P<0.05）。经AS-IV干预后，D-GAL+AS-IV组划痕愈合率在24 h提高（P<0.05，图3）。

2.4 AS-IV对D-GAL诱导的HUVEC细胞半乳糖染色阳性率影响

与NC组相比，D-GAL组大量细胞呈现明显的蓝色染色，阳性细胞百分比高于NC组（P<0.05）。经AS-IV干预后，D-GAL+AS-IV组阳性细胞百分比降低（P<0.05，图4）。

2.5 AS-IV对D-GAL诱导的HUVEC细胞中P21和P53的表达影响

与NC组相比，D-GAL组P21和P53的mRNA及蛋白表达水平上调（P<0.05），经AS-IV干预后，D-GAL+AS-IV组的mRNA及蛋白表达水平下调（P<0.05，图5）。

2.6 AS-IV对D-GAL诱导的HUVEC细胞中线粒体膜电位影响

与NC组相比，D-GAL组JC-1染色显示绿光荧光强度增加（P<0.05），表明线粒体膜电位下降（P<0.05），经AS-IV干预后，D-GAL+AS-IV组的绿光荧光强度降低（P<0.05，图6）。

2.7 AS-IV对D-GAL诱导的HUVEC细胞中ROS阳性细胞百分比影响

与NC组相比，D-GAL组细胞内ROS水平显著升高，ROS阳性细胞百分比高于NC组（P<0.05），经AS-IV干预后，D-GAL+AS-IV组的ROS阳性细胞百分比降低（P<0.05，图7）。

2.8 AS-IV对D-GAL诱导的HUVEC细胞中自噬情况的影响

通过荧光显微镜观察mRFP（红色荧光）和GFP（绿色荧光）标记的LC3蛋白分布（图8）显示，与NC组相比，D-GAL组细胞中黄色斑点增加（P<0.05），表明自噬流呈现上升趋势，经AS-IV干预后，D-GAL+AS-IV组的黄色斑点减少（P<0.05）。

2.9 AS-IV对D-GAL诱导的HUVEC细胞中PINK1/Parkin通路及细胞自噬相关蛋白表达的影响

与NC组相比，D-GAL组P62 mRNA及蛋白表达水平显著下调（P<0.05），而LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白、Beclin、PINK和Parkin的mRNA及蛋白表达水平显著上调（P<0.05），经AS-IV干预后，D-GAL+AS-IV组的P62 mRNA及蛋白表达水平显著上调（P<0.05），而LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白、Beclin、PINK和Parkin的mRNA及蛋白表达水平显著下调（P<0.05，图9）。

2.10 MTK458对D-GAL诱导的HUVEC细胞中自噬体与溶酶体的融合及自噬流的影响

与D-GAL+AS-IV组相比，D-GAL+AS-IV+MTK458组细胞中黄色斑点明显增多（P<0.05，图10）。

2.11 MTK458对D-GAL诱导的HUVEC细胞中PINK1/Parkin通路及细胞衰老、自噬相关蛋白表达的影响

与D-GAL+AS-IV组相比，D-GAL+AS-IV+MTK458组P62 mRNA及蛋白表达水平显著下调（P<0.05），而P21、P53、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白、Beclin、PINK和Parkin的mRNA及蛋白表达水平显著上调（P<0.05，图11）。

3 讨论

内皮细胞衰老作为血管老化的核心病理环节，不仅是机体衰老进程的关键表征，更是动脉粥样硬化、高血压等重大心血管疾病发生发展的核心驱动因素^［10-12］。D-GAL作为一种经典的衰老诱导剂，其通过非酶促糖基化反应生成大量ROS，ROS具有强氧化性，可攻击线粒体，导致线粒体氧化应激，使线粒体膜电位改变、呼吸链功能受损。同时，ROS还会引发内膜脂质过氧化，破坏细胞膜的完整性和流动性。这些变化进一步激活p53/p21信号通路，p53作为转录因子，可上调p21的表达，p21通过抑制细胞周期蛋白依赖性激酶，使细胞周期停滞在G1期，最终诱导细胞呈现衰老表型^{［13， 14］}。本研究中，D-GAL处理显著降低了HUVEC细胞活力、抑制血管生成能力、削弱迁移能力，并伴随衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）阳性率升高及衰老相关基因（P21、P53）表达上调。这些结果与D-半乳糖诱导衰老的经典机制一致，说明本实验模型构建成功。

