党参-茯苓配伍调控ERα/PI3K/Akt信号通路改善单侧颈总动脉永久结扎痴呆大鼠的认知障碍

Radix codonopsis combined with Poria improves cognitive impairment in rats with unilateral common carotid artery ligation by regulating the ERα/PI3K/Akt signaling pathway

摘要

目的 基于UPLC-Q-TOF-MS/MS分析研究党参-茯苓配伍（CRP）治疗痴呆症的作用机制。 方法 采用于UPLC-Q-TOF-MS/MS分析单侧颈总动脉永久结扎（UCCA）模型大鼠的 CRP 的入血入脑成分，并对入血和入脑成分进行网络药理学分析。CRP灌胃UCCA 大鼠干预1个月后通过Morris水迷宫评价其学习记忆能力；苏木精-伊红染色观察海马和皮质的病理形态学变化；NeuN染色分析海马和皮层神经元数量变化；采用代谢组学分析 CRP 治疗UCCA大鼠前后脑内代谢物变化差异；酶联免疫吸附测定（ELISA）检测脑内谷氨酸和γ-氨基丁酸（GABA）的含量；免疫组化法考察雌激素受体α（ERα）的蛋白表达；Western blotting分析p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt的蛋白表达。 结果 在UCCA大鼠的脑组织和血液中分别鉴定出125种和126种成分，其中，脑组织中发现了89种党参成分和 36 种茯苓成分，血液中发现了85种党参成分和41种茯苓成分。网络药理学分析表明，CRP治疗痴呆主要与调节进入脑组织的成分所影响的PI3K/Akt等信号通路有关。与假手术组比较，模型大鼠的第5天的逃避潜伏期明显延长（P<0.01），平台象限活动时间、海马和皮质的神经元明显损伤且NeuN平均光密度明显下降（P<0.05）；脑内谷氨酸和GABA/谷氨酸含量明显升高（P<0.05），ERα、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表达下调（P<0.05）。与模型组比较，CRP干预大鼠的第5天的逃避潜伏期明显缩短（P<0.01），穿越平台次数、平台象限活动时间均明显增加（P<0.05），海马和皮质的神经元损伤好转且NeuN平均光密度明显升高（P<0.05）；代谢组学分析表明CRP治疗作用主要富集于雌激素信号通路和 GABA 能突触等信号通路。CRP组大鼠脑内的谷氨酸和GABA/谷氨酸含量明显降低（P<0.05），ERα、p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白表达上调（P<0.05）。 结论 CRP 能够改善UCCA痴呆大鼠的学习和记忆缺陷，这与其对脑内ERα/PI3K/Akt信号通路的调节有关。

Abstract

Objective To investigate the mechanism of Radix codonopsis combined with Poria (CRP) for improving cognitive impairment induced by permanent unilateral common carotid artery ligation (UCCA) in rats. Methods UPLC-Q-TOF-MS/MS and network pharmacology analysis were used to analyze the components of CRP in the blood and brain of rats medicated with CRP. Rat models of UCCA were treated with CRP gavage for 1 month, and Morris water maze, HE staining, and NeuN staining were used to assess the therapeutic efficacy. Metabolomics analysis, ELISA, immunohistochemistry, and Western blotting were employed to explore and validate the therapeutic mechanism of CRP. Results A total of 125 chemical constituents were identified in the brain tissue (89 Radix codonopsis components and 36 Poria components) and 126 in blood samples (85 Radix codonopsis components and 41 Poria components) of medicated rats. Network pharmacology analysis revealed that the therapeutic mechanism of CRP on dementia involved primarily the PI3K/Akt signaling pathway, regulated by the brain-targeting constituents of CRP. In UCCA rats, CRP treatment significantly improved their performance in Morris water maze test, alleviated neuronal damage in the hippocampus and cortex, and increased expression level of NeuN. Metabolomics analysis revealed significant enrichment of the estrogen and GABAergic synapse signaling pathways in CRP-treated rats. CRP obviously reduced the brain levels of glutamate and GABA/glutamate in UCCA rats, and downregulated the proteins expressions of ERα, p-PI3K/PI3K and p-Akt/Akt. Conclusion CRP improves learning and memory impairment in UCCA rats possibly by modulating the ERα/PI3K/Akt signaling pathway in the brain.

