参芪泄浊饮通过调控Rap1/MAPK/FoxO3a信号通路改善氧化应激及炎症反应延缓大鼠肾纤维化

Shenqi Xiezhuo Decoction alleviates renal fibrosis in rats by ameliorating oxidative stress and inflammation through the Rap1/MAPK/FoxO3a signaling pathway

摘要

目的 明确参芪泄浊饮（SQXZD）的化学成分，并结合网络药理学及实验阐明SQXZD延缓大鼠肾纤维化的作用机制。 方法 通过Q Exactive高分辨液质联用系统（UPLC-Q Exactive/MS）鉴定SQXZD化学成分。基于SQXZD化学成分构建SQXZD延缓肾纤维化的成分-疾病靶点网络，并进行富集分析以筛选关键通路与作用靶标。将49只SPF级雄性SD大鼠随机分成空白组，假手术组，模型组，氯沙坦组（4.6 mg·kg^-1·d^-1）及SQXZD低、中、高剂量组（9.7、19.4、38.8 g·kg^-1·d^-1）。除空白组及假手术组，其他组大鼠均以单侧输尿管结扎法复制肾纤维化模型。造模成功并连续灌胃14 d后取材，HE染色观察术侧肾组织病理变化，Masson染色观察术侧肾组织胶原沉积面积，全自动生化分析仪检测血清BUN、Cr水平，ELISA法检测血清SOD、MDA、GSH-px、IL-6、TNF‑α水平；Western blotting及qRT-PCR检测各组大鼠术侧肾组织α-SMA、Col-Ⅰ、NAKED2、Rap1、B-raf、Raf-1、MEK3/6、p38MAPK、MEK、ERK1/2、p-ERK1/2、FoxO3a、p-FoxO3a及MnSOD表达及mRNA转录水平。 结果 从SQXZD中鉴定出263种化学成分；网络药理学获得SQXZD成分和肾纤维化疾病交集靶点170个，分析显示SQXZD延缓肾纤维化可能与MAPK、Rap1、FoxO等通路相关。动物实验显示，与假手术组比较，模型组大鼠术侧肾组织结构异常、纤维化面积扩大；血清BUN、Cr、MDA、IL-6、TNF-α水平升高（P<0.01），SOD及GSH-px水平下降（P<0.01）；术侧肾组织α-SMA、Col-Ⅰ、NAKED2、Rap1、B-raf、MEK、ERK1/2、p-ERK1/2、MEK3/6、p38MAPK表达及其mRNA转录水平上调（P<0.01），Raf-1、FoxO3a、p-FoxO3a及MnSOD表达及其mRNA转录水平下调（P<0.01）。与模型组相比，各给药组大鼠术侧肾组织结构可见不同程度改善、纤维化面积可见不同程度减少；血清BUN、Cr、MDA、IL-6、TNF-α水平下降，SOD及GSH-px水平升高，SQXZD高剂量组及氯沙坦组差异具有统计学意义（P<0.05），SQXZD中剂量组差异具有统计学意义（P<0.01）；术侧肾组织α-SMA、Col-Ⅰ、NAKED2、Rap1、B-raf、MEK、ERK1/2、p-ERK1/2、MEK3/6、p38MAPK表达及其mRNA转录水平下调，Raf-1、FoxO3a、p-FoxO3a及MnSOD表达及其mRNA转录水平上调，SQXZD低、高剂量组及氯沙坦组差异具有统计学意义（P<0.05），SQXZD中剂量组差异具有统计学意义（P<0.01）。 结论 SQXZD可改善肾功能、延缓肾纤维化，其机制可能是调控Rap1/MAPK/FoxO3a信号通路以改善氧化应激及炎症状态。

