益气解毒方通过调控AKT1/GLUT1信号通路抑制鼻咽癌的恶性进展

Yiqi Jiedu Formula inhibits proliferation, invasion and migration of nasopharyngeal carcinoma cells by inhibiting the AKT1/GLUT1 signaling pathway

摘要

目的 研究AKT1/GLUT1信号通路在益气解毒方抗鼻咽癌中的作用。 方法 采用分子对接技术分析益气解毒方活性成分与AKT1的结合能力，MTT及RTCA法检测细胞增殖能力，划痕愈合实验检测细胞迁移能力，Matrigel侵袭小室法检测细胞侵袭能力，Western blotting法检测蛋白的表达变化。鼻咽癌裸鼠移植瘤模型分为对照组（等体积生理盐水灌胃）、益气组（以15.357 g·kg^-1·d^-1的益气解毒方灌胃）、5-Fu组（腹腔注射8 g·kg^-1·d^-1的5-氟尿嘧啶），10只/组，5-Fu组每2 d腹腔注射1次，其余2组灌胃1次/d，共给药18 d。 结果 与溶剂组比较，益气解毒方组细胞增殖速度、迁移和侵袭能力显著下降（P<0.05），p-AKT、GLUT1、XIAP、N-cadherin及Vimentin表达下调（P<0.05）；与单用益气解毒方组相比，GLUT1或AKT1激活剂与益气解毒方联用组细胞增殖速率提高，迁移和侵袭能力增强（P<0.05），XIAP、N-cadherin及Vimentin表达上调（P<0.05）；在鼻咽癌裸鼠移植瘤模型中，益气解毒方显著抑制肿瘤的生长并下调了肿瘤组织中AKT、p-AKT和GLUT1的表达（P<0.05）。 结论 益气解毒方抑制鼻咽癌细胞增殖、侵袭和迁移的机制与AKT1/GLUT1信号通路有关。

Abstract

Objective To investigate the role of the AKT1/GLUT1 signaling pathway in mediating the inhibitory effect of Yiqi Jiedu Formula (YQJDF) against nasopharyngeal carcinoma (NPC) cells. Methods Molecular docking was employed to analyze the binding affinity between the active components of YQJDF and AKT1. MTT assay, real-time cell analysis (RTCA), wound healing assay and Matrigel invasion chamber assay were used to evaluate the effect of YQJDF extract on proliferation, migration and invasion abilities of human NPC cell lines 5-8F and 6-10B, and the changes in cellular protein expression levels were detected using Western blotting. In a BALB/c nude mouse model bearing NPC cell xenografts, tumor growth were observed following treatment with daily gavage with normal saline or YQJDF extract (15.357 g/kg) for 18 consecutive days or with intraperitoneal injections of 5-Fu every other day. The changes in the expressions of AKT1/GLUT1 signaling axis proteins in the xenografts were examined using Western blotting. Results In the NPC cell lines, treatment with YQJDF extract significantly inhibited cell proliferation, migration, and invasion, and downregulated the expressions of p-AKT, GLUT1, XIAP, N-cadherin, and vimentin. The application of GLUT1 or AKT1 activators partially reversed the inhibitory effects of YQJDF on the NPC cells. In the tumor-bearing mouse models, treatment with YQJDF extract obviously suppressed tumor growth and down-regulated the expression of AKT, p-AKT and GLUT1 in the tumor tissues. Conclusion YQJDF inhibits proliferation, invasion, and migration of NPC cells by inhibiting the AKT1/GLUT1 signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

鼻咽癌 / 益气解毒方 / AKT1/GLUT1 / 侵袭与迁移

Key words

nasopharyngeal carcinoma / Yiqi Jiedu Formula / AKT1/GLUT1 signaling pathway / invasion and migration

鼻咽癌（NPC）是起源于鼻咽上皮的恶性肿瘤，与遗传因素、微生物感染（EB病毒等）、环境、饮食及社会因素密切相关^［1］。尽管目前放化疗能够为鼻咽癌患者带来较长的生存周期，但5%~30%的鼻咽癌患者仍会出现治疗后局部区域或远处复发的情况^［2］。因此，寻找治疗鼻咽癌的有效手段和方法，特别是抗复发和转移是鼻咽癌治疗领域亟待解决的问题。