Graphical abstract

关键词

党参-茯苓配伍 / 痴呆 / 单侧颈总动脉永久结扎 大鼠 / γ-氨基丁酸 / ERα/PI3K/Akt信号通路

Key words

compatibility of Radix codonopsis and Poria / dementia / permanent unilateral common carotid artery ligation / GABA / ERα/PI3K/Akt signaling pathway

随着经济的持续增长与社会人口结构的显著变迁，老年相关疾病问题日益受到关注。其中，以阿尔茨海默病（AD）为代表的痴呆症已成为严重影响老年人群身体健康与生活质量的重大疾病^［1］。更值得关注的是，痴呆症现有的治疗药物种类稀少、疗效有限且不适用于所有痴呆症类型，故亟需研发更多的治疗药物。中医是最早认识痴呆症相关症状和辨证施治的传统医学，流传了大量的病机病因理论和应用方药。例如七福饮和还少丹加减、归脾汤加减等至今仍被推荐用于AD的肾精亏虚证、脾气虚证等的临床治疗^［2］。同时，在国际临床试验中也可见中药（如Yangxue Qingnao，Ⅱ期）的身影^［3］。基于对中药治疗痴呆症的深入研究，有学者认为中药在新兴技术加持下有望开发成治疗包括AD在内的神经退行性疾病的替代药物^［4］。党参-茯苓配伍（CRP）是课题组前期基于“治呆无奇法，治痰即治呆”理论筛选出的通过调理脾运而治疗痴呆症的核心药对^［5］，然而其作用的物质基础及作用机制仍不完全清楚。代谢组学因其分析生物体代谢情况动态变化的整体性、系统性与中医“整体观”特点相吻合，与中医药的多靶点、多途径的特色相契合，故在中药研究中应用较广泛^［6］。本研究以单侧颈总动脉结扎（UCCA）大鼠为研究载体，通过UPLC-Q-TOF-MS/MS分析CRP的入血和入脑成分，整合网络药理学和代谢组学等方法进一步探讨CRP的抗痴呆症物质基础及作用机制，为“治呆无奇法，治痰即治呆”理论的应用提供研究证据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠（体质量180~220 g）购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司（许可证编号：SCXK（湘）2019-0004）。所有动物均饲养于重庆市中药研究院实验动物研究所的实验动物房内，均可自由摄取食物和水，温度控制在（25±2）℃，湿度控制在（60 ±5）%，并保持12 h光照/黑暗循环。所有实验均获得重庆市中药研究院动物福利伦理审查委员会审查批准（伦理批号：YHS2021-03）。

1.2 药品与试剂

前期分析《部颁标准》收录的方药发现CRP绝大部分按1∶1的比例使用，其制备方法与前期研究相同^［5］。异氟烷（山东安特牧业科技有限公司）；多奈哌齐（卫材［中国］药业有限公司）；谷氨酸、γ-氨基丁酸（GABA）含量检测试剂盒、ECL发光液（Solarbio）；BCA 蛋白含量检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）；PVDF膜（Millipore）；高效RIPA组织/细胞裂解液、抗-NeuN抗体、抗-GAPDH抗体、抗-ERα抗体（Servicebio）；抗-p-PI3K抗体、抗-PI3K抗体、抗-p-Akt抗体和抗-Akt抗体（武汉爱博泰克生物科技有限公司）；脱脂奶粉、十二烷基硫酸钠（SDS）、三羟基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸（BioFROXX）。