Abstract

Objective To explore the mechanism of Shenqi Xiezhuo Decoction (SQXZD) for improving renal fibrosis (RF) in rats. Methods The chemical components of SQXZD were identified using UPLC-Q Exactive/MS, and component-disease target network and enrichment analyses were conducted to screen the key pathways and targets. In the animal experiment, 49 male SD rats were randomized equally into blank control group, sham operation group, unilateral ureteral obstruction-induced RF model group, losartan treatment (daily dose 4.6 mg/kg) group, and low-, medium-, and high-dose SQXZD (9.7, 19.4, and 38.8 g/kg, respectively) treatment groups. After 14 days' treatment, renal pathologies and collagen deposition of the rats were examined with HE and Masson staining, and serum levels of BUN, Cr, SOD, MDA, GSH-px, IL-6, and TNF-α were detected. Western blotting and qRT-PCR were used to detect renal protein and mRNA expressions of α‑SMA, Col-I, NAKED2, Rap1, B-raf, Raf-1, MEK3/6, p38MAPK, MEK, ERK1/2, p-ERK1/2, FoxO3a, p-FoxO3a, and MnSOD. Results A total of 263 chemical components were identified in SQXZD. Network pharmacology revealed 170 intersecting targets between the components and RF enriched in the MAPK, Rap1, and FoxO pathways. The rat models of RF showed abnormal renal structural changes, increased fibrosis area, elevated serum BUN, Cr, MDA, IL-6, and TNF-α levels, reduced SOD and GSH-px levels, upregulated renal expressions of α‑SMA, Col-I, NAKED2, Rap1, B-raf, MEK, ERK1/2, p-ERK1/2, MEK3/6, and p38MAPK, and downregulated Raf-1, FoxO3a, p-FoxO3a, and MnSOD expressions. Treatment with losartan and SQXZD (especially at the medium dose) obviously lessened renal pathologies, improved renal functions, alleviated oxidative stress and inflammation, and ameliorated abnormal changes in the Rap1/MAPK/FoxO3a signaling pathway in the rat models. Conclusion SQXZD alleviates RF and improves renal function in rats possibly by ameliorating renal oxidative stress and inflammation via regulating the Rap1/MAPK/FoxO3a signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

参芪泄浊饮 / 肾纤维化 / 氧化应激 / 炎症因子 / Rap1/MAPK/FoxO3a信号通路

Key words

Shenqi Xiezhuo Decoction / renal fibrosis / oxidative stress / inflammatory factors / Rap1/MAPK/FoxO3a signaling pathway

肾纤维化是包括慢性肾衰竭在内的多种慢性肾脏疾病的主要病理改变^［1］，其本质为肾脏慢性持续性损伤后的过度修复，以细胞外基质（ECM）过度及病理性沉积在肾实质为特征，表现为肾小管细胞丢失、成纤维细胞聚集以及肾小管周围微血管网稀疏等^{［2， 3］}，最终导致终末期肾功能衰竭。2021年我国慢性肾脏病发病率为233.57/10万，患者约1.184亿^［4］。成纤维细胞的活化是导致ECM过度沉积的主要原因之一^［5］，该过程与氧化应激（OS）及炎症密切相关^{［6， 7］}。OS是由于体内氧化与抗氧化的失衡，表现为氧化物的大量堆积^［8］。活性氧（ROS）的大量堆积可介导多个途径导致OS，包括纤维细胞或巨噬细胞的聚集、成纤维细胞到肌成纤维细胞的转化、内皮-间充质过渡及肾小管上皮细胞上皮间质转化（EMT）^［6］，并释放促炎因子进一步加剧OS^{［9， 10］}。除ROS介导的炎症外，肌酐、尿素氮等毒素在体内的大量蓄积亦可导致慢性肾脏病患者体内促炎因子呈高水平状态^［11］，可诱导或加剧OS以加速肾纤维化进程^［7］。因此，干预OS及炎症是延缓肾纤维化进展的重要方向。

现代医学对肾纤维化暂无有效治疗手段，中药复方在延缓肾纤维化进展方面具有较大优势。参芪泄浊饮为课题组治疗慢性肾衰竭的经验方，前期实验已证实该方可调节MCP-1等炎症相关因子以延缓大鼠肾纤维化^［12］，但中药复方成分复杂，具有多靶点、多途径发挥疗效的特点，尚需进一步探讨其调控OS及炎症途径的机制。因此，本研究采用UPLC-Q Exactive/MS技术分析参芪泄浊饮化学成分、网络药理学预测参芪泄浊饮延缓肾纤维化的可能信号通路，测定肾纤维化大鼠体内OS及炎症相关标志物水平，并对富集程度较强的OS及炎症相关信号通路加以验证，以期为该方减轻OS及炎症以延缓肾纤维化提供依据。

1 材料和方法

1.1 数据库

通用蛋白质数据库（UniProt）^［13］（网址：https：//www.uniprot.org/）、在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM）^［14］（网址：https：//omim.org）、GeneCards数据库^［15］（网址：https：//www.genecards.org）、DISGENET数据库^［16］（网址：https：//www.disgenet.com）、STRING数据库^［17］ （网址：https：//cn.string-db.org/）、功能注释生物信息学分析数据库（DAVID）^［18］（网址：https：//david.ncifcrf.gov/）。

