茯苓新酸A通过调节AMPK/mTOR介导的自噬来减轻葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠结肠炎

Poricoic acid A alleviates dextran sulfate sodium-induced colitis in mice by regulating AMPK/mTOR-mediated autophagy and inhibiting intestinal epithelial cell apoptosis

摘要

目的 探讨茯苓新酸A（PAA）调控肠上皮细胞自噬对葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的小鼠结肠炎的作用和机制。 方法 18只C57BL/6小鼠随机分为对照组（WT组）、DSS模型组（DSS组）及PAA干预组（10 mg/kg），6只/组，评估小鼠体质量、结肠长度、疾病活动指数（DAI）及组织病理学评分等变化；构建DSS诱导的Caco-2细胞损伤模型，检测肠屏障蛋白（ZO-1、Claudin-1）、凋亡相关蛋白（Bcl-2/Bax/C-caspase3）及自噬标志物（LC3-II/I、P62）表达。通过分子对接和Western blotting分析PAA的作用机制。 结果 PAA显著改善DSS小鼠的体质量下降（P<0.05）、结肠缩短（P<0.05）及DAI评分升高（P<0.05），并降低结肠组织中促炎因子IL-1β和TNF-α水平（P<0.05）。此外，HE染色显示PAA缓解结肠隐窝损伤，降低炎症细胞浸润和炎症评分（P<0.05），AB-PAS染色显示PAA干预小鼠肠黏膜杯状细胞数量显著高于DSS组。PAA抑制了DSS诱导的紧密连接蛋白（ZO-1和Claudin-1）表达降低（P<0.05）和肠上皮细胞凋亡（降低Bax、C-caspase3，上调Bcl-2，P<0.05）。进一步分析发现，PAA可显著激活肠上皮细胞自噬水平（LC3-II/I比值升高，P62水平降低，P<0.05）。机制研究表明，PAA可通过靶向调控AMPK/mTOR信号，激活自噬并抑制肠上皮细胞凋亡。 结论 PAA通过AMPK/mTOR介导的自噬激活与肠上皮细胞凋亡途径，保护肠屏障功能和改善DSS诱导的小鼠结肠炎。

Abstract

Objective To investigate the mechanism of poricoic acid A (PAA) for alleviating dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice. Methods Eighteen C57BL/6 mice were randomly divided into control group, DSS-induced colitis model group, and PAA intervention (10 mg/kg) group. The changes in body weight, colon length, disease activity index (DAI), and histopathological scores of the mice were evaluated. In a DSS-induced Caco-2 cell model, the changes in expressions of ZO-1, claudin-1, Bcl-2, Bax, cleaved caspase-3, LC3-II/I, and P62 were detected. Molecular docking and Western blotting were used to analyze the mechanisms underlying the ameliorating effect of PAA on DSS-induced colitis. Results In the mouse models of DSS-induced colitis, PAA significantly ameliorated DSS-induced weight loss, colon shortening, and elevation of DAI scores while reducing colonic IL-1β and TNF-α levels. HE staining showed that PAA obviously alleviated colonic crypt damage, reduced inflammatory cell infiltration, and lowered histopathological scores of the colon. AB-PAS staining revealed significantly increased goblet cell counts in PAA-treated mice compared to those in DSS group. In DSS-induced Caco-2 cells, PAA treatment effectively inhibited DSS-induced downregulation of the tight junction proteins, reduced Bax and cleaved caspase-3 expressions, increased Bcl-2 expression and the LC3-II/I ratio, and decreased P62 expression. Mechanistic study suggested that PAA targeted the AMPK/mTOR pathway to activate autophagy and suppress cell apoptosis. Conclusion PAA protects intestinal barrier function and alleviates DSS-induced colitis in mice by activating AMPK/mTOR-mediated autophagy and inhibiting intestinal epithelial cell apoptosis.