1.3 实验仪器

JD5000-2S电子天平（沈阳神宇龙腾天平有限公司）；LC-30AD超高效液相色谱系统（岛津）；Triple TOF 4600高分辨率质谱系统（AB SCIEX）；UPR-Ⅱ-20L超纯水机（四川优普超纯科技有限公司）；Morris水迷宫视频分析系统（安徽正华仪器设备有限公司）；JB-P5型包埋机（武汉俊杰电子有限公司）；RM2016型病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；E100 显微镜（尼康）；KE-5F-3D三维冷冻研磨仪（Servicebio）；R5001E小动物麻醉机、M1324R高速冷冻离心机（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；Read Max 1200型光吸收全波长酶标仪（上海闪谱生物科技公司）；Mini-PROTEAN Tetra system 电泳系统（BIO-RAD）；WD-9423BC型化学发光成像系统（北京六一生物科技公司）。

1.4 动物分组与给药

实验1：复制单侧颈总动脉结扎大鼠模型^［7］，即大鼠依次采用异氟烷麻醉，颈部备皮。从大鼠颈部的正中线处切口，分离左侧颈总动脉并使其完整暴露，结扎其近心端和远心端并从中间剪断，逐层缝合伤口，在伤口处涂抹适量碘伏后将大鼠放回鼠盒。术后恢复2周，根据各大鼠的体质量灌胃CRP（7 g/kg）1次，共15只。

实验2：同上复制单侧颈总动脉结扎大鼠模型，假手术大鼠经历相同的手术但不结扎和剪断颈总动脉血管。术后恢复2周，将造模大鼠根据体质量随机分为模型组（Model）、安理申组（Aricept，1.17 mg/kg）、CRP高剂量组（CRP-H，7 g/kg）、CRP低剂量组（CRP-L，3.5 g/kg），假手术大鼠为对照组（Sham），8只/组。给药组每天根据大鼠体质量灌胃给予相应药物1次（给药体积10 mL/kg），Sham和Model组则给与等体积纯水，连续30 d。

1.5 Morris水迷宫

给药第25~30天采用Morris水迷宫实验对各组大鼠进行行为学检测^［8］。以隐藏平台实验的逃避潜伏期，空间探索实验的平台象限停留时间、穿越平台象限和平均游泳速度为评价指标。

1.6 样品制备

实验1的大鼠灌胃后，在0.5、1、2、4、8 h各处死3只大鼠，腹主动脉取血，心脏灌注后收集脑。血液离心后取血浆样品300 μL，按1∶4（血浆∶冰甲醇）加入冰甲醇进行去蛋白，混合均匀后离心取上清液。称量脑质量，加入5倍量纯水，低温冷冻研磨，4000 r/min离心10 min，取上清300 μL，加4倍冰甲醇进行去蛋白，混匀后离心取上清液。所制得样品均置于液氮中保存备用。

1.7 UPLC-Q-TOF-MS/MS分析

色谱条件：ACE Excel 3 SuperC18色谱柱（100 mm×2.1 mm，3 μm），流动相：A相0.1%甲酸水，B相乙腈；梯度洗脱条件：0~7 min，5%B；7~13 min，5%→25%B；13~17 min，25%→85%B；13~17 min，85%B；17~20 min，85%→5%B。流速0.25 mL/min，柱温30 ℃，进样量5 μL。

质谱条件：采用正、负离子TOF MS2模式对各组样本进行扫描，全扫描范围50~1000 Da；喷雾电压5500 kV，鞘气流量55 arb，辅助气流量55 arb，辅助加热器温度600 ℃，离子化温度600 ℃；碰撞能梯度为25、40、55 eV，数据采集时间20 min。

