刺桐碱通过抑制肠上皮炎症反应并改善肠屏障功能缓解小鼠克罗恩病样结肠炎

Hypaphorine alleviates Crohn's disease-like colitis in mice by inhibiting intestinal epithelial inflammatory response and protecting intestinal barrier function

摘要

目的 探讨刺桐碱（HYP）对小鼠克罗恩病（CD）样结肠炎的作用及其分子机制。 方法 本研究采用2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）诱导构建小鼠CD样结肠炎模型。将30只C57BL/6J雄性小鼠随机分为3组：WT组、TNBS组和HYP组，10只/组。TNBS组和HYP组采用TNBS诱导结肠炎，HYP组每日灌胃15 mg/kg HYP，其余2组给予等量生理盐水。通过疾病活动指数（DAI）评分、体质量变化、结肠长度及组织病理学评分等指标，评估HYP对小鼠CD样结肠炎的治疗效果。在体外实验中，采用LPS刺激的Caco-2细胞建立肠上皮炎症模型，分为Control组、LPS组和LPS+HYP组。采用qRT-PCR、免疫荧光等技术检测HYP对肠上皮炎症反应及屏障功能的影响。进一步通过GO和KEGG富集分析预测HYP的作用机制，并利用Western blotting验证关键信号通路的调控。 结果 体内研究结果显示，HYP干预可改善TNBS诱导的小鼠结肠炎症状，具体表现为：体质量下降趋势减缓、结肠长度缩短程度改善、DAI评分及组织炎症评分降低，同时结肠黏膜中促炎因子表达水平下调（P<0.05）。在肠屏障功能方面，HYP干预后TNBS模型小鼠结肠组织TEER值升高，细菌移位率（肠系膜淋巴结、肝脏、脾脏）降低，血清中I-FABP和FITC-Dextran的浓度下降（P<0.05）。此外，HYP干预还可增加结肠组织杯状细胞数量，并上调MUC2和紧密连接蛋白（Claudin-1、ZO-1）表达（P<0.05）。体外研究结果显示，与LPS组相比，HYP处理可抑制Caco-2细胞促炎因子表达并恢复紧密连接蛋白水平（P<0.05）。Western blotting分析显示，HYP在体内外模型中均能下调TLR4/MyD88信号通路关键蛋白的表达（P<0.05）。 结论 HYP可能通过抑制肠上皮炎症反应并改善肠屏障功能，从而缓解小鼠CD样结肠炎。

Abstract

Objective To investigate the effect of hypaphorine (HYP) on Crohn's disease (CD)‑like colitis in mice and its molecular mechanism. Methods Thirty male C57BL/6J mice were equally randomized into WT, TNBS, and HYP groups, and in the latter two groups, mouse models of CD-like colitis were established using TNBS with daily gavage of 15 mg/kg HYP or an equivalent volume of saline. The treatment efficacy was evaluated by assessing the disease activity index (DAI), body weight changes, colon length and histopathology. The effect of HYP was also tested in a LPS-stimulated Caco-2 cell model mimicking intestinal inflammation by evaluating inflammatory responses and barrier function of the cells using qRT-PCR and immunofluorescence staining. GO and KEGG analyses were conducted to explore the therapeutic mechanism of HYP, which was validated in both the cell and mouse models using Western blotting. Results In the mouse models of CD-like colitis, HYP intervention obviously alleviated colitis as shown by significantly reduced body weight loss, colon shortening, DAI and inflammation scores, and expressions of pro-inflammatory factors in the colon tissues. HYP treatment also significantly increased the TEER values, reduced bacterial translocation to the mesenteric lymph nodes, liver, and spleen, lowered serum levels of I-FABP and FITC-dextran, increased the number of colonic tissue cup cells, and upregulated colonic expressions of MUC2 and tight junction proteins (claudin-1 and ZO-1) in the mouse models. In LPS-stimulated Caco-2 cells, HYP treatment significantly inhibited the expressions of pro-inflammatory factors and increased the expressions of tight junction proteins. Western blotting showed that HYP downregulated the expressions of the key proteins in the TLR4/MyD88 signaling pathway in both the in vitro and in vivo models. Conclusion HYP alleviates CD-like colitis in mice possibly by suppressing intestinal epithelial inflammation and improving gut barrier function.