Graphical abstract

关键词

炎症性肠炎 / 茯苓新酸A / 自噬 / 凋亡 / 肠屏障

Key words

inflammatory bowel disease / poricoic acid A / autophagy / apoptosis / intestinal barrier

炎症性肠病（IBD）是一种以慢性肠道炎症和屏障破坏为特征的疾病，其发病与肠上皮细胞自噬功能受损和凋亡过度密切相关^［1-3］。大量研究表明，肠上皮细胞的命运很大程度上取决于自噬与凋亡之间的精细平衡，自噬与凋亡的失衡是导致肠屏障功能障碍的关键环节^［4-6］。临床数据显示，超过80%的IBD患者表现腹痛、血便及体质量下降等症状。反复的炎症发作不仅造成肠道功能持续恶化，还带来沉重的身心与经济负担^{［7， 8］}。此外，约30%的患者对现有生物制剂应答不佳^［9］，因此亟待探索针对上皮细胞稳态的新型治疗策略。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）作为细胞能量稳态的核心调控因子，可通过抑制mTOR促进保护性自噬，并抑制Caspase-3介导的过度凋亡，已成为IBD潜在治疗靶点^［10-12］。茯苓作为“健脾渗湿药”，早在《神农本草经》中已有记载其在防治肠道疾病方面的显著疗效。现代研究表明，含茯苓的复方（如参苓白术散）可通过调节Th17/Treg平衡缓解实验性结肠炎^［13］。其活性成分茯苓新酸A（PAA）作为一种三萜类成分，在多种模型中显示出抗炎^［14］和自噬调控^［15］等活性。值得注意的是，PAA在肾纤维化和糖尿病模型中均能激活AMPK通路^{［16， 17］}，提示其具有跨疾病通路的调控潜力。然而，PAA能否直接调控肠上皮细胞自噬-凋亡平衡（如影响LC3-II）尚不明确，且现有研究多集中于复方^［18］，而PAA单独作用机制仍有待阐明。基于以上背景，本研究提出PAA可能通过AMPK/mTOR通路协调自噬与凋亡，从而改善IBD肠屏障功能。本研究的创新性在于：首次在IBD模型中验证PAA对自噬和凋亡的双向调控作用；综合运用体内外模型阐明其机制，为靶向AMPK/mTOR通路治疗IBD提供新依据。

1 材料和方法

1.1 材料

18只SPF级C57BL/6雄性小鼠（6~8周龄，体质量20~25 g，江苏集萃药康生物科技股份有限公司）；Caco-2细胞（中国医学科学院肿瘤细胞库）；茯苓新酸（分析标准品，纯度≥98%，上海陶术科技有限公司）；DSS（Dextran sulfate sodium，DSS，MW 36~50 000，MP Biomedicals）；AB-PAS染色试剂盒（Solarbio）；酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（武汉博士德生物工程公司）；抗ZO-1抗体、抗Claudin-1抗体 （Invitrogen）；抗Bcl-2抗体、抗Bax抗体、抗LC3B抗体、抗P62抗体、抗p-mTOR抗体（Proteintech）；抗C-caspase3抗体（abbkine）；抗AMPK抗体、抗p-AMPK抗体、TUNEL细胞凋亡检测试剂（Servicebio）；抗mTOR抗体、山羊抗兔IgGH&L（AlexaFlour®555）抗体、山羊抗兔IgGH&L（FITC）、山羊抗小鼠IgGH&L（FITC）（Abcam）；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔/小鼠IgG（中杉金桥）；快速制胶试剂盒（雅酶）；BCA蛋白试剂盒（碧云天）；SBI-0206965（MCE）。

1.2 方法

1.2.1 DSS诱导动物模型建立及分组

将18只C57BL/6雄性小鼠随机分为对照组（WT）、DSS模型组（DSS）及PAA干预组（PAA），6只/组。对照组：自由饮水+每日灌胃含0.1% DMSO的生理盐水（100 μL）；DSS组：自由饮用2.5% DSS从第1天至第7天，第8天更换回正常饮用水，直至第11天，灌胃干预同对照组。PAA组：DSS处理同模型组+每日灌胃10 mg/kg PAA（溶解于含0.1% DMSO的生理盐水，100 μL）。第11天处死小鼠，取小鼠结肠组织，所有结肠组织都进行长度测量。测量后将结肠沿中轴线抛开，一半保存于-80 ℃用作分子生物学检测，另外一半放置在福尔马林中浸泡用于组织病理学检测。本实验经蚌埠医科大学伦理委员会批准（伦理批号：伦动科批字〔2024〕第369号）。