数据分析：使用Shortcut to PeakView高分辨率质谱数据分析软件对UPLC-Q-TOF-MS/MS采集的数据进行处理。检索CNKI、万方、PubChem、ETCM（http：//www.tcmip.cn/ETCM/）、TCMSP（http：//old.tcmsp-e.com/tcmsp. php）中党参和茯苓化合物的质谱信息以及相关文献，建立CRP化合物质谱数据库，根据所获得化合物的精确相对分子质量信息，对各化合物进行鉴别。筛选正（+H）、负（-H）离子流条件下Mass和Isotope为绿点，Error绝对值≤5 ppm的成分，得到CRP入血或入脑的成分。

1.8 网络药理学分析

根据“1.7”项下分析得到的CRP入血和入脑成分，按照前期方法获取成分靶点和疾病靶点^［5］。运用在线工具jvenn（https：//jvenn.toulouse.inrae.fr/）绘制成分和疾病靶点的交集韦恩图，并利用Cytoscape 3.9.1软件中构建“药物-成分-疾病-靶点”网络、分析并绘制治疗靶点PPI网络、核心靶点网络。最后将CRP治疗痴呆症的关键靶点导入David数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）进行基因本体（GO）功能富集分析与京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，生物种类为“Homo sapiens”。

1.9 苏木精-伊红（HE）染色

水迷宫结束后24 h眼球取血，然后脱颈椎处死大鼠，分取其左半脑并采用4%的多聚甲醛固定，常规HE染色处理后观察海马和皮层区的病理形态学，采集10×和40 ×图片并对损伤的神经细胞评分^［9］。

1.10 代谢组学分析

样品前处理：称取适量脑组织，加入相应体积的组织提取液，低温冷冻研磨60 s（50 Hz，2 次）；超声处理30 min后12 000 r/min离心10 min，取上清干燥；加入200 μL乙腈溶解样品，过滤后适量取滤液用于LC-MS检测。

色谱条件：使用Thermo Vanquish超高效液相仪，ACQUITY UPLC® HSS T3（2.1×100 mm， 1.8 µm）色谱柱对样本进行色谱分离，0.3 mL/min 的流速，柱温40 ℃，进样量2 μL。正离子模式时流动相为0.1%甲酸乙腈（B2）和0.1%甲酸水（A2），梯度洗脱程序为：0~1 min，8% B2；1~8 min，8%~98% B2；8~10 min，98% B2；10~10.1 min，98%~8% B2；10.1~12 min，8% B2。负离子模式时流动相为乙腈（B3）和 5 mM 甲酸铵水（A3），梯度洗脱程序为：0~1 min，8% B3；1~8 min，8%~98% B3；8~10 min，98% B3；10~10.1 min，98%~8% B3；10.1~12 min，8% B3。

质谱条件：使用Thermo Orbitrap Exploris 120质谱仪，在正负离子模式下对各组样本分别进行数据采集。正离子模式采用3.50 kV的喷雾电压，负离子模式采用-2.50 kV的喷雾电压，鞘气40 arb，辅助气10 arb。毛细管温度325 ℃，离子扫描范围100~1000 m/z，碰撞能量30%，动态去除不必要的质谱信息。

1.11 免疫组化分析

按照“1.4.5 HE染色”方法将脑组织切成5 μm薄片后进行脱蜡处理，采用PBS清洗后再将切片浸入5% Triton-X-100室温通透10 min，然后滴加10%山羊血清封闭 30 min。滴 加 抗-NeuN（1∶800）、抗-ERα（1∶500）抗体孵育过夜（4 ℃），PBS洗3次后滴加二抗，37 ℃孵育30 min。使用DAB试剂盒显色后用苏木精染色，PBS清洗后封片，显微镜下观察NeuN、ERα阳性表达并计算平均光密度值。

1.12 Western blotting分析

称取适量包含海马和皮层的脑组织，加入适量裂解液进行低温研磨，离心，收集上清液。BCA法检测蛋白浓度，其余按比例加上样缓冲液、混匀、加热变性后分装待测。采用十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺（PAGE）进行电泳分离、转膜。5%胎牛血清封闭后孵育抗p-PI3K（1∶800）、PI3K（1∶2000）、p-Akt（1∶800）和Akt （1∶6000）过夜（4 ℃）。孵育二抗，然后使用超敏增强型化学发光试剂（ECL）显色，拍照后采用Quantity One分析并计算蛋白相对表达量。