Graphical abstract

关键词

克罗恩病 / 结肠炎 / 刺桐碱 / 肠屏障 / 肠上皮细胞

Key words

Crohn's disease / colitis / hypaphorine / intestinal barrier / intestinal epithelial cells

克罗恩病（CD）是炎症性肠病（IBD）的主要亚型之一，其典型病理特征为肠道免疫失衡和透壁性炎症^［1］。尽管其确切发病机制尚未完全阐明，但研究表明，遗传易感性、环境因素、肠屏障损伤及肠道微生物群的异常相互作用共同参与疾病的发生与发展^［2］。其中，肠道屏障的破坏在CD的发病机制中发挥着至关重要的作用^［3］。肠机械屏障由上皮细胞和紧密连接蛋白（如Claudin-1、ZO-1等）共同构成，其结构完整性是抵御病原体及其内毒素入侵的关键^［4］。在肠上皮炎症反应过程中，促炎因子（如TNF-α和IL-1β等）通过下调紧密连接蛋白的表达并干扰其正常分布，直接破坏肠屏障功能，促使肠道内细菌及抗原易位，进而加重肠道炎症^［5］。因此，靶向调控肠上皮炎症并保护肠屏障已成为治疗CD的潜在策略^［6］。目前，CD的临床治疗主要依赖于药物干预，包括氨基水杨酸制剂、糖皮质激素、免疫抑制剂（如硫唑嘌呤、甲氨蝶呤）以及生物制剂（如抗TNF-α单抗）^［7-9］。然而，现有治疗方案仍存在疗效不足、副作用明显、个体差异大等局限性^［10-12］。天然药物单体凭借多靶点调控和低毒性等优势，在CD治疗领域展现出潜在的应用价值^［13-15］。

刺桐碱（HYP）是一种从传统药用植物牛大力和王不留行中提取的吲哚类生物碱^{［16， 17］}。既往文献报道，HYP能够通过下调TLR4信号通路显著缓解LPS诱导的内皮炎症反应^［18］；此外，其还可通过调控DUSP1/p38/JNK通路，在LPS介导的急性肺损伤中发挥抗炎作用^［19］。然而，现有研究主要局限于HYP的单一抗炎功能，而CD的治疗需同时靶向炎症抑制和肠屏障修复。基于此，本研究旨在探究HYP能否通过调节肠上皮炎症反应并改善肠屏障功能，从而缓解小鼠CD样结肠炎。通过建立TNBS诱导的小鼠结肠炎模型和LPS诱导的Caco-2细胞模型，结合分子生物学和免疫学技术，系统性评估HYP对肠上皮炎症、肠屏障功能以及TLR4信号通路的影响，以期为HYP作为CD治疗新策略提供重要的理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物和细胞

6~8周龄的C57BL/6J雄性小鼠（20~25 g）购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司。小鼠在标准条件下饲养（温度20~24 ℃，湿度40%~60%，12 h光照/黑暗周期），自由摄食和饮水。所有动物实验均经蚌埠医科大学伦理委员会批准（伦理批号：伦动科批字〔2024〕第421号）。人结肠癌细胞系Caco-2来源于中国医学科学院肿瘤细胞库，在DMEM高糖培养基（含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素）中，于37 ℃、5%CO₂培养箱中培养。

1.1.2 试剂

TNBS， LPS（Sigma-Aldrich）；FITC-dextran（TargetMol）；TB Green Premix Ex Taq II， PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara Bio）；兔抗Claudin-1多克隆抗体、山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor® 647）、山羊抗兔IgG H&L（FITC）、山羊抗小鼠IgG H&L（Alexa Fluor® 555）及兔抗MUC2单克隆抗体（Abcam）；小鼠抗ZO-1单克隆抗体（Invitrogen）；兔抗TLR4多克隆抗体及小鼠抗MyD88单克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；刺桐碱（上海源叶生物科技有限公司）；CCK-8细胞增殖-毒性检测试剂盒、苏木素-伊红（H&E）高清恒染试剂盒及AB-PAS染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；小鼠I-FABP/TNF-α/IL-6/IL-1β ELISA试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；50×Cocktail蛋白酶抑制剂（武汉赛维尔生物科技有限公司）；BCA蛋白定量试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；小鼠抗β-actin单克隆抗体、HRP标记的山羊抗兔IgG及HRP标记的山羊抗小鼠IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.2 模型及分组