1.2.2 Caco-2细胞培养及分组处理

采用MEM完全培养基（组成为：20%热灭活胎牛血清，1%抗生素混合液）培养Caco-2单层细胞，培养环境严格控制在37 ℃恒温、5% CO₂平衡气体及饱和湿度条件下。每48 h更换新鲜培养基。当细胞融合度达70%~80%时，弃旧培养基，PBS清洗后加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化5 min，加入含血清培养基终止消化，离心（1000 r/min，5 min）收集细胞并重悬为单细胞悬液，以1∶3比例传代培养。将细胞随机分为3组（n=3重复/组），Control组：正常培养基培养24 h；C-DSS组：加入含2% DSS的培养基处理24 h^［19］；C-PAA组：2% DSS与20 μmol/L PAA^［15］共处理24 h；C-PAA+SBI组：C-PAA组的基础上加入5 μmol/L的SBI-0206965^［20］。

1.2.3 小鼠体质量、结肠长度及疾病活动度的评估

每日记录小鼠体质量变化、粪便形状及便血程度，根据既往报道计算肠炎的疾病活动度指数（DAI）评分标准评估肠炎症状^［21］。取检当天测量并记录小鼠直肠近肛门处到回盲部的结肠长度。

1.2.4 AB-PAS染色以及HE染色评估小鼠结肠组织病理变化

将小鼠结肠组织塑形为瑞士卷式结构，经梯度脱水处理后进行石蜡浸渍包埋，最终制备成组织学分析用蜡块^［22］。随后使用石蜡切片机将蜡块制成厚度为3 μm的石蜡切片。AB-PAS染色：将石蜡切片依次浸入二甲苯脱蜡，梯度乙醇（100%、95%、80%）水化至纯水。然后将切片浸入1%过碘酸溶液8 min，避光条件下用Schiff试剂染色20 min，复染苏木精1 min后，经梯度乙醇脱水，最后用中性树脂进行封片。HE染色：将石蜡切片依次浸入二甲苯脱蜡，梯度乙醇（100%、95%、80%）水化至纯水。切片浸入苏木精染液8 min，用1%分化液化2 s，流水冲洗后以氨水返蓝，以及浸入伊红染液2 min，再经梯度乙醇脱水（80%、95%、100%）组织透明化处理采用梯度二甲苯渗透方案，封固使用环氧树脂包埋剂。基于全自动数字切片扫描系统获取高分辨率影像数据，运用图像分析软件定量评估黏膜损伤指数，执行双盲法组织学评分。评分标准^［23］如下：根据组织病理学改变的程度，该评分标准将病变严重程度分为0至4分，具体描述如下：0分：组织未见炎症反应，也无隐窝结构损伤。1分：表现为基底层中约三分之一隐窝出现损伤，黏膜层可见少量炎症细胞浸润。2分：基底层约三分之二的隐窝受损，黏膜下层可见中等量炎症细胞浸润。3分：隐窝缺失严重，大量炎症细胞浸润并穿透肠道壁全层。4分：隐窝结构完全消失，肠绒毛结构出现严重紊乱。

1.2.5 ELISA检测小鼠结肠组织炎症因子的表达情况

将保存于-80 ℃冰箱中的结肠组织取出后，需预先在配制的裂解液中加入磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂，随后按照每100 mg组织对应1 mL RIPA裂解液的比例进行裂解处理。结肠组织经机械均质化处理后，于12 000 r/min条件下离心10 min获取上清液。依照ELISA试剂盒标准化流程，采用酶标仪测定450 nm波长处吸光度值，通过标准化校准曲线计算促炎细胞因子白细胞介素-1β（IL-1β）与肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的蛋白浓度。

1.2.6 免疫荧光检测PAA对肠屏障的保护以及自噬蛋白的表达

石蜡切片经梯度脱蜡复水处理后，采用热诱导抗原修复技术进行表位暴露。经去离子水漂洗后，以5%牛血清白蛋白（BSA）封闭非特异性结合位点60 min，分别孵育特异性一抗［紧密连接蛋白ZO-1（1∶200）、Claudin-1（1∶400）、自噬标志物LC3B（1∶500）］于4℃湿盒内过夜。次日复温后，应用磷酸盐缓冲液（PBS）行三次循环洗涤（5 min/次），继而避光条件下孵育荧光标记二抗［FITC标记山羊抗兔IgG（1∶1000）、Alexa Fluor®555标记山羊抗小鼠IgG（1∶1000）］120 min。核染色采用DAPI（1 μg/ mL）孵育8 min，PBS清洗后以抗淬灭封片剂固载样本，最终通过Leica倒置荧光显微镜进行多通道图像采集。Caco-2细胞样本依次完成4%多聚甲醛固定（30 min）、0.2% Triton X-100膜通透（15 min）及5% BSA封闭（30 min）预处理流程，后续染色步骤同结肠组织。