1.13 生化试剂盒分析

根据各试剂盒说明书要求制备脑组织样本匀浆液，依次测量谷氨酸和GABA的含量。

1.14 统计学分析

所有数据采用均数±标准差表示，Morris水迷宫的逃避潜伏期采用双因素方差分析；各组其余数据采用Anderson-Darling分析，如服从正态分布则采用单因素方差分析，不服从正态分布则采用Kruskal-Wallis检测。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CRP在UCCA大鼠的入血成分和入脑成分

通过UPLC-Q-TOF-MS/MS 收集的数据通过快捷方式导入Peakview进行分析。在0.5、1、2、4和8 h分别鉴定出进入血液的化合物共65、58、63、56和72种。去除上述成分中的重复成分，最终获得111种化合物（图1A）。同样，在0.5、1、2、4和8 h分别鉴定出进入脑组织的化合物共66、72、85、59和62种，最终获得124种化合物（图1B）。在血液中鉴定出的111种化学成分中，74种成分来自党参，37种成分来自茯苓；在脑组织中鉴定出的124种成分中，88种成分来自党参，其余成分来自茯苓。此外，既是入血成分又是入脑成分共59个，多为酸类成分（表1）。

2.2 CRP入血和入脑成分的网络药理学分析

从 TCMSP、ETCM 和 PubChem 数据库中筛选获得CRP入血和入脑成分的作用靶点1154个，在 DisGeNET 数据库中筛选出痴呆症疾病靶点665个。通过Venn分析得到153个共有靶点（图 2A）。将交叉靶点导入STRING数据库获取蛋白质相互作用关系，然后将结果导入Cytoscape 3.8.0 软件构建疾病-化合物-靶点网络（图1B）、蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络（图2C），并依据“Degree”、“Betweenness”和“Closeness”的中位值筛选出26个关键靶点（图2D）。同时，将CRP治疗痴呆症的关键靶点上传至 David 数据库进行GO和 KEGG分析。生物过程、细胞成分和分子功能的可视化分析中呈现的元素（图2E）均符合-logp≥5的条件。KEGG富集分析（图2F）表明，CRP治疗痴呆可能与 PI3K-Akt信号通路、细胞衰老、HIF信号通路、神经营养因子信号通路等有关。

2.3 CRP对UCCA大鼠学习记忆能力的影响

在隐藏平台实验中，各组大鼠的逃避潜伏期随着训练时间的延长而缩短［F（4，175）=60.93，P<0.001］，各组间大鼠逃避潜伏期差异也有统计学意义［F（4，175）=4.073，P=0.0035］。与Sham组比较，Model组大鼠的逃避潜伏期从第4天开始显著延长（P<0.01）；与Model组比较，CRP-L大鼠的逃避潜伏期从第4天开始明显短于缩短（P<0.05），CRP-H大鼠第5天的逃避潜伏期也具有统计学差异（P<0.01，表2）。

在空间探索实验中，与Sham组大鼠比较，Model组大鼠的平台象限停留时间、平台穿越次数和平均游泳速度均降低，但仅平台象限停留时间具有统计学差异（P<0.05）。与Model组相比，CRP-L大鼠的平台象限停留时间、平台穿越次数和平均游泳速度均高于Model组，仅平均游泳速度无统计学差异（P>0.05）；CRP-H 大鼠的平台象限停留时间、平台穿越次数和平均游泳速度均高于Model组，但均无统计学意义（P>0.05，表3）。