1.2 实验试剂、仪器及动物

1.2.1 药品及试剂

参芪泄浊饮小包装中药饮片（黄芪30 g、太子参15 g、熟地黄15 g、佩兰10 g、山茱萸10 g、茯苓15 g、牡丹皮12 g、丹参10 g、大黄9 g、姜半夏10 g、炒白术15 g、陈皮15 g、藿香10 g、山药10 g、砂仁10 g、菟丝子10 g）由安徽普仁药业有限公司提供，购于辽宁中医药大学附属医院中草药局，所有饮片均经我院中草药局冷玉杰主任药师鉴定为正品，符合2020版《中国药典》标准。

氯沙坦钾片［（50 mg/片），Organon Pharma（UK）Limited］；甲醇［色谱纯，Thermo Fisher（China）Limited］；甲酸（色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；NAKED2抗体（Affinity）；α‑SMA抗体、Collagen Ⅰ抗体、Rap1抗体、B-raf抗体、Raf-1抗体、MEK抗体、MEK3/6抗体、p38MAPK抗体、ERK1/2抗体、p-ERK1/2抗体、FoxO3a抗体、p-FoxO3a抗体、MnSOD抗体（bioworld）；免染PAGE凝胶快速制备试剂盒（上海雅酶）；PVDF膜（0.45 μm）（Solarbio）；β-actin抗体、强效RIPA裂解液、50×Cocktail蛋白酶抑制剂、PMSF（100 mmol/L）、磷酸化蛋白酶抑制剂、BCA蛋白定量检测试剂盒、5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、Prestained Protein Marker Ⅶ（8~195 000）、RNA提取液、RNA溶解液、SweScript All-in-One RT SuperMix for qPCR（One-Step gDNA Remover）、2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix、总超氧化物歧化酶（T-SOD）检测试剂盒、丙二醛（MDA）检测试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-px）检测试剂盒、Rat TNF-alpha ELISA Kit、Rat IL-6 ELISA Kit（Servicebio）。

1.2.2 实验仪器

色谱仪，Q Exactive高分辨质谱仪［Thermo Fisher（China）Limited］；酶标仪（Rayto）；电子天平（千分之一）（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；全自动生化分析仪（深圳雷杜生命科技）；低温离心机（湖南湘仪）；石蜡切片机（Leica）；垂直电泳仪、转印电泳仪、化学发光仪（Servicebio）；移液器（Eppendorf）。

1.2.3 实验动物

49只SPF级雄性SD大鼠，6~8周龄，体质量210±10 g，购于辽宁长生生物股份有限公司［SCXK（辽）2020-0001］，饲养于辽宁中医药大学SPF级动物中心［SYXK（辽）2024-0006］。本研究经实验动物伦理委员会批准（伦理批号：21000062024148），严格遵循3R原则操作。

1.3 方法

1.3.1 参芪泄浊饮药液的制备

参照《中药汤剂煎煮技术规范》，中药煎煮方法如下：将1剂参芪泄浊饮组方药物除大黄、砂仁、广藿香及佩兰外全部生药以10倍量水浸泡1 h。浸泡后武火加热至沸腾后文火慢煎30 min至预定量，28 min时将砂仁捣碎后继续文火煎煮2 min后滤过。再以8倍量水煮沸后文火煎煮30 min至预定量，25 min时下入大黄、广藿香及佩兰继续文火煎煮5 min后滤过。合并2次滤液并浓缩至含1.94 g/mL生药的药液，分装后-20 ℃保存。

1.3.2 UPLC-Q Exactive/MS测定参芪泄浊饮的化学成分

将1.3.1制备的药液混匀后取200 µL，加入800 µL甲醇，涡旋混匀10 min，13 000 r/min离心10 min，取上清上机分析。

1.3.2.1　色谱条件

Thermo Fisher Scientific AQ-C18色谱柱（150×2.1 mm，1.8 µm，Welch），水相为0.1%甲酸/水溶液，有机相为甲醇。体积流量0.3 mL/min；柱温35 ℃，进样量5 µL。具体色谱梯度（表1）。