糖代谢重编程是肿瘤细胞的典型特征之一，其可为肿瘤细胞的快速增殖、侵袭转移及抵抗凋亡提供物质和能量基础^{［3， 4］}。研究表明，鼻咽癌细胞同样存在显著的糖代谢重编程，表现为葡萄糖摄取增加、关键糖酵解酶（如HK2， PKM2）及葡萄糖转运体（如GLUT1）表达上调，且与鼻咽癌的进展、转移和不良预后密切相关^{［5， 6］}。靶向干预糖代谢关键通路已成为抗肿瘤研究的重要策略之一。其中，AKT1/GLUT1信号通路是调控糖代谢重编程的重要信号通路^［7-9］，活化的AKT可通过上调GLUTl的表达、促进其膜移位，调控肿瘤细胞葡萄糖摄取、糖酵解通量及代谢适应性^［10］。

中医认为“气虚染毒”是鼻咽癌的病因病机^［11］，在“气虚”状态下，细胞能量代谢异常，线粒体功能紊乱，ATP生成不足，导致机体抗病能力下降；与此同时，“染毒”过程则伴随炎症因子累积及癌基因激活，进一步诱发肿瘤细胞发生显著的代谢重编程^［12］。因此，“益气解毒”是调控糖代谢重编程，防治鼻咽癌发生发展的重要手段。据此，湖南中医药大学田道法教授根据多年临床经验和研究成果，创立了益气解毒方（YQ），该方由黄连、黄芪、党参、白花蛇舌草、茯苓、天花粉和甘草7味药组成，方中黄芪可补气升阳，益卫固表，利水消肿，托疮生肌为君；党参、黄连、白花蛇舌草能补中益气、清热解毒、活血化瘀为臣；天花粉、茯苓清热生津，清肺润燥，解毒消痈为佐；甘草调和诸药为使，以加强全方补中益气，清热解毒之效。该方在鼻咽癌的临床治疗中效果显著^［13-15］，课题组前期研究发现该方能够抑制鼻咽癌细胞增殖、迁移并诱导凋亡^［16-19］，还可抑制鼻咽癌裸鼠移植瘤的增长^{［15， 20］}。然而，这些研究主要聚焦于细胞表型变化，尚未深入探讨其作用的分子机制，尤其缺乏对益气解毒方调节肿瘤细胞糖代谢重编程相关信号通路的研究。本研究聚焦于糖代谢的核心调控通路-AKT1/GLUT1信号轴，旨在探究其在益气解毒方抑制鼻咽癌增殖、迁移和侵袭中的作用。这是首次从糖代谢的角度研究益气解毒方的作用机制，可为益气解毒方的广泛应用奠定基础，同时为开发靶向AKT1/GLUT1轴的药物提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 细胞和动物

人鼻咽癌细胞株5-8F、6-10B，购自北纳创联生物科技有限公司，由本实验室传代培养。实验动物 BALB/c裸鼠（雄性，6~8周龄，SPF级）购自北京华阜生物科技股份有限公司（合格证号：110322211101571383），本研究通过动物伦理委员会审批（伦理批号：LL2021070703）。

1.2 药物

益气解毒方由黄芪30 g，黄连10 g，党参15 g，茯苓15 g，天花粉10 g，白花蛇舌草10 g，甘草6 g7味药组成，均购自湖南中医药大学第一附属医院，经鉴定为成分纯正的道地药材。按比例称量适量药材，用水提物提取方法进行提取，将药物进行粉碎，过筛，浸泡，加热煮沸，回流提取，并重复进行上述步骤，合并2次提取液，进行减压过滤、浓缩、冷冻、干燥等步骤，密闭分装。

1.3 主要试剂及仪器

RPMI 1640培养基（Cytiva）；胎牛血清（FBS，Gibco）；胰蛋白酶消化液（Solarbio）；Transwell小室（Corning Incorporated）；GLUT1抗体、β-actin抗体（Abcam）；XIAP抗体、PCNA抗体、N-cadherin抗体、Vimentin抗体（CST）；山羊抗鼠、山羊抗兔（LI-COR）；GLUT1激活剂AS1949490、抑制剂BAY876以及AKT1激活剂SC79（MCE）。

主要仪器包括实时无标记细胞分析仪（艾森生物杭州有限公司）；水平摇床（北京六一仪器厂）；高通量细胞检测系统（BioTek）；超低温冰箱（-80 ℃）（中科美菱低温科技有限责任公司）；台式高速冷冻离心机（Beckmancoulter）；多功能荧光成像仪（LI-COR）；倒置显微镜（Motic）；超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.4 MTT检测益气解毒方对鼻咽癌细胞增殖的影响