1.2.7 TUNEL染色观察PAA对肠上皮细胞凋亡的改善作用

石蜡切片和固定后的Caco-2细胞按照依据TUNEL细胞凋亡检测试剂盒标准化流程执行染色实验，染色终止后使用抗荧光淬灭封片剂固载样本，采用Leica倒置荧光显微镜多视野随机捕获图像。每组通过双盲法选取6张代表性图像，应用ImageJ图像分析系统进行半定量评估，细胞凋亡指数（细胞凋亡率（%）=（凋亡细胞数/总细胞数）×100%）。

1.2.8 Western blotting检测紧密连接蛋白、凋亡相关蛋白、自噬蛋白以及通路蛋白的表达水平

使用RIPA裂解液（含磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂）对小鼠结肠黏膜组织与Caco-2细胞进行裂解。裂解后的细胞悬液于4 ℃条件下以12 000 r/min离心10 min，最终收集含有总蛋白的上清液。采用BCA法对总蛋白浓度进行定量分析，随后与蛋白上样缓冲液按比例混合，调整至1×终浓度体系，经100 ℃沸水浴热变性处理10 min制备成变性蛋白样品。使用快速制胶盒配制凝胶，于200 V电泳30 min，蛋白经转膜转移至PVDF膜上，再使用5%的脱脂牛奶封闭1 h，与一抗（ZO-1，1∶1000；Claudin-1，1∶1000；Bcl-2，1∶1000；Bax，1∶2000；C-caspase3，1∶1000；p62，1∶1000；LC3II/I，1∶1000； p-AMPK，1∶500；AMPK，1∶500；p-mTOR，1∶500；mTOR，1∶1000；β-actin，1∶3000）进行孵育。4 ℃过夜后使用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔/小鼠IgG（1∶3000）孵育，最后经底物显色并采集图片。

1.2.9 分子对接

通过PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）检索目标生物活性成分的二维化学结构（SDF格式）作为对接配体，同时从PDB数据库（https：//www.rcsb.org/）获取靶标蛋白的高分辨率晶体结构作为受体。基于CB-Dock2分子对接平台的自动化流程，对配体-受体复合物进行结合构象预测及结合自由能（ΔG）计算^［24］。

1.2.10 统计学分析

利用软件SPSS26.0对以上实验数据进行分析统计，计量资料以均数±标准差表示，组间差异比较采用单因素方差分析或t检验，以P<0.05时认为差异具有统计学意义。本研究动物实验样本量通过预实验确定。基于预实验中DSS组与对照组结肠长度差异（2.0±0.4 cm，Cohen's d=5.0），通过G*Power软件（α=0.05， Power=80%）计算得出最小样本量为5只/组。最终设定6只/组以提升统计稳定性并参考同类研究。实验完成后，我们进一步对如结肠长度进行事后检验效能分析，结肠长度方面（DSS组 vs PAA组）实际差异：1.0 cm（DSS组 6.6±0.294 vs PAA组7.6±0.298），效应量Cohen's d=3.38（合并SD=0.296），检验效能：>99.9%（α=0.05，双样本t检验）上述样本量设计与同类研究样本量的选取保持一致。

2 结果

2.1 PAA干预缓解DSS诱导的小鼠结肠炎症状

DSS干预显著诱发结肠炎特征性病理改变：与对照组相比，模型组小鼠自干预第4天起出现体质量下降（P<0.05，图1A），同时DAI）持续升高（P<0.05，图1B）。PAA干预缓解了体质量下降趋势（P<0.05），并有效抑制DAI评分的升高（P<0.05）。解剖学结果显示，DSS模型组结肠长度较对照组明显缩短（P<0.05），而PAA组结肠长度较模型组恢复（P<0.05，图1C、D）。