1.3.2.2　质谱条件

ESI离子源，正负离子切换扫描下检测，检测方式为Full mass/dd-MS2；质量扫描范围100~1500；电喷雾电压±3.2 kV；碰撞气为高纯氩气，鞘气为氮气，40 Arb；辅助气为氮气，15 Arb，加热温度350 ℃；毛细管温度300 ℃；数据采集时间30 min。使用Compound Discoverer 3.3软件完成数据初步整理后与mzCloud数据库检索比对。

1.3.3 参芪泄浊饮活性成分相关靶点的筛选

将1.3.2中获得的活性成分导入SwissADME数据库，纳入分析的活性成分需满足下列条件：胃肠道吸收值为“high”，类药性5个指标中为“YES”的数量≥2^［19］。将筛选后的活性成分导入Swiss Target Prediction数据库^［20］，设置物种为“Homo Sapiens”预测靶点并保存所有Probability>0的靶点数据，UniProt数据库标准化、去除重复后建立靶点数据库。

1.3.4 肾纤维化相关靶点的获取

在OMIM、Genecards、DisGeNet数据库中以“renal fibrosis”“kidney fibrosis”为关键词检索、整理后得到疾病靶点，Venny 2.1在线制作网站获取药物及疾病的交集靶点并保存。

1.3.5 参芪泄浊饮活性成分-靶点网络的构建

运用Cytoscape3.10.2软件构建“参芪泄浊饮活性成分-靶点”关系网络，依托软件内置工具Network Analyzer计算出参芪泄浊饮中有效活性成分的网络拓扑参数，并根据Degree值从大到小筛选出参芪泄浊饮延缓肾纤维化的关键靶点。

1.3.6 交集靶点的功能和通路富集分析

将1.3.4获得的交集基因集上传至DAVID数据库，以“homo sapiens”为研究物种进行GO功能和KEGG通路富集分析并可视化处理。

1.3.7 动物分组及给药

将49只雄性SD大鼠随机分为空白组、假手术组、模型组、氯沙坦组（4.6 mg·kg^-1·d^-1）及参芪泄浊饮低、中、高剂量（9.7、19.4、38.8 g·kg^-1·d^-1）组，7只/组。各给药组的药量均经药物等效剂量换算，于造模术后24 h开始给药（1 mL/100 g），连续给药14 d。空白组及假手术组予以灌胃等体积纯净水。

1.3.8 大鼠肾纤维化模型复制

参照文献［21］，采用单侧输尿管结扎法（UUO）复制大鼠肾纤维化模型，具体操作如下：适应性喂养7 d后，模型组及各给药组大鼠行UUO手术。术前禁食12 h，自由饮水。大鼠称重后40 mg/kg腹腔注射1%戊巴比妥钠，麻醉满意后备皮左下腹，消毒后逐层剪开皮肤层、肌肉层以打开腹腔，分离左侧输尿管后4-0缝合线双栓结扎而不剪断。假手术组仅开腹游离左侧输尿管而不行结扎及剪断操作。操作结束后逐层关腹并消毒创口。术中、术后室温控制在24~25 ℃，术后分笼观察喂饲1 d后进入药物干预阶段。造模后，共获取有效模型大鼠35只。

1.3.9 血清肾功能测定

取材前日禁食12 h，自由饮水。次日1%戊巴比妥钠麻醉大鼠后剪开腹部，穿刺腹主动脉取血，常温静置10~15 min，4 ℃离心机预冷，3000 r/min离心15 min，移液器吸出血清后装于EP管中，全自动生化分析仪测定各组大鼠血尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）水平。

1.3.10 血清SOD、MDA、GSH-px、IL-6、TNF-α测定

将1.3.9中的大鼠血清行ELISA检测准备，并复温所需试剂盒，严格按照试剂盒说明书操作，标准品孔加100 μL标准品，其余检测孔加等量各组待检测样品。10 min内，在酶标仪上以空白对照孔调零后测各孔A_{450 nm}，绘制标准曲线，依照标曲公式计算各孔血清超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-px）、白细胞介素-6（IL-6）及肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平。

1.3.11 术侧肾组织病理学观察

各组大鼠取血后取术侧肾脏，剥去肾脏表面被膜并纵向剖开，生理盐水冲洗后1/2肾脏置于4%多聚甲醛中固定，经脱水、石蜡包埋、切片、HE及Masson染色、封片等步骤，于显微镜下观察肾脏病理变化及胶原分布情况。剩余1/2肾脏置于EP管、液氮速冻后-80 ℃冰箱保存。