1.2.1 TNBS诱导的小鼠结肠炎模型及分组

构建TNBS诱导的小鼠结肠炎模型，具体操作如下^［20］：将30只C57BL/6J雄性小鼠随机分为3组：WT组、TNBS组和HYP组，10只/组。对TNBS组和HYP组小鼠进行造模处理，WT组灌肠等量生理盐水。造模前，小鼠禁食不禁水24 h，；采用腹腔注射1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉小鼠后，用注射器抽取100 μL的2.5%TNBS乙醇溶液，采用聚乙烯软管经肛门缓慢注入小鼠直肠内，并保持头低臀高位5 min；造模后，HYP组小鼠连续6 d每日灌胃100 μL HYP溶液（15 mg/kg）^{［19， 21， 22］}，WT组和TNBS组小鼠每日灌胃等体积生理盐水。造模当天和造模后第7天记录小鼠体质量，实验期间观察并记录各组小鼠粪便形状和便血情况，采用疾病活动指数（DAI）评分标准评估结肠炎严重程度^［23］。造模后第7天，麻醉各组小鼠并取血清，分装后-80 ℃保存，随后脊椎脱臼处死小鼠，迅速分离结肠组织，测量长度并拍照，5只/组于4%多聚甲醛中固定，另5只刮取肠黏膜组织于-80 ℃保存备用。

1.2.2 LPS刺激的Caco-2细胞炎症模型及分组

设置Control组、LPS组及LPS+HYP组，将Caco-2细胞分别接种于6孔板（4×10⁵ /孔）和24孔板（5×10⁴ /孔），各组细胞生长至70%~80 %后弃去原有培养基，Control组加入新鲜培养基，LPS组加入含10 μg/mL LPS的完全培养基^［24］，LPS+HYP组加入含10 μg/mL LPS联合12.5 μmol/L HYP的完全培养基^［18］，刺激24 h后，收集24孔板中的细胞培养上清液并离心用于ELISA检测，6孔板中弃去上清分别加入TRIzol试剂，用于后续qRT-PCR分析。

1.3 方法

1.3.1 HE染色和结肠组织炎症评分

各组结肠组织经4%多聚甲醛固定24 h后，沿纵轴卷曲成“瑞士卷”状，依次经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡浸渍后包埋。使用切片机制备3 μm厚度的连续切片，严格按照HE染色试剂盒说明书进行操作。采用全自动数字玻片扫描系统（VS200）扫描，并参照既往文献报道的组织病理学评分标准进行评估^［25］。

1.3.2 跨上皮电阻（TEER）测定

新鲜结肠组织用PBS冲洗后置于Krebs缓冲液（37 ℃，pH 7.33~7.37）中，切成长2.8 mm、宽11 mm片段，放入Ussing chamber系统。两腔充满Krebs缓冲液，血清侧加10 mmol/L葡萄糖，管腔侧加10 mmol/L甘露醇。调节电压和电流，测定TEER值，平衡15 min后读数。将Caco-2细胞（Control组、LPS组、LPS+HYP组）接种于3 μm孔径Transwell小室，插入24孔板。上下室加入完全培养基，每2天换液，培养21 d形成单层。使用细胞电阻仪测定TEER值，评估屏障完整性。

1.3.3 细菌移位

无菌分离小鼠肠系膜淋巴结、肝脏和脾脏，各取0.1 g（每脏器3份）加入0.9 mL生理盐水制成匀浆。取100 µL匀浆涂布于培养基，37 ℃培养24 h。菌落数>10² CFU/g为阳性，计算各组各脏器阳性样本数与总样本数的百分比，即细菌移位率。

1.3.4 异硫氰酸-葡聚糖荧光素（FITC-dextran）检测

取检前，各组小鼠禁食4 h，灌胃FITC-dextran（600 mg/kg）。4 h后采集小鼠心脏血液，室温静置1 h，离心分离血清，使用荧光分光光度计检测血清中FITC-dextran浓度。

1.3.5 AB-PAS染色

首先将切片脱蜡水化，随后浸入阿利新蓝染液中室温染色10 min，滴加1%过碘酸氧化5 min后，浸入Schiff试剂室温避光染色10 min。苏木素染核1 min，1%盐酸乙醇分化2 s，1%氨水返蓝15 s。经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片后扫描成数字玻片。采用Image J计算隐窝中杯状细胞数量。