2.2 PAA干预缓解了DSS诱导的肠道炎症

ELISA检测结果显示：与对照组相比，DSS组结肠组织中IL-1β和TNF-α浓度升高（P<0.05）；而PAA组这两种炎症因子水平较DSS组降低（P<0.05，图2A、B）。AB-PAS染色分析表明：DSS组结肠杯状细胞数量较对照组减少，酸性黏液蛋白分泌明显下降，中性黏液蛋白分泌则异常增多；经PAA治疗后，杯状细胞数量及酸性黏液蛋白分泌均恢复，同时中性黏液蛋白分泌量明显减少（图2C）。HE染色显示，DSS组小鼠结肠组织呈现肠绒毛结构紊乱、隐窝严重损伤及大量炎症细胞浸润（图2D），其组织病理学评分高于对照组（P<0.05，图2E）；而PAA干预后结肠黏膜结构损伤改善，炎症细胞浸润减少，病理学评分明显下降（P<0.05）。

2.3 PAA干预缓解了DSS诱导的肠屏障的损伤

免疫荧光染色结果表明，DSS组中ZO-1及Claudin-1的细胞膜表达连续性中断，并出现异常胞内聚集（图3A），而这两种蛋白在PAA组的结肠组织中细胞膜定位特征得到了恢复。Western blotting定量检测证实，DSS组ZO-1、Claudin-1蛋白表达量较对照组下降（P<0.05），而PAA治疗组两种蛋白表达量较DSS组均上调（P<0.05，图3B、C）。

2.4 PAA抑制DSS刺激的小鼠肠道细胞凋亡

TUNEL实验结果显示：DSS组小鼠结肠组织中肠上皮细胞凋亡率较对照组增加（P<0.05），而PAA干预后降低（P<0.05，图4A、B）。Western blotting定量分析进一步显示，DSS组促凋亡蛋白Bax和C-caspase3的表达量高于对照组，同时抗凋亡蛋白Bcl-2表达量下降；PAA干预逆转了这些变化，表现为Bax和C-caspase3表达水平降低，同时Bcl-2表达量回升（P<0.05，图4C、D）。

2.5 PAA增强了DSS小鼠肠上皮细胞的自噬

免疫荧光分析显示，与对照组相比，DSS组小鼠肠道细胞中LC3B自噬蛋白的荧光强度降低；而PAA干预后LC3B荧光强度较DSS组增强，表明自噬信号被重新激活（图5A）。Western blotting结果进一步验证：DSS组自噬标志物LC3-II/LC3-I比值下降（P<0.05），同时自噬底物P62蛋白表达水平升高（P<0.05，图5B、C、D）；经PAA治疗后，LC3-II/LC3-I比值较DSS组回升（P<0.05），而P62蛋白表达量同步降低（P<0.05）。

2.6 PAA促进了DSS诱导Caco-2细胞的自噬

免疫荧光分析显示，与C-DSS组相比，C-PAA组肠道细胞中自噬蛋白LC3B的荧光信号增强（图6A）。Western blotting检测表明，与对照组相比，C-DSS组LC3-II/LC3-I比值降低（P<0.05），P62蛋白水平升高（P<0.05）；经PAA干预后，LC3-II/LC3-I比值较C-DSS组回升（P<0.05），同时P62蛋白水平下降（P<0.05，图6B、C）。

2.7 PAA抑制DSS诱导Caco-2的细胞凋亡

TUNEL染色显示，与C-DSS组相比，C-PAA组Caco-2细胞的凋亡比例降低（P<0.05，图7A、B）。Western blotting检测显示，DSS刺激升高Caco-2细胞促凋亡蛋白（C-caspase3和Bax）表达水平和降低了Bcl-2的表达（P<0.05），而PAA干预逆转了这些蛋白的水平（与C-DSS组相比，P<0.05，图7C、D）。

2.8 PAA恢复DSS诱导的Caco-2细胞紧密连接损伤并上调ZO-1及Claudin-1的膜定位与表达

免疫荧光分析结果表明，DSS处理可破坏Caco-2细胞紧密连接结构，表现为ZO-1和Claudin-1的膜定位连续性中断；而PAA干预后，两种蛋白的膜分布特征恢复（图8A）。通过Western blotting定量分析显示，与对照组相比，C-DSS组ZO-1和Claudin-1蛋白表达水平下降（P<0.05）；PAA干预后，ZO-1和Claudin-1的表达量较C-DSS组回升（P<0.05，图8B、C）。