1.3.12 Western blotting检测

取各组大鼠剩余1/2术侧肾脏，加入强效RIPA裂解液以提取蛋白，BCA法测定浓度。调节各样本总蛋白至等浓度，经电泳、转膜后，分别加入一抗α-SMA、Col-Ⅰ、NAKED2、Rap1、B-raf、Raf-1、MEK3/6、p38MAPK、MEK、ERK1/2、p- ERK1/2、FoxO3a、p-FoxO3a及MnSOD（稀释比均为1∶1000），4 ℃孵育过夜，加入二抗（1∶1000），孵育1.5 h后显影。以β-actin为内参，Image J软件计算蛋白相对表达量。

1.3.13 qRT-PCR检测

称取各组大鼠20 mg术侧肾组织，Trizol提取总RNA，根据试剂盒说明书进行逆转录反应，2^-ΔΔCt法分析qRT-PCR数据。引物由武汉赛维尔生物科技有限公司合成（表2）。PCR扩增程序如下：95 ℃，30 s使其预变性；95 ℃、15 s使其变性，60 ℃、30 s退火。如此循环40次，荧光定量PCR仪完成扩增；65 ℃→95 ℃，每升温0.5 ℃，采集1次荧光信号。

1.4 统计学分析

采用SPSS 30.0软件进行数据统计分析，计量数据以均数±标准差表示，符合正态分布者组间比较采用单因素方差分析或t检验，不符合正态分布则采用非参数检验法。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 参芪泄浊饮药液成分鉴定

采用UPLC-Q Exactive/MS对参芪泄浊饮药液样品进行分析，总离子流图（图1）。质谱信息经与mzCloud数据库比对，从参芪泄浊饮药液样品中鉴定出263个化学成分。

2.2 网络药理学分析

2.2.1 组方药物、疾病靶点及共同靶点的筛选

将2.1中活性成分及疾病导入相关数据库并去重后，共得到1283个药物靶点及819个疾病靶点，取交集后得到170个共同靶点（图2）。

2.2.2 PPI网络构建及核心靶点分析

采用Cytoscape软件构建“成分-靶点-疾病”网络图（图3）；构建参芪泄浊饮延缓肾纤维化靶点的PPI网络图（图4）。

2.2.3 GO分析

经交集基因分析，共识别出925条显著富集的通路，其中BP相关661条，CC相关85条，MF相关179条。选取各方面前10条通路绘制条形图（图5）。其中BP方面，主要包括细胞迁移的正向调控、细胞群增殖的正向调控、表皮生长因子受体信号通路、胰岛素样生长因子受体信号通路及基因表达的正向调控等；CC方面，主要涉及质膜、受体复合物、焦点粘连、胞质溶胶、细胞质等；MF方面，主要包括蛋白酪氨酸激酶活性、酶结合、ATP结合、组蛋白H3Y41激酶活性、组蛋白H2AXY142激酶活性等。

2.2.4 KEGG分析

通过DAVID数据库进行KEGG富集分析，得到164条KEGG通路，选取前20条信号通路绘制气泡图（图6）。

2.3 动物实验验证

2.3.1 参芪泄浊饮对UUO大鼠血清BUN、Cr的影响

与空白组比较，假手术组大鼠BUN及Cr水平轻度升高，差异无统计学意义（P>0.05）；与假手术组比较，模型组大鼠BUN及Cr水平升高（P<0.01）。与模型组比较，各给药组大鼠BUN及Cr水平下降，参芪泄浊饮高剂量组及氯沙坦组差异具有统计学意义（P<0.05），参芪泄浊饮中剂量组差异具有统计学意义（P<0.01，表3）。

2.3.2 参芪泄浊饮对UUO大鼠术侧肾组织形态的影响

2.3.2.1　HE染色

空白组与假手术组大鼠术侧肾组织结构清晰，球、管形态正常，细胞排列整齐；与假手术组比较，模型组及各给药组大鼠术侧肾组织形态异常，表现为结构松散，肾小管腔体扩大，肾小管上皮细胞可见脱落现象及肾纤维化，偶见肾小球轻度硬化。与模型组比较，各给药组大鼠术侧肾组织结构异常程度有所改善，肾小管腔体仅轻微扩张，纤维组织增生亦有所减轻（图7）。