1.3.6 免疫组化染色

采用免疫组化染色检测小鼠结肠组织中MUC2的表达水平。切片脱蜡水化后，经柠檬酸钠缓冲液抗原修复30 min，3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶30 min，10%山羊血清封闭30 min。滴加一抗（MUC2，1∶1000）4 ℃孵育过夜，PBS洗涤后滴加二抗（HRP标记的山羊抗兔IgG，1∶2000）室温孵育1 h，DAB显色3 min，光学显微镜下观察，MUC2阳性信号呈棕色，随后进行苏木素染核10 min，经分化、返蓝、脱水、透明后封片。采用Image J计算IOD值。

1.3.7 小鼠结肠组织免疫荧光染色

采用免疫荧光染色检测小鼠结肠组织中Claudin-1和ZO-1的表达水平。各组小鼠结肠组织石蜡切片经脱蜡水化后，95 ℃下柠檬酸钠缓冲液抗原修复1 h。5% BSA封闭1 h后，加入一抗（Claudin-1，1∶400；ZO-1，1∶200）4 ℃孵育过夜。PBS洗涤后，加入荧光二抗［山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor 647），1∶1000；山羊抗小鼠IgG H&L（Alexa Fluor 555），1∶1000］室温避光孵育1 h。DAPI染核5 min，封片后于Leica倒置荧光显微镜下扫描染色结果。

1.3.8 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）

采用qRT-PCR检测小鼠肠黏膜组织和Caco-2细胞炎症因子的mRNA表达水平。使用TRIzol法提取各组小鼠肠黏膜组织和Caco-2细胞的总RNA，按照PrimeScript RT reagent Kit说明书进行反转录反应，合成cDNA。qRT-PCR反应体系配制如下：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（2×）12.5 μL，正反向引物（10 μmol/L）各1 μL，cDNA溶液2.5 μL，加ddH₂O至25 μL。反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s，40个循环。采用2^-ΔΔCt法进行相对定量分析，以GAPDH作为内参基因。引物序列均由上海生工合成（表1）。

1.3.9 ELISA

取各组小鼠肠黏膜组织，按组织质量与RIPA裂解液1∶10的比例（0.1 g/mL）加入预冷的RIPA裂解液，在冰上用组织匀浆器充分匀浆，离心后取上清。同时，取出各组小鼠血清和体外培养的各组Caco-2细胞培养上清液，按照ELISA试剂盒操作步骤，分别检测以下指标：小鼠肠黏膜组织和Caco-2细胞培养上清液中TNF-α、IL-6和IL-1β的表达水平；小鼠血清中肠型脂肪酸结合蛋白（I-FABP）的表达水平。

1.3.10 细胞免疫荧光染色

将Caco-2细胞接种于放置细胞爬片的24孔板中，实验分为Control组、LPS组和LPS+HYP组。干预24 h后，依次进行4%多聚甲醛固定、0.2% TritonX-100通透处理，其余步骤同1.3.7，一抗（Claudin-1，1∶400；ZO-1，1∶200），荧光二抗［山羊抗兔IgG H&L（FITC），1∶1000；山羊抗小鼠IgG H&L（Alexa Fluor 555），1∶1000］。

1.3.11 基因本体（GO）和京都基因和基因组数据库（KEGG）富集分析

本研究采用多数据库联合分析策略对HYP分子靶点及CD治疗靶点进行系统性预测与分析。首先，利用SwissTargetPrediction（http：//swisstarg etprediction.ch/）、SuperPred（https：//prediction.charite.de/）、PharmMapper（http：//www.lilab-ecust.cn/pharm mapper/）3大数据库对HYP潜在作用靶点进行预测。其次，通过DisGeNet（http：//disgenet.cn/）、DrugBank Online（https：//go.drugbank.com/）、Therapeutic Target Database（https：//db.idrblab.net/ttd/）、PharmGKB（https：//www.pharmgkb.org/）、GeneCards（https：//www.genecards.org/）5大数据库获取CD相关治疗靶点。将上述预测靶点取并集，采用DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）进行GO和KEGG富集分析，以预测HYP的相关生物学功能和治疗CD潜在的作用机制。