2.9 PAA可能靶向AMPK/mTOR通路调控自噬-凋亡平衡改善结肠炎

分子对接分析显示，PAA与AMPK活性口袋形成稳定结合（结合自由能ΔG=-7.9 kcal/mol；图9A）。Western blotting结果表明，DSS干预抑制AMPK磷酸化（P<0.05），并激活其下游mTOR信号（P<0.05）；经PAA干预后，p-AMPK表达量回升（P<0.05），p-mTOR表达量下降（P<0.05，图9B、C）。

2.10 PAA通过调控AMPK/mTOR信号通路改善肠上皮细胞损伤

在Caco-2细胞模型中同样验证了该通路的变化：C-DSS组较对照组AMPK磷酸化水平降低（P<0.05），同时激活下游p-mTOR信号（P<0.05，图10A、B）。经PAA干预后，AMPK磷酸化水平较模型组升高（P<0.05），而p-mTOR表达量降低（P<0.05）。

2.11 PAA通过激活AMPK/mTOR通路来调节Caco-2细胞的自噬与凋亡

免疫荧光染色分析显示，经SBI-0206965处理后的C-PAA组细胞，其LC3B蛋白荧光强度表达降低（图11A）。Western blotting分析进一步表明，该抑制剂处理导致自噬相关指标发生变化：LC3-II/LC3-I比值降低（P<0.05），同时P62蛋白表达升高（P<0.05，图11B、C）。此外，SBI-0206965的加入还逆转了PAA的抗凋亡作用，TUNEL染色发现C-PAA+SBI组细胞凋亡数量增多（P<0.05，图11D、E），促凋亡蛋白（C-caspase3和Bax）表达上调，而抗凋亡蛋白Bcl-2表达则降低（P<0.05，图11F、G）。

3 讨论

本研究首次证实茯苓新酸A（PAA）对葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的肠炎具有显著缓解作用。动物模型研究表明，PAA治疗可有效改善DSS小鼠的病理表型，具体表现为：体质量下降趋势逆转、结肠长度缩短缓解，以及DAI）评分下降。组织病理学评估进一步揭示，PAA通过三重机制改善肠黏膜完整性：重建隐窝-绒毛结构；上调紧密连接蛋白表达；促进杯状细胞再生。这些发现共同提示，PAA可能通过多靶点协同作用干预肠炎病理进程。

促炎因子IL-1β和TNF-α的过度释放被证实是DSS诱导肠炎的核心特征^［25］。本研究显示，DSS刺激显著升高结肠组织中IL-1β和TNF-α水平，而PAA干预后其表达显著降低，这一发现与Zhang^［26］团队报道的茯苓三萜类成分可通过抑制PI3K/AKT通路抑制炎症的机制形成功能互补。值得注意的是，TNF-α不仅驱动炎症反应，还可通过破坏紧密连接蛋白ZO-1的膜定位，加剧肠屏障通透性^［27］。本研究发现，PAA可能通过调控促炎因子表达介导其肠屏障修复效应。肠屏障功能障碍可直接导致肠黏膜通透性增加，导致肠道内有害物质（如细菌毒素）渗入黏膜下层，进一步引发炎症扩散和组织损伤^［28］。DSS处理可诱导Caco-2细胞紧密连接蛋白ZO-1和Claudin-1的膜定位紊乱及表达下调，而PAA干预通过维持两种关键蛋白的膜分布稳定性，有效保护肠上皮屏障结构完整性。上述结果证实PAA通过"炎症抑制-屏障加固"的双轨策略实现肠黏膜保护，这种多维度作用模式与肠屏障"损伤-修复"动态平衡理论高度吻合。