2.3.2.2　Masson染色

空白组与假手术组大鼠术侧肾组织内未见明显蓝色胶原纤维沉积，假手术组大鼠术侧肾组织局部偶见蓝染区域。与假手术组比较，模型组及各给药组大鼠术侧肾组织内可见蓝色胶原纤维沉积，其中模型组可见大量蓝色胶原纤维沉积。与模型组比较，各给药组大鼠术侧肾组织内蓝色胶原纤维沉积减少（图8）。

2.3.3 参芪泄浊饮对UUO大鼠血清SOD、MDA、GSH-px、IL-6、TNF-α的影响

与空白组比较，假手术组大鼠MDA、IL-6、TNF-α、SOD、GSH-px水平差异无统计学意义（P>0.05）；与假手术组比较，模型组大鼠MDA、IL-6、TNF-α水平升高，SOD、GSH-px水平下降（P<0.01）。与模型组比较，各给药组MDA、IL-6、TNF-α水平下降，SOD、GSH-px水平升高，其中参芪泄浊饮低剂量组、高剂量组、氯沙坦组SOD与GSH-px的差异以及参芪泄浊饮高剂量组、氯沙坦组MDA、IL-6、TNF-α的差异具有统计学意义（P<0.05），参芪泄浊饮中剂量组各指标差异具有统计学意义（P<0.01，表4、5）。

2.3.4 参芪泄浊饮对UUO大鼠术侧肾组织α-SMA、Col-Ⅰ、NAKED2表达的影响

与空白组比较，假手术组α‑SMA、Col‑Ⅰ、NAKED2表达差异无统计学意义（P>0.05）；与假手术组比较，模型组α-SMA、Col-Ⅰ、NAKED2表达上调（P<0.01）。与模型组比较，各给药组α-SMA、Col-Ⅰ、NAKED2表达下调（P<0.05），参芪泄浊饮中剂量组差异具有统计学意义（P<0.01，图9）。

2.3.5 参芪泄浊饮对UUO大鼠术侧肾组织α-SMA、Col1a1、NAKED2 mRNA转录水平的影响

与空白组比较，假手术组α-SMA、Col1a1、NAKED2 mRNA转录水平差异无统计学意义（P>0.05）；与假手术组比较，模型组α-SMA、Col1a1、NAKED2 mRNA转录水平升高（P<0.01）。与模型组比较，各给药组α-SMA、Col1a1、NAKED2 mRNA转录水平下降（P<0.05），参芪泄浊饮中剂量组差异具有统计学意义（P<0.01，图10）。

2.3.6 参芪泄浊饮对UUO大鼠术侧肾组织Rap1、B-raf、Raf-1、MEK3/6、p38MAPK、MEK、ERK1/2、p-ERK1/2、FoxO3a、p-FoxO3a及MnSOD表达的影响

与假手术组比较，模型组Rap1、B-raf、MEK、ERK1/2、p-ERK1/2、MEK3/6、p38MAPK表达上调，Raf-1、FoxO3a、p-FoxO3a及MnSOD表达下调（P<0.01）。与模型组比较，各给药组Rap1、B-raf、MEK、ERK1/2、p-ERK1/2、MEK3/6、p38MAPK表达下调，Raf-1、FoxO3a、p-FoxO3a及MnSOD表达上调（P<0.05），参芪泄浊饮中剂量组差异具有统计学意义（P<0.01，图11）。

2.3.7 参芪泄浊饮对UUO大鼠术侧肾组织Rap1、B-raf、Raf-1、MEK3、p38MAPK、MEK、ERK、FoxO3a及MnSOD mRNA转录水平的影响

与假手术组比较，模型组Rap1、B-raf、MEK、ERK、MEK3、p38MAPK mRNA转录水平上调，Raf-1、FoxO3a及MnSOD mRNA转录水平下调（P<0.01）。与模型组比较，各给药组Rap1、B-raf、MEK、ERK、MEK3、p38MAPK mRNA转录水平下调，Raf-1、FoxO3a及MnSOD mRNA转录水平上调（P<0.05），参芪泄浊饮中剂量组差异具有统计学意义（P<0.01，图12）。