2.4 CRP对UCCA大鼠海马皮层病理形态学和神经元数量的影响

Sham组大鼠海马神经元排列整齐且紧密，皮质中可见少量变性或坏死细胞（黑色箭头）。Model组大鼠海马细胞散乱（黄色箭头），细胞间空隙大，细胞层变薄（蓝色箭头），皮质可见大量退变或死亡细胞，而CRP-L大鼠的上述损伤相对减轻（图3A）。NeuN染色阳性细胞为黄褐色或棕褐色（图3B），与Sham组大鼠比较，Model组大鼠皮层、海马NeuN⁺阳性细胞数量均显著降低（P<0.01，图3C），且平均光密度也明显降低（P<0.05）；与Model组比较，CRP-L大鼠皮层、海马NeuN⁺阳性细胞数量均明显增加（P<0.05，图3D），而平均光密度显著增加（P<0.001，图3E）。

2.5 CRP对UCCA大鼠脑代谢组学的影响

OPLS-DA得分图可以看出各组间样本距离较近，而Sham和Model、Model和CRP-L组间样本点明显分开（图4A），且置换检验显示模型可靠（图4B）。火山图显示了不同组别间的差异性代谢物，其中，红色代表上调差异性代谢物而蓝色代表下调差异性代谢物（图4C）。差异性代谢物的聚类热图（图4D）显示各组间样本差异性代谢物水平较一致，Sham组和Model组之间不同差异性代谢物的含量明显不同，而CRP-L在不同程度改善上述代谢物的含量改变。如与Sham组比较，Model大鼠脑内的GABA、3-羟基苄醇葡萄糖苷（3-HAG）和奎尼酸 的相对表达量均显著升高（P<0.01）而4，5-二氢乳清酸（4，5-DA）、1-花生四烯酰甘油和L-甲硫氨酸-S-氧化物（LMSO）的相对表达量则均明显降低（P<0.05）；与Model比较，CRP-L大鼠脑内GABA、3-HAG和奎尼酸的相对表达量均明显降低（P<0.01）而4，5-DA、1-花生四烯酰甘油和LMSO的相对表达量则均明显升高（P<0.05，图4E）。差异性代谢物KEGG富集分析（图4F）显示CRP改善Model组大鼠脑内代谢物异常变化主要与雌激素信号通路、GABA能突触等有关。

2.6 CRP对UCCA大鼠脑内GABA、谷氨酸含量的影响

与Sham组比较，Model组大鼠脑内GABA（图5A）、谷氨酸（图5B）含量以及GABA/谷氨酸比率（图5C）均升高，但谷氨酸含量无统计学差异（P>0.05）；与Model组比较，CRP-L大鼠脑内GABA、谷氨酸含量和GABA/谷氨酸比率均降低，其中谷氨酸含量无统计学差异（P>0.05）。

2.7 CRP对UCCA大鼠脑内ERα/PI3K/Akt信号通路的影响

ERα阳性表达为黄褐色或棕褐色（图6A）。与Sham组比较，Model组大鼠脑内ERα的平均光密度显著降低（P<0.001，图6B）；与Model组比较，CRP-L大鼠脑内ERα的平均光密度则显著升高（P<0.001）。Western blotting分析结果显示（图6C），与Sham组比较，Model组大鼠脑内p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt比率明显降低（P<0.05）；与Model组比较，CRP-L大鼠脑内p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt比率明显升高（P<0.05，图6D）。

3 讨论

中药药对是中医临床用药的最小单元，两者合理配伍具有同气相求、相辅相成或相制减毒的作用^［10］，CRP是相须为用调理脾运而治疗痴呆症的核心药对之一^［5］。本研究借助UPLC-Q-TOF-MS分析了CRP的入血和入脑成分，并据此应用网络药理学筛选出CRP治疗痴呆症的核心成分和靶点，通过动物实验研究表明CRP能够明显改善UCCA大鼠的学习记忆能力，以及海马皮层神经细胞病变，这与课题组前期研究结果相似^［5］，再利用代谢组学技术等验证了CRP调控脑内GABA含量差异，及改善ERα/PI3K/Akt信号通路的关键蛋白，揭示了CRP治疗痴呆症的潜在作用机制之一。