1.3.12 Western blotting

分别收集各组小鼠肠黏膜组织及Caco-2细胞样本，加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液进行充分裂解。4 ℃条件下12 000×g离心15 min后，收集上清液。采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，调整为等量蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分离。随后通过湿转法将蛋白转移至PVDF膜上，使用5%脱脂牛奶室温封闭1 h。加入一抗（Claudin-1，1∶1000；ZO-1，1∶1000；TLR4，1∶1000；MyD88，1∶1000；β-actin，1∶3000）4 ℃孵育过夜，TBST洗涤后加入二抗（HRP标记的山羊抗兔/小鼠IgG，1∶3000）室温孵育1 h，最后使用ECL化学发光试剂进行显影，通过数码凝胶图像处理系统采集并使用Image J分析条带灰度值。

1.4 统计学分析

本研究采用SPSS 26.0软件进行统计分析。计量资料符合正态分布者以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HYP给药可缓解TNBS模型小鼠CD样结肠炎

与WT组相比，TNBS组小鼠出现体质量减轻和便血症状，而HYP治疗可改善TNBS模型小鼠的体质量下降程度并降低DAI评分（P<0.05，图1A、B）。结肠长度显示，与TNBS组相比，HYP组小鼠结肠缩短程度减轻（P<0.05，图1C、D）。HE染色结果表明，HYP治疗可修复肠绒毛和隐窝结构、减少炎性细胞浸润，改善TNBS模型小鼠结肠组织的病理损伤并降低炎症评分（P<0.05，图1E、F）。

2.2 HYP给药降低TNBS模型小鼠结肠黏膜中炎症介质水平

qRT-PCR和ELISA结果显示，与WT组相比，TNBS模型小鼠结肠黏膜组织中促炎因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）的表达水平升高，经HYP干预后促炎因子水平下降（P<0.05，图2）。

2.3 HYP给药改善TNBS模型小鼠肠屏障损伤

与TNBS组相比，HYP干预可提高小鼠结肠组织TEER值（P<0.05，图3A），同时降低肠系膜淋巴结、肝脏和脾脏中的细菌移位率（P<0.05，图3B~D），以及血清中I-FABP和FITC-Dextran浓度（P<0.05，图3E、F）。AB-PAS染色结果表明，HYP干预可增加TNBS模型小鼠结肠组织中杯状细胞数量，促进黏液蛋白表达（P<0.05，图3G、H）。免疫组化染色结果进一步表明，HYP干预可增加TNBS诱导的小鼠结肠组织中MUC2的表达（P<0.05，图3G、I）。免疫荧光染色和Western blotting结果显示，HYP治疗可提高TNBS模型小鼠结肠组织中Claudin-1和ZO-1表达水平（P<0.05，图3J~M）。

2.4 HYP干预降低LPS诱导的Caco-2细胞中炎症介质水平

qRT-PCR和ELISA结果显示，与LPS组相比，HYP处理可降低细胞中促炎因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）释放水平（P<0.05，图4A~F）。

2.5 HYP干预改善LPS诱导的Caco-2细胞屏障损伤

与LPS组相比，HYP干预可提高Caco-2细胞TEER值（P<0.05，图5A）。细胞免疫荧光染色结果显示，在Control组中，Claudin-1和ZO-1均匀分布在Caco-2细胞膜上，LPS刺激后Claudin-1和ZO-1荧光信号减弱、分布紊乱，HYP处理可恢复紧密连接蛋白的表达和分布（P<0.05，图5B）。Western blotting结果表明，与LPS组相比，LPS+HYP组Claudin-1和ZO-1的蛋白水平上调（P<0.05，图5C~E）。

2.6 HYP缓解CD样肠炎可能与炎症反应和TLR信号通路有关

GO和KEGG富集分析结果显示，交集靶点富集于“炎症反应”和“TLR信号通路”，提示HYP可能通过调节TLR信号通路及相关基因表达发挥其抗炎作用，从而对CD有治疗效果（P<0.05，图6A、B）。

2.7 HYP可下调TLR4/MyD88信号通路

在TNBS诱导的小鼠CD样结肠炎模型中，Western blotting结果表明，与WT组相比，TNBS组小鼠结肠黏膜中TLR4和MyD88蛋白水平升高，而HYP干预可下调其表达水平（P<0.05，图7A~C）。在LPS刺激的Caco-2细胞炎症模型中，Western blotting结果表明，HYP处理可降低LPS组Caco-2细胞中TLR4和MyD88蛋白水平（P<0.05，图7D~F）。