3 讨论

肾纤维化可归为“肾络癥瘕”范畴^［22］，该病以“虚气流滞、肾络瘀阻”为基本病机，自拟参芪泄浊饮以遵“补益脾肾、化瘀通络、化湿解毒”之法。方中重用黄芪，辅以太子参、熟地黄、白术、山药、山茱萸、菟丝子达补益之效；大黄、丹参、牡丹皮化瘀通络，茯苓、姜半夏、陈皮、藿香、佩兰、砂仁共用以芳香化湿解毒。诸药合用，共奏“补益、通络、化浊”之功。本研究基于UPLC-Q Exactive/MS技术，从参芪泄浊饮水煎液中鉴定出263个化学成分，结合网络药理学“成分-靶点-疾病”PPI网络图，参芪泄浊饮延缓肾纤维化的核心成分包括6-姜酚、（5S，6S）-5-羟基-4-甲氧基-6-（2-苯乙基）-5，6-二氢-2H-吡喃-2-酮、小檗碱等，作用于GABRG2、GABRB3、CDK2、CA2、CYP19A1等169个潜在靶点，并介导MAPK、HIF-1、TNF、Rap1、FoxO等OS及炎症相关信号通路。6-姜酚具有正性肌力、抗炎和抗氧化等重要作用^［23］，可显著下调α-SMA及Col-Ⅰ表达以延缓肾纤维化进展^［24］。（5S，6S）-5-羟基-4-甲氧基-6-（2-苯乙基）-5，6-二氢-2H-吡喃-2-酮为阿江榄仁的主要成分之一，具有良好的抗氧化活性^［25］。小檗碱为大黄的成分之一，可显著改善不同肾纤维化动物模型的肾功能、下调OS标志物水平及α-SMA表达以延缓肾纤维化^［26］。

GABRG2、GABRB3均属GABA_A受体家族，敲除GABRG2基因可上调肾组织内MMP3表达、介导组织内OS及DNA损伤从而加速肾纤维化进展^{［27， 28］}，且课题组前期实验证实参芪泄浊饮可调控MMP3表达延缓肾纤维化^［12］；敲除内皮GABRB3可导致组织内血管密度下降及血流异常^［29］，介导血管内皮损伤而加速肾纤维化进展^［30］。CDK2在肝纤维化动物模型中呈高表达状态，药物干预后可下调CDK2表达，进而抑制α-SMA表达以延缓肝纤维化进展^［31］。CA2可在肾小管上皮细胞中表达，抑制该靶点可促进内皮NO释放、改善血管内OS以提高血流量^{［32，33］}。CYP19A1的低表达可激活TGFBR3/Smad2/3通路、介导炎症及EMT过程，上调α-SMA表达^［34］。

MAPK通路在真核生物体中存在ERK、p38及JNK3条分支，均以MKKK-MKK-MAPK的顺序依次激活^［35］。ERK分支在肾纤维化动物模型及人类中呈激活状态^{［36， 37］}，细胞外生长因子可激活Ras、磷酸化Raf，进一步磷酸化MEK1、激活ERK1/2^{［35， 38］}，抑制该途径可改善肾纤维化^［39］；炎症刺激后p38被磷酸化而激活并入核^{［40， 41］}以调控核内转录因子、促进炎症因子释放以参与肾纤维化进程^{［42， 43］}。Rap1属于Ras小G蛋白家族^［44］，受到GEFs及GAPs的双向调控，二者的动态平衡决定了Rap1及Ras活性以调控MAPK通路的ERK及p38分支^［45］；亦可调节线粒体ROS代谢以调控OS^［46］。FoxO3a与OS密切相关^［47］，其表达受到ERK及p38的调控，并进一步调控MnSOD表达抑制OS以延缓肾纤维化^{［47， 48］}。TNF通路及HIF-1通路与炎症途径密切相关^{［49， 50］}。因此，参芪泄浊饮延缓肾纤维化与OS及炎症途径关系密切。

成纤维细胞、上皮细胞等多种细胞活化后增殖并分泌大量ECM沉积在肾间质导致肾纤维化^{［51， 52］}，增殖过程中表达α-SMA^［1］及NAKED2^［53］，伴随Ⅰ、Ⅲ两型胶原蛋白在肾间质的显著沉积^{［54， 55］}，导致肾功能受损。课题组前期实验已证实参芪泄浊饮可下调Col-Ⅲ表达以延缓肾纤维化^［12］。本研究采用UUO法^［21］复制肾纤维化大鼠模型，术后24 h予参芪泄浊饮水煎液干预2周并检测相关指标，实验结果表明模型组大鼠BUN、Cr明显升高，提示肾功能受损；Masson染色显示模型组大鼠术侧肾组织中可见大量胶原沉积，Western blotting结果显示术侧肾组织α-SMA、Col-Ⅰ、NAKED2表达上调，提示大鼠术侧肾脏纤维化相关蛋白沉积；药物干预后大鼠肾功能改善、胶原沉积面积减少、相关纤维化蛋白表达下调，表明参芪泄浊饮对UUO大鼠肾纤维化有延缓作用。