5-8F和6-10B细胞消化后，制成4×10⁴/mL的细胞悬液，按每孔100 μL加入96孔板，待细胞贴壁后加入不同浓度含药培养基，分组为溶剂对照（Control）组、YQ（0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 g/L）组、顺铂（CIS， 3 μg/mL）组。待药物分别干预细胞24、36、48 h后，去掉原培养液，每孔加入100 μL MTT工作液，置于培养箱孵育3~4 h后，去上清，加入100 μL DMSO溶液，避光摇晃10 min，待蓝紫色结晶完全溶于DMSO中，于全自动酶标分析仪测量吸光度值A_{490 nm}，并计算细胞的相对增殖率。

1.5 分子对接

采用分子对接技术探究益气解毒方活性成分^［20］“槲皮素”、“木犀草素”、“山奈酚”、“柚皮素”与AKT1的相互作用。从PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nLm.nih.gov/）获取槲皮素、木犀草素等4种活性成分的2D结构（SDF格式），经ChemOffice软件（http：//www.downza.cn/）能量优化后转换为3D结构（mol2格式）。基于Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/）确定AKT1蛋白（ID： P31749），从PDB数据库（https：//www.rcsb.org/）下载其晶体结构（PDBID： 1H10），利用PyMOL软件（https：//pymoL.org/2/）移除水分子及杂质后保存。通过AutoDockTools软件（https：//autodock.scripps.cdu）对受体加氢、分配电荷并生成PDBQT格式，利用Grid Box设定结合口袋参数（中心坐标及尺寸）。使用AutoDock Vina配置对接参数（box中心/尺寸、遗传算法），运行对接后提取结合能最低构象，PyMOL可视化结合模式及相互作用。

1.6 实时无标记细胞分析仪监测细胞增殖

在E-plate（RTCA专用培养板）中加入50 μL完全培养液测量基线。消化细胞后，制成4×10⁴/mL的细胞悬液，于每孔加入100 μL细胞悬液，静置约30 min，待细胞沉至培养板底部，开始监测，并在细胞增殖曲线进入平台期之前加入各组含药培养液，细胞在各时间点增长情况以细胞指数（CI）表示。

1.7 创伤愈合实验检测细胞迁移

细胞划痕插件进行灭菌操作后，置于24孔板中，常规消化5-8F、6-10B细胞后收集沉淀，制备单细胞悬液，计数后将悬液加入插件孔内及外周，镜下观察，待细胞贴壁且密度饱和后，取出插件，用PBS轻轻润洗3次，除脱落细胞，再加入不同药物浓度的无血清培养基，每组设3个以上复孔，置于Cytation™5细胞成像多功能检测系统上，调节温度，设计监测程序，间隔12 h进行1次全板自动细胞数量捕获并拍照，监测36 h后结束检测，监测结束后下机，根据采集图像使用Image J软件测量伤痕距离，计算细胞相对迁移率，观察各组细胞迁移情况。细胞相对迁移率=各药物组迁移的宽度/对照组迁移的宽度×100%。

1.8 Martrigle侵袭小室法检测细胞侵袭

提前2 h用基质胶包被基底膜，消化细胞后收集至5 mL EP管，离心，去上清，再用1640基础培养液重悬细胞，约2×10⁵/mL，每孔加入100 μL，于下室加入800 μL含10%胎牛血清的完全培养液，待细胞沉淀后，再加入100 μL 2倍浓度的各组含药培养基（不含胎牛血清），36 h后，去掉培养液，用棉签轻轻擦拭掉未侵袭的细胞，4%多聚甲醛固定5 min，再加入结晶紫染色工作液染色40 min，PBS清洗掉多余的染色液，最后用高通量细胞检测系统进行拍照。

1.9 Western blotting检测蛋白表达水平

一抗GLUT1抗体、β-actin抗体（Abcam）；XIAP抗体、PCNA抗体、N-cadherin抗体、Vimentin抗体（CST）；二抗山羊抗鼠、山羊抗兔（LI-COR）。药物干预细胞后，弃上清，用PBS清洗2遍，加入100 μL含蛋白酶抑制剂的裂解液，置于冰上裂解30 min，然后离心保留上清。将各组样品进行定量，按照60 μg配置上样体系，置于金属浴100 ℃变性，然后放于-80 ℃冰箱保存。配置10% 分离胶，将样品加入泳道，在浓缩胶中以40 V电压进行浓缩，在分离胶中视情况梯度加压至80~100 V，用半干转仪按每块胶1.5 mA、25 min的条件进行转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，然后加入按1∶1000稀释的一抗溶液，于4 ℃冰箱孵育过夜。第2天弃去一抗，洗膜3次，每次10 min，加入1∶10 000稀释的荧光二抗，避光孵育2 h，弃二抗后，洗膜3次，每次10 min。最后在多功能荧光成像仪进行扫膜，并用Image Studio软件分析信号值。