药效成分的不确定性是影响网络药理学分析结果准确性的首要因素的^［11］。基于中药血清药物化学^［12］的认识，目前的网络药理学研究已不限于对药物的提取物或制剂成品的成分进行分析，而已深入至入血成分或入靶器官成分^［13-17］。本研究借助UPLC-Q-TOF-MS分析了不同时间点CRP在体内的成分变化，并获得具有现有靶标的入血和入脑成分共62个，这低于直接从药材中筛选出已有靶标的70个成分^［5］，这与Wang等^{［14， 18］}研究中麝香追风止痛膏的透皮成分与麝香追风止痛膏药物成分相比数量减少类似，也提示入血或入靶器官成分更接近或者才是药物实际发挥功用的成分。同时，本研究中GO富集分析和KEGG通路分析各条目数量也低于前期研究结果，这与药物相比于原药材在体内的成分及对应靶标减少有关。此外，前期研究的绝大多数条目如KEGG通路分析的神经活性配体-受体交互作用等仍存在，仅排列顺序改变，而本次研究显示的最优通路包括PI3K/Akt信号通路、细胞衰老等，它们可能CRP的实际发挥作用的优先机制。

结果验证是保障网络药理学研究可靠性的重要手段^［11］。本研究采用代谢组学技术分析得到CRP干预UCCA大鼠的20个差异性代谢物，以及雌激素信号通路、GABA能突触等29条信号通路。网络药理学和代谢组学的KEGG通路进行交集得到雌激素信号通路、神经活性配体-受体交互作用等4条共有通路，佐证了前期研究^［5］验证通路选择的正确性。有意思的是，GABA参与了上述4条通路，而大量研究已证实AD患者以及其模型动物脑内的GABA水平明显升高^{［19， 20］}，且GABA受体和转运体表达增加、谷氨酸/GABA-谷氨酰胺循环、GABA能信号通路失调也在AD及动物模型中被证实^［20-23］。本研究中， UCCA大鼠脑内GABA和谷氨酸含量升高，且GABA/谷氨酸比率失调，而CRP能够逆转上述变化，说明CRP能够干预脑内GABA异常变化。尽管GABA参与雌激素信号通路，但其具体角色并不清楚，仅有研究发现雌激素可上调大鼠视前区GAT-1基因的转录水平，增强GABA的再摄取能力，还可直接作用于表达雌激素受体的GABA神经元，从而改变视前区特定神经网络中抑制性传递的动力学^［24］。本研究中UCCA大鼠脑内ERα表达明显下调而CRP能够上调ERα的表达，这与GABA含量变化不一致，可能与雌激素及其信号并不是GABA含量唯一调节者等有关。此外，雌激素通过雌激素受体（ERs）启动一系列复杂的信号转导通路促进高级认知功能^［25］，其中，PI3K/Akt信号传导是雌激素介导的快速效应的关键下游介质^{［26， 27］}，并参与引起认知障碍的多种病变^［28-30］。而PI3K/Akt信号通路是本研究中网络药理学分析中排名前列的信号通路，且UCCA大鼠脑内p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt明显降低，而CRP干预可明显升高p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt，说明CRP能够调控ERα/PI3K/Akt 信号通路。

中药及复方具有多成分、多靶点、协同作用的特点^［31］。本研究中CRP的入血或入脑成分在体内呈动态变化且数量较多，而网络药理学分析未能兼顾所有成分，比如未纳入文献无报道或数据库未收录的成分。同时，本研究只针对差异性代谢物GABA参与的雌激素信号通路部分靶点进行验证，其余的具有生物活性的差异性代谢物如Xanthurenic acid^［32］、Betaine^{［33， 34］}及其参与相关生物途径等还有待进一步研究。

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基金资助

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