肠上皮细胞凋亡失衡是肠炎病理损伤的关键环节^［29］。本研究显示，体内外DSS刺激显著上调促凋亡蛋白Bax和C-caspase3的表达，同时下调抗凋亡蛋白Bcl-2，导致肠上皮细胞凋亡率升高，经PAA处理的DSS诱导小鼠结肠上皮细胞及Caco-2细胞中，抗凋亡蛋白Bcl-2表达上调，促凋亡蛋白Bax和C-caspase3表达下降，凋亡率显著降低。上述结果证实PAA通过抑制肠上皮细胞凋亡保护肠屏障功能，为治疗IBD提供了新方向。Zhao等^［31］在肾纤维化模型中发现PAA抑制肾细胞凋亡^［30］，与本研究在肠炎模型中发现PAA抑制肠道细胞凋亡一致。自噬作为细胞存活的重要调控机制，可通过清除受损细胞器及错误折叠蛋白抑制凋亡信号。LC3B和P62是自噬进行的关键标志物^［32］：LC3-II/I比值的升高反映了细胞自噬的进行；P62蛋白的减少指示自噬底物降解，二者联合分析可准确评估自噬活性动态^［33］。本研究中，DSS干预导致自噬标志物LC3-II/I比值下降及P62堆积，表明自噬流受阻；而PAA干预显著恢复自噬活性（LC3-II/I升高、P62降解），从而抑制凋亡，该结果与Hany团队提出的“自噬-凋亡交互调控”理论相契合^［34］，与本研究结果一致。上述证据表明，PAA通过激活保护性自噬，有效减少了DSS诱导的肠炎模型中肠道细胞的凋亡。

为进一步解析自噬激活的分子基础，本研究聚焦于AMPK/mTOR这一经典调控通路^［35］。Liu等^［36］在糖尿病肾病模型中发现，AMPK活化通过抑制mTOR信号促进自噬并抑制凋亡，提示该通路在多器官保护中的普适性。分子对接结果显示，PAA与AMPK激酶结构域的结合能达-7.9 kcal/mol，提示其可能作为变构激活剂发挥作用。Western blotting证实，PAA处理显著激活AMPK磷酸化并抑制mTOR信号。这一发现与Liu团队在糖尿病肾病模型中的研究形成机制呼应^［36］，共同揭示了AMPK/mTOR通路在跨器官保护中的枢纽地位。从功能层面，AMPK激活可解除mTOR对自噬起始复合体（ULK1）的抑制作用，促进自噬体形成并加速底物降解。该结果不仅验证了AMPK/mTOR通路的核心调控作用，也为阐释PAA的多器官保护效应提供了统一理论框架^［15-17］。为验证PAA是否通过AMPK/mTOR通路介导其保护作用，我们采用AMPK特异性抑制剂SBI-0206965进行干预。结果显示，抑制AMPK信号显著逆转了PAA对自噬的激活（LC3-II/I比值降低、P62积累）及其抗凋亡作用（Bcl-2下降，Bax与C-caspase3上升）（图11）。这表明PAA的保护作用依赖于AMPK通路激活，与既往在肾纤维化和糖尿病模型中的研究一致^{［16， 17］}，进一步支持AMPK/mTOR通路在PAA调控肠上皮细胞自噬-凋亡平衡中的核心机制。

本研究首次将传统中药“健脾渗湿”理论与AMPK/mTOR介导的自噬调控机制相关联，为茯苓的药效物质基础研究提供了新视角。相较于现有生物制剂（如抗TNF-α单抗），PAA作为天然三萜类化合物展现出独特优势：低毒性特征；多靶点协同作用（同时调控炎症、凋亡和自噬通路）；通过宿主细胞稳态重建实现持久疗效。这些特性使其在开发新型IBD治疗药物方面具有重要潜力。

尽管取得创新性发现，本研究仍存在三方面局限：其一，动物实验采用固定剂量（10 mg/kg），缺乏剂量梯度与时效关系研究；其二，机制研究集中于AMPK/mTOR轴，尚未阐明其与NF-κB、NLRP3等已知炎症通路的交互作用；其三，未考察PAA对肠道菌群-宿主互作的影响，而菌群代谢物（如短链脂肪酸）可能参与自噬调控^［37］。后续研究可结合类器官共培养模型与空间多组学技术，系统解析PAA的"免疫-代谢-微生物"多维调控网络。

综上所述，本研究构建了PAA缓解DSS诱导肠炎的完整机制链条：通过激活AMPK/mTOR通路增强自噬活性→清除受损细胞器并抑制Caspase级联反应→降低肠上皮细胞凋亡率→修复紧密连接蛋白网络→重建肠屏障功能。这一“自噬调控-凋亡抑制-屏障修复”的三联机制，不仅深化了对茯苓活性成分药理作用的认识，也为开发基于宿主细胞稳态调控的IBD治疗策略提供了理论依据。后续需开展药代动力学研究及临床前安全性评估，加速PAA的转化应用进程。

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