1.10 裸鼠移植瘤模型建立及观察

BALB/c-nu裸鼠在恒温恒湿的SPF级动物实验中心适应性喂养1周后，将培养好的5-8F细胞按5×10⁶/只接种于右前肢背部皮下，待肿瘤隆起于皮肤且直径达到0.5 cm则模型建立成功。待肿瘤直径达到1 cm，随机分为对照（Control）组，益气解毒方（YQ，15.357 g·kg^-1·d^-1）组，5-氟尿嘧啶（5-Fu，8 mg·kg^-1·d^-1）组，每组10只裸鼠，5-Fu组每2 d腹腔注射1次，其余组灌胃给药1次/d，总共给药18 d。停药后以吸入过量麻醉药的方式处死裸鼠，并检测肿瘤组织中各蛋白表达情况。剂量换算方法按等效剂量系数折算法换算：裸鼠剂量=W×成人剂量（g/kg），W=12.5，益气解毒方全方共计86 g，成人体质量按70 kg计算。

1.11 统计学分析

本研究实验均独立重复至少3次，所有数据用SPSS22.0软件进行分析，计量资料服从正态分布，单因素设计，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐采用LSD检验，方差不齐则采用Games Howell检验。计量资料不服从正态分布则采用秩和检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 益气解毒方抑制鼻咽癌细胞的增殖

与溶剂对照组比较，益气解毒方和顺铂均可以抑制鼻咽癌细胞的增殖（P<0.01），并且随着浓度的增加、作用时间的延长，益气解毒方抑制增殖的效果增强（图1）。

2.2 益气解毒方对鼻咽癌AKT1/GLUT1信号通路的影响

2.2.1 益气解毒方活性成分与AKT1分子对接结果

分子对接结果显示，“槲皮素”、“木犀草素”、“山奈酚”、“柚皮素”与AKT1均具有良好的结合位点，其最低结合能分别是-8.4、-8.0、-7.3、-7.0 kcal/mol（图2）。

2.2.2 益气解毒方对鼻咽癌细胞AKT1/GLUT1信号通路关键蛋白表达的影响

不同浓度的益气解毒方作用于5-8F、6-10B 36 h后，AKT1、ρ-AKT1、GLUT1的蛋白表达水平呈不同程度的下调，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01），且高浓度组差异更明显（P<0.01，图3、4）。

2.2.3 益气解毒方对鼻咽癌移植瘤组织AKT1/GLUT1信号通路关键蛋白表达的影响

皮下移植瘤实验结果显示，益气解毒方干预后，肿瘤体积变小（图5），AKT1、ρ-AKT1、GLUT1的蛋白表达水平呈不同程度的下调（图6），差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。

2.3 激活AKT1/GLUT1信号通路对益气解毒方抑制鼻咽癌效应的影响

2.3.1 激活AKT1/GLUT1信号通路对益气解毒方下调p-AKT1、GLUT1蛋白效应的影响

与溶剂对照组相比，益气解毒方组（YQ）p-AKT1、GLUT1表达下调，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）；与YQ组比较，YQ+SC79组p-AKT1表达上调（P<0.05），YQ+AS1949490组GLUT1表达上调（P<0.05，图7、8）。

2.3.2 激活AKT1/GLUT1信号通路对益气解毒方抑制鼻咽癌细胞增殖效应的影响

与溶剂对照组相比，益气解毒方组细胞增殖显著降低（P<0.05），而益气解毒方联用AKT1激活剂后细胞增殖回升（图9）。在GLUT1调控实验中，GLUT1激活剂联用益气解毒方组较单药组的细胞增殖速率亦显著提高（P<0.05），而GLUT1抑制剂联用组则呈现协同抑制作用（图10）。

2.3.3 激活AKT1/GLUT1信号通路对益气解毒方抑制鼻咽癌细胞迁移效应的影响

与溶剂对照组相比，益气解毒方或GLUT1抑制剂组显著抑制鼻咽癌细胞迁移（P<0.05）；而与AKT1激活剂（图11）或GLUT1激活剂（图12）联用后，益气解毒方抑制迁移的效应被部分逆转（P<0.05）。

2.3.4 激活AKT1/GLUT1信号通路对益气解毒方抑制鼻咽癌细胞侵袭效应的影响

与溶剂对照组相比，GLUT1抑制剂或益气解毒方单用均显著降低侵袭细胞数（P<0.05），且二者联用协同作用最强；与益气解毒方组相比，AKT1激活剂或GLUT1激活剂与益气解毒方联用组穿膜细胞数量增加（图13、14），差异有统计学意义（P<0.05）。