肾纤维化与OS和炎症密切相关^{［6， 7］}。炎症可诱导或加剧OS以响应信号通路激活^［7］导致ROS大量堆积，ROS的蓄积亦引起促炎因子的释放，二者互为因果，OS与炎症相互促进而加重肾脏损伤^{［9， 10］}。SOD、GSH-px及MDA与体内ROS代谢关系密切，其中SOD可减少体内超氧阴离子水平，是抗氧化的首道防线^{［8， 56］}；GSH-px合成于肾脏，临床试验证实慢性肾脏病患者体内GSH-px水平下降^［57］，无法催化过氧化氢还原为水以实现抗氧化作用^［58］；MDA水平与OS程度密切相关^［59］。IL-6、TNF-α与肾纤维化进展密切相关^{［60， 61］}。故本研究检测了大鼠血清中SOD、MDA、GSH-px、IL-6、TNF-α水平，结果表明参芪泄浊饮可提高血清SOD、GSH-px水平，下调MDA水平，减少TNF-α及IL-6生成，提示参芪泄浊饮可提高UUO大鼠抗氧化能力以减轻OS并下调体内炎症因子水平，这可能是参芪泄浊饮延缓UUO大鼠肾纤维化的机制。

为进一步探究参芪泄浊饮对网络药理学富集程度较高的OS及炎症相关信号通路的调控机制，本研究检测了各组大鼠术侧肾组织Rap1、B-raf、Raf-1、MEK3/6、p38MAPK、MEK、ERK1/2、p-ERK1/2、FoxO3a、p-FoxO3a及MnSOD表达，结果显示参芪泄浊饮可下调Rap1、B-raf、MEK、ERK1/2、p-ERK1/2、MEK3/6及p38MAPK表达，上调Raf-1、FoxO3a、p-FoxO3a及MnSOD表达，表明参芪泄浊饮延缓肾纤维化的机制可能是通过调控Rap1/MAPK/FoxO3a信号通路以改善肾脏内OS及炎症水平实现的。有研究表明，激活Rap1可降低白细胞的迁移以减轻炎症反应以延缓肾纤维化进展^{［62， 63］}；调控MAPK通路的ERK分支及p38分支可抑制肾小管EMT以延缓肾纤维化进展^［64］；调控FoxO3a通路可上调MnSOD表达，提高组织内SOD水平以提高抗氧化能力^［65］，与本研究结果一致。在FoxO3a的调控方面，本研究结果表明，药物干预后p-FoxO3a蛋白表达上调，与研究^［65］一致；但亦有研究结果表明，在MAPK信号通路不同分支对FoxO3a的调控过程中，ERK分支可直接磷酸化FoxO3a，导致p-FoxO3a表达上调、FoxO3a表达下调而促纤维化，药物干预后可下调组织内p-FoxO3a表达以延缓或干预纤维化进程^{［66， 67］}。究其原因，可能为同一通路内不同分支的激活程度不同，根据本次实验结果，推测p38分支对p-FoxO3a的调控水平或较ERK分支更为显著。此外，Rap1受到GEFs及GAPs的双向调控^［45］以调控ERK分支及p38分支；由于GEFs及GAPs存在不同水平的平衡状态，Rap1的表达水平亦可能有不同，故Rap1通过MAPK通路对FoxO3a的调控亦存在双向可能，课题组未来会深入探索，并结合后续实验加以验证。

综上所述，本研究选用UUO模型模拟人体肾纤维化，观察参芪泄浊饮对UUO大鼠肾功能及肾纤维化的改善作用，并结合UPLC-Q Exactive/MS与网络药理学探讨其潜在作用机制，结果表明参芪泄浊饮可改善UUO大鼠肾功能，减轻OS及炎症反应以延缓肾纤维化，其作用机制可能与调控Rap1/MAPK/FoxO3a信号通路相关。后续将通过进一步实验探讨其深层次作用靶点、不同分支之间的动态调控机制，以及对筛选出的关键成分及靶点进行深入研究，为临床新药开发提供实验依据。

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