AS-IV作为传统中药黄芪的主要活性成分，其抗氧化、抗炎和抗衰老作用已被广泛研究^{［15， 16］}。AS-IV可通过清除自由基、抑制脂质过氧化以及激活抗氧化酶来减轻氧化应激损伤，同时调节免疫反应，减轻炎症对细胞的损伤^{［17， 18］}。近年来，AS-IV在调节细胞自噬和线粒体功能方面的作用逐渐受到关注^［19-21］。本研究中，AS-IV干预后，D-GAL诱导的HUVEC细胞衰老表型得到显著逆转，包括细胞活力恢复、血管生成能力增强、迁移能力改善以及SA-β-Gal阳性率下降。这些结果与AS-IV的抗氧化和抗炎作用密切相关^［22］。AS-IV可能通过减轻氧化应激和炎症反应，改善细胞内环境，从而逆转细胞衰老。

线粒体自噬是细胞维持自身稳态的重要机制，通过自噬溶酶体机制选择性清除受损线粒体，对于维持线粒体质量和细胞功能至关重要^{［23， 24］}。本研究中，D-GAL处理导致线粒体膜电位下降、细胞内ROS水平升高，并伴随自噬体与溶酶体的融合，自噬流增加。这一现象与D-半乳糖诱导的线粒体功能障碍和自噬机制相符^{［25， 26］}。D-半乳糖可通过降低线粒体生物发生关键蛋白（如PGC-1α）的表达，阻碍线粒体新生和稳态^{［27， 28］}。AS-IV干预后，线粒体膜电位恢复、ROS水平降低，并伴随自噬体与溶酶体分离，表明自噬流受到抑制。这一结果与AS-IV抑制线粒体自噬的作用一致^［29］。AS-IV可能通过调节相关信号通路，改善线粒体功能，抑制自噬体与溶酶体的融合，阻止自噬流。

PINK1/Parkin通路作为线粒体自噬的核心调控枢纽，其动态平衡对维持线粒体稳态至关重要^{［30， 31］}。在正常情况下，PINK1在线粒体内膜上被切割并清除；当线粒体受损时，PINK1在线粒体外膜上积累并招募Parkin，进而激活线粒体自噬^{［32， 33］}。本研究中，D-GAL处理后PINK1和Parkin的mRNA及蛋白表达水平显著上调，表明PINK1/Parkin通路被激活。AS-IV干预后，PINK1和Parkin的表达水平恢复正常。这一机制与AS-IV的抗氧化和抗炎作用相互协同，共同减轻D-GAL诱导的细胞衰老^{［34， 35］}。加入线粒体自噬激动剂MTK458后，促进D-GAL诱导的HUVEC细胞自噬体与溶酶体的融合，促进自噬流的完成，PINK1/Parkin通路、细胞衰老相关蛋白、自噬相关蛋白表达均上升。证明AS-IV减轻D-GAL诱导的内皮细胞衰老，与PINK1/Parkin通路调控线粒体自噬有关。

AS-IV作为黄芪的主要活性成分，具有来源广泛、安全性高、副作用小等优点。目前，AS-IV已用于多种疾病的治疗，如心血管疾病、糖尿病及其并发症等^{［36， 37］}。本研究结果揭示了AS-IV通过抑制PINK1/Parkin通路调控线粒体自噬的抗衰老机制，为AS-IV的临床应用提供了实验基础和理论依据。本研究表明，AS-IV还具有显著的抗衰老作用，可望用于延缓血管衰老及相关疾病的发生发展。

然而，本研究仍存在一定局限性。首先，研究仅在细胞层面进行，未涉及动物或人体实验，AS-IV在整体动物模型中的效果尚待验证。其次，PINK1/Parkin通路与其他信号通路（如mTOR、AMPK）的交互作用尚未明确，这些信号通路之间可能存在复杂的网络调控关系，共同影响细胞衰老和线粒体自噬。最后，AS-IV的剂量效应关系及长期安全性需进一步探索，不同剂量可能产生不同的效果，长期使用是否会产生不良反应也不清楚。未来研究可构建动物衰老模型，为AS-IV的广泛应用提供更坚实的理论基础和临床依据。

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基金资助

湖南省自然科学基金(2024JJ9572)

深圳市科技计划项目(JCYJ20220531091611026)

深圳市科技计划项目(JCYJ20230807150803007)

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