2.3.5 激活AKT1/GLUT1信号通路对鼻咽癌细胞增殖、EMT相关蛋白表达的影响

与溶剂对照组相比，单用益气解毒方组增殖、侵袭转移相关蛋白XIAP、N-cadherin、Vimentin的表达下调，差异均有统计学意义（P<0.05）。与溶剂对照组相比，AKT1激活剂组与上述效应相反。与单用益气解毒方组相比，AKT1激活剂与益气解毒方联用组XIAP、N-cadherin、Vimentin蛋白表达上调（图15），差异有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

鼻咽癌在我国南方地区高发，其复发和转移是目前临床上亟待解决的难题^［21］。AKT1/GLUT1信号通路在肿瘤细胞糖代谢重编程过程中扮演关键角色，其通过调控葡萄糖摄取、糖酵解通量及代谢适应性，直接促进肿瘤细胞的增殖、存活和转移^［22-25］。AKT1是PI3K/AKT/mTOR信号通路的核心激酶，其激活后通过磷酸化HIF-1α、c-MYC等转录因子直接上调GLUT1基因表达^{［7-9， 26］}；同时促进GLUT1向细胞膜转运，增强葡萄糖摄取能力，从而支持癌细胞的快速增殖和转移表型^{［7， 23， 25］}。本研究基于AKT1/GLUT1信号通路，研究了益气解毒方抑制鼻咽癌细胞增殖、迁移及侵袭的作用及机制。本研究首先通过分子对接技术发现益气解毒方的活性成分与AKT1具有较高的结合亲和力，提示其可能通过直接干预AKT1的磷酸化状态调控下游信号。实验结果进一步证实，益气解毒方可显著抑制体内外鼻咽癌细胞AKT1的激活（p-AKT水平下降），并伴随GLUT1表达的下调，提示该方能有效抑制AKT1/GLUT1信号通路的活化。后续为进一步验证了该通路在药效中的核心地位，将AKT1或GLUT1激活剂与益气解毒方联用，发现益气解毒方对增殖、迁移及侵袭的抑制作用被激活剂部分逆转，提示益气解毒方可能通过AKT1/GLUT1信号通路发挥抗鼻咽癌的作用。

此外，益气解毒方可显著下调上皮间质转化（EMT）标志物（N-cadherin、Vimentin）、凋亡抑制蛋白XIAP及增殖相关蛋白PCNA的表达。这一现象提示，其抗侵袭作用可能与EMT过程密切相关。N-cadherin和Vimentin作为EMT的关键驱动因子^{［27， 28］}，其表达受PI3K/AKT等多条通路调控^{［29， 30］}，而本研究中AKT1活性的抑制可能通过干扰这些下游信号网络，阻遏EMT进程。XIAP作为凋亡抑制蛋白家族成员，其下调可能削弱癌细胞对凋亡信号的抵抗。鉴于前期课题组已证实益气解毒方可诱导鼻咽癌细胞凋亡^{［17， 31］}，因此本研究中未重复检测其它凋亡相关指标。值得关注的是，益气解毒方联用AKT1激活剂后，XIAP、 N-cadherin、PCNA及Vimentin的表达回升且鼻咽癌细胞恶性表型增强，提示XIAP、 N-cadherin、PCNA及Vimentin可能作为AKT1/GLUT1通路的下游效应分子，介导鼻咽癌细胞存活与侵袭的耦合机制。此外，课题组前期研究已表明益气解毒方还可通过 Wnt/β-catenin 通路诱导凋亡，并通过 MAPK/ERK 通路抑制增殖^{［17， 19］}。结合本研究结果，我们推测益气解毒方可能通过协同调控 AKT1/GLUT1、Wnt/β-catenin 和 MAPK/ERK 等多条信号通路，实现对其“多靶点、多通路”抗肿瘤机制的整合作用。

综上，本研究揭示了益气解毒方抑制鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制与靶向AKT1/GLUT1信号通路有关，其作用可涵盖代谢调控、EMT抑制及凋亡促进等多重环节，该研究有利于从代谢重编程角度阐释益气解毒法的现代生物学内涵，为益气解毒方的临床应用奠定了实验基础。然而，该方是否可通过调控其他下游效应分子协同发挥作用及药物对鼻咽癌糖代谢特征的具体影响在后续研究中仍需进一步探索。

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基金资助

国家自然科学基金(82104941)

国家自然科学基金(82305329)

湖南省科技创新计划资助项目(2024RC3202)

湖南省自然科学基金(2023JJ30449)

湖南省卫生健康科研课题(20254150)

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