3 讨论

本研究的主要结果如下：HYP干预可改善小鼠CD样结肠炎症状；HYP可减轻肠上皮炎症反应和保护肠屏障功能；HYP治疗TNBS模型小鼠结肠炎的作用可能部分通过调控TLR4/MyD88信号通路实现。

本研究采用TNBS诱导的小鼠结肠炎模型，该模型不仅能重现CD患者常见的腹泻、便血及进行性体质量下降等典型症状，还能高度模拟CD患者的关键病理特征，表现为肠壁炎性细胞浸润、溃疡形成和隐窝结构破坏^{［26， 27］}。研究结果显示，HYP可缓解TNBS模型小鼠结肠炎症状，包括体质量和结肠长度增加、DAI评分和组织学炎症评分降低。既往文献报道，吲哚类生物碱HYP在糖尿病大鼠慢性创面模型中表现出显著的抗炎作用，其机制涉及抑制创面局部促炎因子（TNF-α和IL-1β等）促炎因子表达，进而改善炎症微环境并促进创面愈合^［28］。基于这一发现，本研究体内外进一步检测TNF-α、IL-6和IL-1β释放水平，提示HYP可能通过拮抗肠上皮细胞炎症发挥肠道保护作用。

肠屏障是维持肠道稳态的关键防线，由生物屏障、黏液屏障、上皮屏障和免疫屏障共同组成^［29］。其中，肠上皮屏障是肠道物理防御的核心结构，由上皮细胞及其连接结构组成，通过维持结构完整性和高TEER值实现屏障功能^［30］。此外，杯状细胞分泌的MUC2可在肠腔表面形成黏液层，既构成物理性隔离屏障，又通过糖链结合病原体发挥化学屏障作用^{［31， 32］}。在CD病理进程中，肠道大量释放的炎症因子会破坏肠上皮细胞和紧密连接蛋白，导致上皮细胞间通透性升高，促进微生物产物移位入血，进而加重肠道炎症^{［30， 33］}。本研究结果显示HYP提高了屏障关键蛋白（Claudin-1和ZO-1）的水平并降低肠道通透性，提示HYP可能通过改善炎症微环境维持屏障的完整性。然而，其具体作用机制仍有待进一步阐明。

TLR4/MyD88信号通路在CD的发病机制中起关键调控作用^［34-36］。TLR4作为先天免疫系统的重要模式识别受体，通过特异性识别革兰氏阴性菌的LPS触发炎症级联反应，其异常激活可导致促炎因子（如TNF-α、IL-6和IL-1β）的过度释放，从而加剧肠道炎症反应^［37］。MyD88作为TLR4下游的关键信号适配蛋白，通过招募IRAK和TRAF6等信号分子，激活NF-κB和MAPK信号通路，进一步放大炎症反应^{［38， 39］}。基于TLR4/MyD88信号通路在CD中的核心调控作用，我们推测HYP治疗CD的潜在机制可能与该通路的调控密切相关。首先通过KEGG富集分析发现，HYP治疗CD可能与TLR信号通路相关。进一步Western blotting检测结果显示，在TNBS诱导的结肠炎小鼠和LPS诱导的Caco-2细胞模型中，HYP可下调TLR4/MyD88通路关键蛋白水平。

本研究的价值在于揭示HYP通过减轻肠上皮炎症反应并保护肠屏障功能的作用，不仅为缓解CD患者结肠炎提供新的治疗思路和潜在靶点，同时也为开发基于天然药物单体的CD治疗策略提供重要的理论依据。

本研究存在以下局限性：除保护肠屏障功能外，HYP可能还通过其他途径缓解CD样结肠炎。尽管本研究证实HYP对CD的治疗效果与TLR4/MyD88通路相关，然而其是否通过下调该通路来减轻肠上皮炎症反应及增强肠屏障功能仍需进一步验证。

综上所述，HYP可能通过拮抗肠上皮炎症反应并保护肠道屏障功能，进而缓解小鼠CD样结肠炎。

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基金资助

国家级大学生创新创业训练计划项目(202310367057)

安徽省卫生健康委科研项目(AHWJ2024Aa40007)

安徽省卫生健康委科研项目(AHWJ2024Aa10051)

安徽省临床医学研究转化专项(202427b10020093)

安徽省临床医学研究转化专项(202427b10020094)

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